Extracto
A pesar de los notables avances en la terapia y la prevención del cáncer de próstata sigue siendo la segunda causa de muerte por cáncer en los países industrializados. Muchas terapias inicialmente demostrado ser beneficioso para los pacientes fueron abandonados debido a la alta resistencia a los medicamentos y la tasa de evolución de los tumores. Uno de los agentes terapéuticos potenciales, incluso utilizados en los ensayos clínicos de la primera etapa, 1,25-hidroxivitamina D3, ha demostrado ser ya sea impredecible o ineficiente en muchos casos. Ya hemos demostrado que canal TRPV6 calcio, que es el objetivo directo de la 1,25-dihidroxivitamina D3 receptor, controla positivamente la proliferación del cáncer de próstata y la resistencia a la apoptosis (
Lehen'kyi et al.
, Oncogene, 2007). Sin embargo, cómo los conocidos 1,25-hidroxivitamina D3 efectos antiproliferativos pueden ser compatibles con la regulación al alza de canal TRPV6 pro-oncogénica sigue siendo un misterio. Aquí demostramos que en bajas condiciones de esteroides 1,25-dihidroxivitamina D3 regula al alza la expresión de TRPV6, mejora la la proliferación mediante el aumento del número de células que entran en la fase S. Se demuestra que estos efectos pro-proliferativos de 1,25-dihidroxivitamina D3 están mediados directamente a través de la sobreexpresión de canal TRPV6 que aumenta la absorción de calcio en las células LNCaP. La resistencia a la apoptosis de las células LNCaP dependientes de andrógenos conferidos por canal TRPV6 se invierte drásticamente cuando la 1,25-dihidroxivitamina D3 efectos se combinaron con la exitosa knockdown TRPV6. Además, el uso de líneas celulares de LNCaP C4-2 con deficiencia de andrógenos DU-145 y andrógenos insensible permitido a sugerir que la capacidad de la 1,25-dihidroxivitamina D3 para inducir la expresión de canal TRPV6 es un determinante crucial del éxito o fracaso de las terapias basadas en 1,25-dihidroxivitamina D3
Visto:. Lehen'kyi V, Raphaël M, Oulidi A, Flourakis M, S Khalimonchyk, Kondratskyi A, et al. (2011) TRPV6 determina el efecto de la vitamina D3 sobre el crecimiento celular del cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (2): e16856. doi: 10.1371 /journal.pone.0016856
Editor: Janine Santos, Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Septiembre, 2010; Aceptado 16 de enero de 2011; Publicado: 11 Febrero 2011
Derechos de Autor © 2011 Lehen'kyi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Ministère de l'Education Nationale et Ligue Nationale Contre le Cancer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata sigue siendo la malignidad humana no cutáneo más común y el segundo tumor más letal entre los hombres con la incidencia más alta en los países industrializados [1]. El receptor de andrógenos y otros esteroides regulan aspectos vitales de crecimiento celular de la próstata y la función incluyendo la proliferación, diferenciación, apoptosis, metabolismo de los lípidos, y la acción de secreción [2]. supresión de andrógenos ha sido el tratamiento líder y actualmente el más exitoso [3]. Sin embargo, los carcinomas de próstata eventualmente convertirse en andrógeno-insensible, y el cáncer es refractario a la terapia hormonal -. La razón más importante para la mortalidad por cáncer de próstata [4]
Los diferentes receptores nucleares han sido blanco de la terapia y entre ellos 1, 25-dihidroxivitamina D3 que ejerce una multitud de actividades antitumorales contra las células y xenoinjertos de cáncer de próstata en cultivo [5]. células epiteliales prostáticas normales y malignas expresan receptor de la vitamina D3 (VDR), y la activación de VDR por la 1,25-dihidroxivitamina D3 generalmente resulta en la inhibición de la proliferación y la detención del ciclo celular [6]. Sin embargo, para prevenir o tratar el cáncer de próstata, las interacciones de otros receptores nucleares y vía de señalización deben ser considerados [7].
La función de los canales iónicos se ha discutido en relación con la proliferación y la apoptosis. Más recientemente, tienda operado Ca
2 + canales y el Ca
2 + piscina en el retículo endoplasmático también han sido relacionados con el desarrollo del cáncer de próstata [8]. La proliferación de las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y PC3 se inhibió por TH-1177, una sustancia que bloquea Ca
2 + entrada [9]. Las alteraciones en Ca
2 + piscina y citosólica de Ca
2 + no sólo se han descrito para aumentar la proliferación y sarcoendoplasmatic Ca
2 + -ATPasa (SERCA) expresión en células LNCaP [10], sino también para inducir apoptosis [11]. Por lo tanto, Ca
2 + homeostasis está implicado críticamente en el desarrollo y progresión del cáncer.
Nuestra atención ha sido elaborado por la observación de que un potencial receptor transitorio altamente Ca miembro
2 + canal selectivo subfamilia V 6, TRPV6 se expresa fuertemente en el cáncer de próstata avanzado y se correlaciona significativamente con el Gleason & gt; 7 de clasificación que representa un fuerte marcador de la progresión tumoral y la posterior invasión en los tejidos sanos [12], [13]. Hemos demostrado previamente que las formas TRPV6 altamente calcio canales selectivos en células de la próstata, cuya amplitud y el comportamiento actual de inactivación están estrechamente regulada por la concentración intracelular de calcio [10], [14]. Además ya hemos demostrado que canal TRPV6 está involucrado en el control de la proliferación del cáncer de próstata y la resistencia a la apoptosis [15]. Sin embargo, el papel preciso de TRPV6 en la fisiopatología de próstata sigue siendo ilusoria, y su regulación por andrógenos - contradictive [16]. Por otra parte, VDR ser un activador directo de la
TRPV6
promotor [17], y 1,25-hidroxivitamina D3 un tratamiento contra el cáncer ampliamente utilizado han completado una hipótesis intrigante para la regulación TRPV6 e importancia en el cáncer de próstata. Nuestros estudios se basaron en el hecho de que la 1,25-dihidroxivitamina D3, ya utilizado en la primera etapa de los ensayos clínicos ha demostrado ser ya sea impredecible o ineficaz en muchos casos, y el hecho de que TRPV6 que controla positivamente la proliferación del cáncer de próstata y la apoptosis resistencia [15] es un objetivo directo de 1,25-hidroxivitamina D3 [17]. La cuestión de cómo los conocidos 1,25-hidroxivitamina D3 efectos antiproliferativos pueden ser compatibles con la regulación al alza de canal TRPV6 pro-oncogénica era el objetivo de nuestro estudio.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
LNCaP humano (cáncer de nódulos linfáticos de la próstata), LNCaP C4-2, y DU-145 líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en medio RPMI (Gibco-BRL, CergyPontoise, Francia ) suplementado con suero de 10 o 2% de ternera fetal (FCS) y que contiene kanamicina (100 mg /ml) y L-glutamina (2 mM). Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2 en el aire. El medio se cambió tres veces por semana y los cultivos se dividieron por el tratamiento de las células con 0,25% de tripsina (en PBS) durante 5 min a 37 ° C antes de llegar a la confluencia. Para los experimentos, las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos para PCR y Western Blot-y en cubreobjetos de vidrio para inmunocitoquímica y de imágenes de calcio. Para la 1,25-dihidroxivitamina D3 células estudios fueron tratados con EtOH como un control para la 1,25-dihidroxivitamina D3. Se añadió carbón de leña de rayas de suero de ternera fetal (2%) al fenol medio RPMI libre de rojo, junto con kanamicina y L-glutamina como anteriormente para incubar las células para crear condiciones de esteroides privados.
RT- PCR
el ARN total fue aislado utilizando el tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo procedimiento de extracción. Después de DNasa I (Life Technologies) de tratamiento para eliminar el ADN genómico, 2 g de ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc a 42 ° C utilizando cebadores hexámeros al azar (Perkin Elmer) y MuLV transcriptasa inversa (Perkin Elmer) en un 40 l de volumen final, seguido por PCR en tiempo real cuantitativa.
cuantitativo PCR en tiempo real
cuantitativo PCR en tiempo real de TRPV6 y transcripciones de ARNm HPRT se realizó utilizando MESA VERDE qPCR Mastermix Plus para SYBR Ensayo (Eurogentec, Francia ) en el sistema de detección de PCR en tiempo real Biorad CFX96. Las secuencias de cebadores se indican en la Tabla 1. El gen HPRT se utilizó como control endógeno para normalizar las variaciones en las extracciones de ARN, el grado de la degradación del ARN, y la variabilidad en la eficiencia de RT. Para cuantificar los resultados se utilizó el método comparativa ciclo umbral ΔΔC (t) guía empresas
-Western Blot
células LNCaP semiconfluente fueron tratados con un tampón de lisis enfriado con hielo que contenía:. 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl 10 mM, PMSF 1 mM, 1% Nonidet P-40, y cóctel inhibidor de la proteasa de Sigma. Los lisados se centrifugaron 15.000 × g a 4 ° C durante 20 minutos, se mezcla con un tampón de muestra que contiene: 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 4% de SDS, 5% β-mercaptoetanol, 20% de glicerol, 0,01% de azul de bromofenol, y hervido durante 5 min a 95 ° C. muestras de proteínas totales se sometieron a 8, 10, y 15% de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa por semi-secos Western Blot (Bio-Rad Laboratories). La membrana se bloqueó en un 5% de leche que contiene tampón TNT (Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 140 mM, y Tween 20 0,05%) durante la noche a continuación, sondeó utilizando anticuerpo anti TRPV6 específico policlonal rabit (Alomone Labs Ltd., 1/200) , anti-PCNA (Santa-Cruz, 1/1000), anti-β-actina (Lab Vision Co., 1/1000) anticuerpos. Las bandas en la membrana se visualizaron utilizando el método de quimioluminiscencia (Pierce Biotecnología Inc). El análisis densitométrico se realizó con un sistema de adquisición de imagen Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories).
inmunocitoquímica
Las células cultivadas en los cubreobjetos de vidrio se lavaron una vez con PBS y, en su caso, se incubaron con toxina del cólera subunidad B Alexa Fluor® 488 conjugado (Molecular Probes, 1/2000) durante 15 min, después se lavaron una vez con PBS y se fijaron en 3,5% de paraformaldehído en PBS. PBS-glicina (30 mM) se utilizó para detener la reacción con la permeabilización posterior con 0,1% Triton X-100. Las células se lavaron de nuevo en PBS y se sometieron a inmunotinción procedimiento convencional. Alexa Fluor® 546 IgG de cabra anti-conejo (Molecular Probes, 1/4000) fue utilizado como anticuerpo secundario para la tinción TRPV6. análisis de fluorescencia se llevó a cabo usando Carl Zeiss Laser Scanning Systems LSM 510 conectado a un Zeiss Axiovert 200 M con 63 × 1,4 lente de inmersión en aceite de apertura numérica a temperatura ambiente. Ambos canales estaban emocionados, recogen por separado y luego se fusionaron utilizando el software Carl Zeiss LSM Examinador de imagen.
La proliferación celular
La proliferación celular se midió utilizando el CellTiter 96 Aqueous One Solution ensayo de proliferación celular (Promega, Madison , WI), sobre la base de la conversión celular del reactivo colorimétrico MTS [3,4- (5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio sal] en formazán soluble mediante enzimas deshidrogenasa encuentra sólo en las células proliferantes, metabólicamente activas. Después de cada tratamiento, se añadieron 20 l de solución de colorante en cada placa de pocillos en 96 pocillos y se incubaron durante 2 h. Posteriormente, la absorbancia se registró a 490 nm de longitud de onda usando un lector de placas ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Tasa de inhibición de la proliferación celular se calcula como: (
A
control-
A
sample)/(
A
control-
A
blank)×100%.
Cell ciclo y la apoptosis ensayos
citometría de flujo ensayos se realizaron en poblaciones de células cultivadas por triplicado de 25 cm
2 frascos como se había descrito [18]. Aproximadamente 10
6 células fueron fijadas con 1 ml de hielo frío metanol al 70% durante 30 min. Después de la fijación, las células se sedimentaron por centrifugación para eliminar los fijadores, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 ° C, se resuspendieron en 100 l de PBS, se trató con 100 l de RNAsa A (1 mg /ml, Sigma), y se tiñeron con yoduro de propidio (PI, Sigma) a una concentración final de 50 mg /ml. Las células teñidas se almacenaron a 4 ° C en la oscuridad y se analizaron dentro de 2 h. Las muestras teñidas se midieron en un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Los datos fueron adquiridos para 7000 eventos con un coeficiente de variación de menos del 5%, y la fluorescencia roja se midió usando un detector de fluorescencia 3 (FL3) en el
X
eje x. Los datos fueron almacenados y analizados mediante el software CellQuest para evaluar los patrones de distribución del ciclo celular (subG1 (apoptosis), G0 /G1, S y G2 /M).
Imagen de calcio
Las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio y se cargaron con 4 M Fura-2 a.m. a temperatura ambiente durante 45 min en el medio de crecimiento. Los registros se realizaron en HBSS que contiene (en mM): 140 NaCl, 5 KCl, 2 MgCl
2, 0,3 Na
2HPO
3, 0.4 KH
2 PO
4, 4 NaHCO
3, 5 glucosa y 10 HEPES ajustado a pH 7,4 con NaOH. CaCl
2 se ajustó a 0,07 mM o 1,8 mM dependiendo del experimento. Los cubreobjetos se colocaron después en una cámara de perfusión en la platina del microscopio. Las imágenes de fluorescencia de las células se registraron con un sistema de análisis de imagen de vídeo (Quanticell). La fluorescencia Fura-2, en la longitud de onda de emisión de 510 nm, se registró excitando la sonda alternativamente a 340 y 380 nm. La relación señal a 340/380 nm se convierte en [Ca
2 +]
I Nivel utilizando un
in vitro
calibración.
siRNA transfección celular
células LNCaP fueron transfectadas durante la noche con 200 nM de ARNsi-TRPV6 1 y 2 por pocillo de una placa de seis pocillos usando "gene Porter 2" (gene Therapy Systems, Inc.) en un volumen final de 1 ml. Listos para el uso de siRNA-TRPV6s (opción de proceso: A4) fueron sintetizados por Dharmacon Research Inc (Lafayette, EE.UU.) (véase la Tabla 1)
Reactivos
Todos los reactivos fueron adquiridos de Sigma. (Sigma, L'Isle d'Abeau Chesnes, Francia) a menos que se especifique lo contrario.
Estadísticas
Los datos se expresaron como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando desapareado
de la t de Student
-pruebas. * - P & lt; 0,05 o ** - P & lt; 0,01 indican significación estadística
Resultados
El efecto de la 1,25-dihidroxivitamina D3 sobre la proliferación de células de cáncer de próstata se ha estudiado en dos condiciones experimentales. : 2% y 10% de suero de ternera fetal (FCS) -supplemented medio RPMI. El crecimiento de la línea celular LNCaP andrógeno-dependientes fue sorprendentemente aumentó en un 100 nM 1,25-hidroxivitamina D3 en 2% FCS suplementado y suprimida en FCS al 10% (fig. 1A). Ya hemos demostrado el papel de canal de TRPV6 en la proliferación de células de cáncer de próstata [15], y por lo tanto tratamos de investigar la regulación de la expresión de los canales TRPV6 por 1,25-hidroxivitamina D3. Puesto que se ha demostrado que
TRPV6
es un VDR-regulada de genes [17], hemos estudiado la regulación de la expresión TRPV6 por 1,25-hidroxivitamina D3 en células LNCaP en diferentes contenidos de esteroides de los medios de comunicación (figura . 1B, C). Aparece 1,25-hidroxivitamina D3 para activar directamente el
TRPV6
gen en las células LNCaP, aunque en medio con FCS al 10% de sus efectos no eran tan significativa (fig. 1B) que en FCS al 2% (Fig. 1C) . 1,25-dihidroxivitamina D3 dependiente de la dosis de manera significativa el aumento de expresión de ARNm en TRPV6 2% de FCS que contiene medio RPMI (Fig. 1C). Para comprobar si los efectos disminuidos de 1,25-dihidroxivitamina D3 fueron debido al contenido de FCS y no a la vez un efecto óptimo se realizó la curva de tiempo usando la concentración máxima de 100 nM durante tres días a diferentes intervalos de tiempo (Fig. 1D). Para confirmar la inducción significativa de proteínas TRPV6 por 1,25-dihidroxivitamina D3 en el 2% de FCS que contenía medio RPMI obtenido por PCR en tiempo real cuantitativa se realizó una transferencia de Western. Se mostró un aumento considerable en el nivel de proteína TRPV6 tras la activación con 100 nM de 1,25-dihidroxivitamina D3 (Fig. 1E). La inmunocitoquímica utilizando anticuerpos específicos TRPV6 mostró la expresión de los canales TRPV6 en células LNCaP (Fig. 1F), así como su localización en la membrana de plasma usando toxina del cólera (CTX) conjugado con FITC etiquetado específicamente lípidos G2M en la membrana. Por lo tanto, los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 en el crecimiento de las células LNCaP dependientes de andrógenos dependen del contenido de esteroides relativa. Además, 1,25-hidroxivitamina D3 aumenta significativamente la expresión del canal de TRPV6 en condiciones de poca esteroides.
A, 1,25-dihidroxivitamina D3 efectos sobre la tasa de proliferación medido por el ensayo de MTS de células LNCaP incubadas ya sea con 2 % o 10% de medio RPMI, * que contiene FCS-- P & lt; 0,05, ** - P & lt; 0,01, en comparación con sus respectivos controles (DMSO), n = 3. B, La regulación al alza de la expresión de mRNA por TRPV6 1,25- dihidroxivitamina D3 en células LNCaP cultivadas en 10% de FCS que contienen medio RPMI; * - P & lt; 0,05, en comparación con el control (DMSO), n = 3. C, La regulación al alza de la expresión de mRNA por TRPV6 1,25-dihidroxivitamina D3 en células LNCaP cultivadas en FCS al 2% que contiene medio RPMI; * - P & lt; 0,05, ** - P & lt; 0,01, en comparación con el control (DMSO), n = 3. D, La dependencia del tiempo de la expresión TRPV6 bajo 100 M 1,25-dihidroxivitamina tratamiento D3 en células LNCaP incubadas en 10 % medio RPMI que contenía FCS. * - P & lt; 0,05, ** - P & lt; 0,01, en comparación con el control (DMSO), n = 3. E, una transferencia de Western de los niveles de proteína TRPV6 inducidos por 1,25-dihidroxivitamina tratamiento D3 durante 3 días en las células LNCaP se incubaron en medio RPMI que contenía FCS al 2%. F, A microscopía confocal que muestra el patrón de expresión de la proteína TRPV6 y la localización en la membrana plasmática de las células LNCaP cultivadas en medio RPMI que contenía FCS al 2%. La toxina del cólera conjugado con FITC (CTX, verde) que se utiliza para teñir la membrana plasmática, así como el canal TRPV6 (TRPV6, rojo), y su respectiva fusión (CTX + TRPV6) se muestran.
TRPV6 se proliferación de células LNCaP
involucrados in1,25-dihidroxivitamina D3 inducida Según los datos obtenidos por encima de los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 en 2% de FCS se estudiaron más. Como ya hemos demostrado el papel de canal de TRPV6 en la proliferación de células de cáncer de próstata [15], y sabiendo que no hay ninguna compuesto químico disponible hasta el momento para bloquear selectivamente TRPV6, se utilizó el enfoque de siRNA desmontables selectivamente TRPV6. Se emplearon tres enfoques metodológicos diferentes para evaluar la proliferación de células LNCaP en 2% de FCS que contienen medio (Fig. 2A-C). El número de células proliferantes viables se midió por el ensayo de MTS. siRNA-TRPV6 disminuyó significativamente el número de células en proliferación de días 2-4 después de la transfección (D0) (Fig. 2A). 100 nM-dihidroxivitamina D3 1,25 fue capaz de aumentar la proliferación de células LNCaP mientras que TRPV6 caída invierte este estímulo al nivel aún más bajo que en el control. siRNA contra el receptor de andrógenos (AR), conocido por ser crucial para el crecimiento de la próstata y el desarrollo, se utilizó como control positivo para lograr efectos fuertes y fiables sobre la viabilidad celular de próstata.
A, las células LNCaP proliferación en 2% de FCS -Con medio RPMI tratados con 1,25-dihidroxivitamina D3 (100 nM, aplicado a D1), ARNsi-TRPV6 (siTRPV6, 80 nM, transfectadas en D0), el tratamiento combinado de 1,25-dihidroxivitamina D3 y siTRPV6 especificado anteriormente, y siRNA-AR (SIAR, 80 nM, transfectadas en D0) como control positivo. * - P & lt; 0,05, ** - P & lt; 0,01, en comparación con el control, n = 4; B, un ensayo de ciclo celular de las células LNCaP (incubó con 2% de FCS que contiene RPMI medio) para las mismas condiciones que en el ensayo MTS (A) (D3 es igual a 100 nM 1,25-dihidroxivitamina D3), llevado a cabo por citometría de flujo de las células se tiñeron con yoduro de propidio. * - P & lt; 0,05, ** - P & lt; 0,01, § - P & lt; 0,05 frente a la vitamina D3; n = 3. C, una transferencia de Western de antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) en las condiciones indicadas anteriormente, en comparación con beta-actina. D, un ensayo de apoptosis llevada a cabo por citometría de flujo como una población subG1 de células LNCaP cultivadas en FCS al 2% que contiene medio RPMI teñidas con yoduro de propidio. * - P & lt; 0,01 frente a control; n = 3.
A de ensayo del ciclo celular mediante la tinción de yoduro de propidio se realizó para precisa los efectos de la caída TRPV6 así como la 1,25-dihidroxivitamina D3 efectos y el papel de TRPV6 en el mismo, en el ciclo celular distribución de fase de células LNCaP cultivadas en FCS al 2% que contiene medio RPMI (Fig. 2B). De hecho, se confirmó que siRNA-TRPV6 disminuyó el número de células entrado en la fase S. El porcentaje de las células entraron en la fase S fue significativamente mayor en las células tratadas 100 nM 1,25-dihidroxivitamina D3 que en control. Pretransfection de células LNCaP con siRNA-TRPV6 atenuada-dihidroxivitamina D3 1,25 aumento de la proliferación, aunque no con todo el rigor. siRNA-AR como anteriormente se utilizó como control positivo y mostró una disminución considerable en% de las células entraron en la fase S.
También supervisó un nivel de proteína de antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), utilizando el mismas condiciones. PCNA parecía ser significativamente disminuido en siRNA desmontables-TRPV6. las células tratadas con 1,25-dihidroxivitamina D3 expresaron 2 veces menos PCNA como también se observó por el tratamiento combinado de siRNA-TRPV6 y 100 nM 1,25-dihidroxivitamina D3. El nivel de PCNA en células tratadas con siRNA-AR fue indetectable (Fig. 2C).
Un ensayo de ciclo celular que también permite la medición de un número de células apoptóticas como se empleó una población subG1. 100 nM de 1,25-dihidroxivitamina D3 no tenía ninguna influencia sobre la apoptosis en sí, mientras que siRNA-TRPV6 tuvo efecto significativo sobre la tasa de apoptosis (Fig. 2D). Sin embargo, la combinación del tratamiento de 100 nM 1,25-dihidroxivitamina D3 con la transfección de ARNsi-TRPV6 aumentó significativamente el número de células apoptóticas mucho más que el tratamiento previo siRNA-TRPV6 solo (Fig. 2D). Por lo tanto, TRPV6 está implicada en la proliferación y la apoptosis resistencia de las células LNCaP y los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 son fuertemente dependientes de la expresión TRPV6.
TRPV6 media la Ca inducida por la 1,25-dihidroxivitamina D3
2 + -absorción en las células LNCaP
con el fin de estudiar la contribución de TRPV6 como altamente Ca
2 + canal selectivo de Ca
2 + -absorción en las células LNCaP, que mide intracelular los niveles de calcio ([Ca
2 +]
i) en las células LNCaP cultivadas en FCS al 2% que contenían medio RPMI después consiguientes cambios en los niveles extracelulares de calcio ([Ca
2 +]
O). En las células de control tratadas con EtOH (CTRL) la variación de la [Ca
2 +]
O producido cambios significativos en la [Ca
2 +]
i (Fig. 3A). siRNA desmontables-TRPV6 disminuye la amplitud de 2 mm [Ca
2 +]
O-evocado aumento de la [Ca
2 +]
i (Fig. 3A y C). 100 nM-dihidroxivitamina D3 1,25 aumentó por sí mismo basal de [Ca
2 +]
i significativamente así como una mayor [Ca
2 +]
i respuesta en la aplicación de 2 mM [Ca
2 +]
O que fue completamente revertido por el tratamiento previo con siRNA-TRPV6 (Fig. 3C). Estos datos indican que TRPV6 media constitutivamente Ca
2 + -absorción en las células LNCaP y TRPV6 también da cuenta de la 1,25-dihidroxivitamina D3 mediada por el aumento de Ca
2 + -absorción
.
A, TRPV6 participación en Ca
2 + captación en las células LNCaP cultivadas en medio RPMI que contenía FCS al 2% y tratadas ya sea con STIC (CTRL) o siRNA-TRPV6 (ambos 80 nM, 24 horas). B, Ca
2 + captación en las células LNCaP cultivadas en medio RPMI que contenía FCS al 2% y en 1,25-hidroxivitamina D3 (100 nM, 3 días) tratados ya sea con sict (CTRL) o siRNA-TRPV6 (ambos 80 nM, 24 horas). C, que muestra un histograma correspondiente relativo [Ca
2 +]
niveles I después consecuente [Ca
2 +]
o interruptores en las condiciones como se ha indicado anteriormente. * - P & lt; 0,05 (en comparación con el control); ** - P & lt; 0,01, n = 140.
Los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 en diferentes líneas de células independientes de andrógenos
Dos líneas de células independientes de andrógenos fueron diferentes utilizados: un líneas celulares LNCaP C4-2 andrógenos insensible a los receptores de andrógenos deficientes DU-145 y. Las células se cultivaron en las mismas condiciones de FCS suplementado medio RPMI 2 o 10% y los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 fueron estudiados (Fig. 4). Los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 sobre los receptores de andrógenos línea de células DU-145 deficientes eran propensos a ser suero dependiente ya que en el 2% de FCS los efectos proproliferative de 1,25-hidroxivitamina D3 se conservaron (figura 4A), mientras que en 10 % de FCS sus efectos fueron abolidos (Fig. 4B). La otra línea de células insensibles a los esteroides, pero todavía expresan el receptor de andrógenos, se utilizó LNCaP C4-2, donde se muestran los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 sea FCS-independiente y 100 nM-dihidroxivitamina D3 1,25 ejerció su fuertes efectos anti-proliferativos (Fig. 4C-D). Una PCR en tiempo real cuantitativa se realizó muestra la regulación de la expresión TRPV6 en células DU-145 por 100 M 1,25-dihidroxivitamina D3 en tanto FCS que contiene el medio 2 y 10% (Fig. 4E). condiciones de esteroides privados en el caso de las células LNCaP (LNCaP-ST) también se utilizaron para confirmar que la inducción de la expresión TRPV6 depende en gran medida el contenido de esteroides del medio de cultivo (Fig. 4F). Así, los efectos pro-proliferativos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 en el crecimiento de células de CaP se determinan por su capacidad para inducir la expresión de canal TRPV6 y su inducción parece estar fuertemente dependiente de esteroides.
A, B, Los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 en la línea de células DU-145 receptor con deficiencia de andrógenos, tanto en 2 y 10% de FCS que contiene medio RPMI (a y B, respectivamente), * - P & lt; 0,05 (en comparación con el control ), n = 3. C, D, Los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 en la línea celular LNCaP C4-2 andrógeno-insensible, tanto en medio RPMI que contenía FCS 2 y el 10% (C y D, respectivamente), * - P & lt; 0,05 (en comparación con el control), n = 3. e, los niveles de expresión relativos de canal TRPV6 en células DU-145 tratadas con 100 mM de 1,25-dihidroxivitamina D3 durante 3 días en 2 y 10% de FCS que contiene RPMI medio, * - P & lt; 0,05 (en comparación con el control), n = 3. F, la expresión de canal TRPV6 inducida por 100 nM de 1,25-dihidroxivitamina D3 durante 3 días en células LNCaP en un medio RPMI-esteroide privado (LNCaP- ST), n = 3.
Discusión
Uno de los hallazgos más importantes de este trabajo es que la 1,25-hidroxivitamina D3 puede aumentar la proliferación de células LNCaP. Hemos demostrado claramente que tanto la tasa de proliferación y el número de las células que entran en la fase S se incrementan en 1,25-dihidroxivitamina D3 de tratamiento. Estos efectos dependen enteramente de la expresión y función de canal TRPV6 que se ha demostrado previamente para estar implicado en el crecimiento del cáncer de próstata y la apoptosis resistencia [15]. Una cifra reportada previamente de 1,25-hidroxivitamina D3 actividad antiproliferativa en el cáncer de próstata puede verse comprometida por la regulación positiva TRPV6.
Una serie de obras ya ha publicado la inducción TRPV6 por 1,25-hidroxivitamina D3 en el intestino [19], riñón [20], el canal semicircular [21], y las células de cáncer de próstata, incluso [22]. VDR cinco elementos de respuesta fueron encontrados en el gen humano que codifica el canal de calcio TRPV6 epitelial sugiere su regulación directa de 1,25-hidroxivitamina D3 a través de su receptor putativo [17]. Hemos confirmado en nuestro modelo de células que la expresión de TRPV6 es upregulated directamente por la 1,25-dihidroxivitamina D3 en la moda de la dosis y dependiente del tiempo. Nuestros resultados sugieren que la naturaleza de este upregulation es dependiente de esteroides ya que en condiciones de esteroides privados se supriman los efectos de D3 25-dihidroxivitamina. Este hallazgo es consistente con los datos de que las actividades de la 1,25-dihidroxivitamina D3 en células LNCaP son dependientes de esteroides co-regulación y que, por ejemplo, la regulación positiva del receptor de andrógenos por la 1,25-dihidroxivitamina D3 probablemente contribuye a las acciones sinérgicas de 1 , 25-dihidroxivitamina D3 y DHT en estas células [23]. Los datos de laboratorio de Feldman muestran que la adición de DHT en 1 nM al medio restauró la actividad antiproliferativa de la 1,25-dihidroxivitamina D3, mientras que un antiandrógeno, Casodex, bloqueó completamente las actividades de estimulación antiproliferativos D3 y PSA 1,25-dihidroxivitamina cuando las células se cultivaron en medio FBS [23].
La capacidad de 1,25-dihidroxivitamina D3 para inhibir el crecimiento de la próstata se ha demostrado en células de cultivo primario de los tejidos normales, la hiperplasia prostática benigna (BPH) y el cáncer de próstata , y varios modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata [5], sin embargo, no tiene relación con la capacidad de respuesta TRPV6 se ha demostrado hasta el momento. El mecanismo para la actividad de 1,25-dihidroxivitamina D3 no está completamente clara, pero se refiere a diferentes actividades como las diferencias de comprobar la validez de los receptores en la farmacocinética, así como las diferencias en la conformación funcional del complejo VDR unido a ligando que puede alterar las propiedades de retinoide X los receptores de la hibridación, de unión a ADN y co-activador reclutamiento [24]. El mecanismo de la inhibición del crecimiento por 1,25-hidroxivitamina D3 parece ser mutifactorial pero la inducción de p21
WAF1 /CIP1 y /o p27
Kip1 parece ser una vía importante [25].
somos los primeros en informar de que los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 pueden ser pro-proliferativa cuando mediada por la inducción directa de
TRPV6
la expresión génica en humanos línea celular LNCaP andrógeno-dependientes altamente cancerígeno. La cuestión queda abierta ya sea 1,25-hidroxivitamina D3 tratamiento es factible en las etapas del cáncer y la metástasis ser distinto en la expresión TRPV6 alta, o, de lo contrario, en las células de cáncer de próstata biopsias siendo sensibles a la 1,25-dihidroxivitamina D3 de tratamiento mediante la sobreexpresión TRPV6.
por lo tanto, 1,25-hidroxivitamina D3 upregulates TRPV6 lo que aumenta considerablemente la [Ca
2 +]
i proporcionando una mayor Ca
2 + -absorción por las células LNCaP. Este Ca inducida por la 1,25-dihidroxivitamina D3
2 + -absorción aumenta drásticamente la tasa de proliferación y un número de las células que entran en la fase S y también contribuye a la resistencia a la apoptosis mejorada. Curiosamente, la apoptosis no se ve afectada por tratamiento de 1,25-dihidroxivitamina D3 que puede explicarse por la capacidad de respuesta de la línea celular LNCaP de 1,25-dihidroxivitamina D3 mediante el aumento de la expresión de canal TRPV6 y por lo tanto la mejora de la resistencia a la apoptosis. Sin embargo, cuando las células LNCaP se tratan con 1,25-dihidroxivitamina D3 pero pretransfected con siRNA-TRPV6 y por lo tanto vacío de este canal son mucho más sometidas a la apoptosis que se hace comparable a impacto de siRNA contra AR utiliza un control positivo. Esto implica que el calcio suministrado a la célula de cáncer a través del canal TRPV6 se utiliza para contrarrestar los efectos de la 1,25-dihidroxivitamina D3 que tienen que ser antiproliferativa en ausencia o baja presencia de este canal. Llegamos a la conclusión de que es un determinante TRPV6 grave para 1,25-hidroxivitamina D3 o pro actividad antiproliferativa.
Nuestros datos no son contradictorias con las obras publicadas con anterioridad y son consistentes con la hipótesis de que los efectos inhibidores del crecimiento de 1 , D3 25-dihidroxivitamina están mediadas parcialmente a través de su capacidad para modular la expresión de PCNA [26]. Un nivel de proteína PCNA siendo doble disminuyó tras el tratamiento 1,25-hidroxivitamina D3 se volvió a disminuir en las células LNCaP transfectadas con siRNA-TRPV6, con o sin 1,25-dihidroxivitamina D3.