Extracto
proteína relacionada Twist-1 (TWIST1), también conocida como clase A proteína básica hélice-bucle-hélice 38 (bHLHa38) , ha sido implicado en la determinación del linaje celular y la diferenciación. Estudios previos demuestran que la expresión TWIST1 está regulado en el cáncer gástrico con pobres resultados clínicos. Además, se sugiere TWIST1 estar involucrados en la progresión del cáncer gástrico humano. Sin embargo, sus funciones biológicas siguen siendo en gran parte inexplorado. En el presente estudio, mostramos que la torcedura 1 sobreexpresión conduce a una regulación significativa de FoxM1, que desempeña un papel clave en la progresión del ciclo celular en células de cáncer gástrico. Por el contrario, desmontables de la torcedura 1 reduce la expresión FoxM1, lo que sugiere que FoxM1 podría ser una diana transcripcional directa de Twist 1. A nivel molecular, revelamos, además, que la torcedura 1 podría unirse a la región promotora de FoxM1, y, posteriormente, reclutamos p300 para inducir transcripción FoxM1 mRNA. Por lo tanto, nuestros resultados revelan un toque desconocida anterior 1 /vía de reglamentación FoxM1, que puede ayudar a comprender los mecanismos de proliferación del cáncer gástrico
Visto:. J Qian, Luo Y, Gu X, W Zhan, Wang X ( 2013) TWIST1 promueve la proliferación celular del cáncer del estómago a través de la regulación de FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10.1371 /journal.pone.0077625
Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 31 de mayo de 2013; Aceptado: 3 de septiembre de 2013; Publicado: 24 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Qian et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
epitelio-mesenquimal transición (EMT) es una proceso por el que las células epiteliales pierden la polaridad y la adhesión célula a célula, y se someten a la remodelación dramático del citoesqueleto [1,2]. Concurrente con la pérdida de los componentes de adhesión celular y del citoesqueleto epiteliales, células de someterse a adquirir EMT expresión de los componentes mesenquimales y un fenotipo migratorio [2,3].
Varios inductores clave de la EMT son factores de transcripción que incluyen la torcedura 1, caracoles, babosas y, que reprime la expresión de E-cadherina [4,5]. TWIST1 pertenece a la familia básica factor de transcripción hélice-bucle-hélice [6]. Inicialmente, TWIST1 se sugirió a ser esencial en el desarrollo de los tejidos derivados del mesodermo, incluyendo el músculo y linajes de células osteogénicas [7,8]. Estudios posteriores han demostrado que la torcedura 1 promueve EMT y juega un papel esencial en la metástasis en varios modelos de tumores [9,10]. Expresión de Twist 1 también se ha implicado en la promoción de metástasis y subtipos patológicos invasivos en varios tipos de carcinoma [11]. Por lo tanto, la torcedura 1 ha sido sugerido por tener propiedades oncogénicas. Por ejemplo, la sobreexpresión de Twist en rabdomiosarcoma inhibe la apoptosis inducida por Myc e interfiere con la supresión tumoral p53 [12]. Sobre regulación de Twist está asociada con la transformación maligna en el linfoma de células T [13]. La expresión forzada de Twist desencadena resistencia de las células cancerosas humanas a los fármacos que inhiben la formación de microtúbulos [14].
Sin embargo, el efecto y el mecanismo de gen torsión sobre la proliferación del carcinoma gástrico siguen siendo enigmática. Estudios recientes han demostrado que TWIST1 está regulado en los fibroblastos asociados con el cáncer gástrico con pobres resultados clínicos [15]. Además, la baja regulación del gen de la torcedura 1 suprime la proliferación de células de cáncer gástrico, regulando negativamente la actividad de AP-1 resulta en la expresión de ciclina D1 disminuyendo [16]. En el presente trabajo, se emplearon dos líneas celulares de cáncer gástrico para investigar el efecto y mecanismo de Twist 1 gen sobre la proliferación celular.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Cuatro líneas de células epiteliales (NCI-N87, AGS, HGC-27 y MGC80-3) derivadas de carcinoma gástrico se obtuvieron de American Type Culture Collection (EE.UU.). Las células se cultivaron en DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco, Pekín). Los cultivos se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2.
pequeños ARN de interferencia, la extracción de RNA y análisis en tiempo real
Las células se sembraron a 6- así placas transfectadas con 50 nM oligos siRNA dirigidos a la torcedura humana 1 (Dharmacon, EE.UU.). El siRNA molécula específica para la proteína verde fluorescente (GFP) se utilizó como control negativo. ARN totales se extrajeron a partir de células por el reactivo TRIzol, y transcripciones inversas se realizaron por kit Takara RNA PCR (Takara, China) siguiendo el protocolo del fabricante. Con el fin de cuantificar la transcripción de los genes de interés, PCR en tiempo real se realizó con un SYBR Green Premezcla Ex Taq (Takara, Japón) el Light Cycler 480 (Roche, Suiza).
transitorias Las transfecciones y luciferasa Los ensayos
promotor FOXM1 humana se amplificó a partir del molde de ADN genómico humano y se inserta en pGL4.15 vector básico (Promega). motivo de unión del mutante TWIST1 se generó usando un kit de mutagénesis PCR (Toyobo) con un cebador (sitios de mutación subrayadas): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'y un cebador complemento inverso. Todas las transfecciones transitorias se realizaron por Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Shanghai), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los ensayos de reportero de luciferasa, las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos y se transfectaron con los plásmidos indicados. 48 horas después de la transfección, las actividades de luciferasa se midieron utilizando el sistema Dual Luciferase reportero de ensayo (Promega, EE.UU.).
Co-inmunoprecipitación
Las células se recogieron, se resuspendieron en tampón de lisis que contenía Tris 50 mM HCl (pH 7.3 a 7.5), NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, inhibidores de 0,5% de Triton X-100) y de la proteasa. Los lisados se incubaron con 2,5 g de p300 o IgG durante la noche a 4 ° C. Se añadieron perlas de proteína A durante 4 horas adicionales. Perlas que contienen complejos inmunes se lavaron con 1 ml de hielo frío tampón de lisis cuatro veces. Los precipitados fueron desnaturalizados en Laemmli (carga de gel) tampón a 95 ° C durante 10 min.
Western Blot
Las células se cosecharon por tripsinización, se lisaron en tampón de Laemmli, se desnaturalizó durante 10 min a 80 ° C, y se resolvieron en geles de SDS /PAGE. Después de la inmunotransferencia, las membranas se bloquearon en PBS /0,1% Tween-20 con leche en polvo sin grasa 7,5%, y los anticuerpos primarios se incubaron en PBS /0,1% Tween-20 con 0,1% -5% de leche seca sin grasa. Los anticuerpos dirigidos contra la torcedura 1, FoxM1 fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (EE.UU.). y anticuerpos GAPDH-p300 anti se obtuvieron de Abcam Company (EE.UU.). Anti-p21, p27, anticuerpos ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2, ciclina E y E-cadherina eran de Cellsignaling (EE.UU.).
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ensayo de
inmunoprecipitación de cromatina ( cHIP) kits de ensayo se utilizaron (Upstate, EE.UU.). Brevemente, las células se fijaron con formaldehído al 1% y se procesan adicionalmente usando kits de ensayo CHIP de Upstate. cromatina soluble se inmunoprecipitó con anticuerpos anti-torsión 1 y los anticuerpos IgG. Después de la purificación, las muestras de ADN fueron cuantificados por cuantitativa en tiempo real PCR usando cebadores que abarcan la región proximal del promotor de FoxM1 humano. Análisis FODA
Estadística
Todos los datos se presentan como media ± SEM. Las diferencias estadísticas se determinaron mediante una prueba t de dos colas. La significación estadística se muestra como * (P & lt; 0,05), ** (P & lt; 0,01) o *** (P & lt; 0,001).
Resultados
Efecto de TWIST1 sobre la proliferación de células de cáncer gástrico
En la primera, para explorar el papel funcional de la torcedura 1 en la proliferación celular, transduced NCI-N87 o AGS células con adenovirus que contienen la torcedura 1 o el vector vacío (Figura 1A y 1B). De acuerdo con estudios anteriores, la expresión de E-cadherina, un biomarcador del proceso de EMT [4,5], se redujo reguladas por la torcedura 1 sobreexpresión (Figura S1 A-1B). Además, la torcedura 1 sobreexpresión resultó en un aumento significativo en el número de células de todas las células ensayadas (Figura 1C y 1D). En consonancia, el análisis bromodesoxiuridina (BrdU) también confirmó que la torcedura 1 sobreexpresión promueve la proliferación celular (Figura 1E y 1F). Además, la torcedura 1 células que sobreexpresan tenían un porcentaje significativamente menor de células en la fase G1 /G0 y aumento del porcentaje de células en la fase S, en comparación con las células transfectadas con el vector vacío (Figura 1G-1H).
( AB) Western blot Representante de Twist 1 en las células NCI-N87 (a) o AGS (B) transfectadas con adenovirus que expresan el vector vacío (EV) o torcedura 1.
(CD) La curva de crecimiento del NCI -N87 (C) o AGS (D) células las células transfectadas con el vector vacío (EV) o torcedura 1.
(EF) La célula proliferativa potencial (BrdU) se determinó en NCI-N87 (E) o AGS células (F) transfectadas con el vector vacío (EV) o torcedura 1.
(GH) la fase del ciclo celular de las células AGS (H) NCI-N87 (G) y transfectadas con el vector vacío (EV) o torcedura 1 se analizó por citometría de flujo. Las células se marcaron durante 15 minutos con PI y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo. Los histogramas representan el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular (G0 /G1, S y G2 /M).
A continuación, NCI-N87 o células AGS se transfectaron con pequeños ARN de interferencia (siRNA ) dirigidos a la torcedura 1. El oligo siRNA mostró eficiente de la torcedura 1 caída en estas dos células, en comparación con las células transducidas con ARNsi de GFP (Figura 2A-2D). Como resultado, la regulación por disminución de Twist 1 condujo a una marcada disminución en el número de células y la proliferación en estas células (Figura 2E-2H). Además, el silenciamiento de Twist 1 aumentó significativamente el porcentaje de células en la fase G0 /G1 y la disminución del porcentaje de células en la fase S (Figura 2I-2J). En particular, se comparó la actividad de proliferación de células AGS NCI-N87 y con o sin la transfección de un vector vacío o GFP siRNA. Nuestros resultados sugieren que ni el vector vacío o GFP siRNA afectan a la actividad de proliferación celular (Figura S2A). Además, la capacidad de crecimiento de las células que expresan más alto de la torcedura 1 niveles (células NCI-N87 y AGS) es relativamente mayor que otros (HGC-27 y MGC80-3 células) (Figura S2C). Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que la torcedura 1 podría ser una importante regulación positiva de la proliferación de células de cáncer gástrico.
(AD) Cuantitativo en tiempo real PCR y Western blot de Twist 1 de expresión en NCI-N87 (AB) o células AGS (CD) transfectadas con siRNA oligos de orientación de la torcedura 1 o un control negativo siRNA (Ctrl).
(EF) La curva de crecimiento del NCI-N87 (E) o (F) AGS células transfectadas con siRNA oligos de orientación de la torcedura 1 o un control negativo siRNA (Ctrl).
(GH) La célula proliferativa potencial (BrdU) se determinó en NCI-N87 (G) o células AGS (H) transfectadas con oligos siRNA dirigidos torsión 1 o un control negativo siRNA (Ctrl).
(IJ) La fase del ciclo celular NCI-N87 (I) y AGS (J) células transfectadas con siRNA oligos de orientación de la torcedura 1 o scramble siRNA (Ctrl) se analizaron por citometría de flujo.
TWIST1 afecta a la expresión de los reguladores del ciclo celular
A medida que la torcedura 1 promovió la proliferación celular, examinamos sus funciones en la expresión de los genes que regulan la transición G1 /S, incluyendo la CDK inhibidores de p21
Cip1, p27
Kip1, el regulador de CDK de ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2 y ciclina E. Resultados de PCR en tiempo real y análisis de transferencia Western en las células NCI-N87 sugerido que la expresión de p21
Cip1, p27
Kip1 se downregulated, mientras que la ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2 y los niveles de ciclina e se upregulated en las células transfectadas con la torcedura 1, en comparación con las células transfectadas con el vector vacío (Figura 3A-3B). Resultados similares se observaron también en células AGS (Figura 3C-3D), lo que confirma, además, que la torcedura 1 puede influir en la proliferación de células de cáncer gástrico. En consonancia, la caída de Twist 1 aumentó p21
Cip1 y p27
Kip1 expresión, mientras que la reducción de ciclina B1, Ciclina D1, ciclina D2 y la expresión de ciclina E en células NCI-N87 y AGS (Figura 4A-4D).
(AD) cuantitativo en tiempo real PCR y Western blot de p21, p27, ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2 y ciclina e en NCI-N87 (AB) o AGS células (CD) transfectadas con adenovirus que expresan el vector vacío (EV) o torcedura 1.
(AD) cuantitativo en tiempo real PCR y Western blot de p21, p27, ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2 y ciclina e en NCI-N87 (AB )) o células AGS (CD transfectadas con siRNA oligos de orientación de la torcedura 1 o un control negativo siRNA (Ctrl).
Giro 1 se dirige directamente el factor de transcripción FoxM1 en células de cáncer gástrico
anteriores estudios han revelado que varios factores de transcripción pueden regular una serie de genes relevantes para el ciclo celular, incluyendo p21
Cip1, p27
Kip1 y ciclina B1. Por lo tanto, se analizaron los posibles factores de transcripción que participan en la regulación de la proliferación celular. Fuera de los cinco factores de transcripción han sido evaluados, solamente se encontraron FoxM1 resultó ser significativamente mayor en las células NCI-N87 sobreexpresan la torcedura 1 (Figura 5A-5B). La inducción de FoxM1 también se observó en células AGS (Figura 5C-5D). Además, la expresión FoxM1 se redujo en estas células empobrecido de Twist 1 (Figura 6A-6D), lo que sugiere que FoxM1 podría ser un objetivo de Twist 1.
(AB) Quantitative PCR en tiempo real (A) y western blot (B) análisis de FoxM1, FoxO1, Stat3, p53 y E2F1 expresión en células NCI-N87 transfectadas con adenovirus que expresan el vector vacío (EV) o torcedura 1.
(CD) cuantitativo PCR en tiempo real ( C) y Western blot (D) análisis de Twist 1 en las células NCI-N87 transfectadas con adenovirus que expresan el vector vacío (EV) o torcedura 1.
(AB) cuantitativo PCR en tiempo real (a ) y Western blot (B) de la expresión FoxM1 en células NCI-N87 transfectadas con siRNA oligos de orientación de la torcedura 1 o un control negativo siRNA (Ctrl).
(CD) cuantitativo PCR en tiempo real (C) y el oeste blot (D) de la expresión FoxM1 en células NCI-N87 transfectadas con siRNA oligos de orientación de la torcedura 1 o un control negativo siRNA (Ctrl).
torcedura 1 regula al alza la expresión FoxM1 a través del reclutamiento de p300
a continuación, nos centramos en el mecanismo molecular de la torcedura 1 regulación de la transcripción FoxM1. El análisis de secuencia mostró que la región promotora del gen FoxM1 humano contenía un potencial de torsión 1 sitio de unión (entre -357 y -352 pb) (Figura 7A). ensayo de luciferasa informe mostró que la actividad transcripcional del promotor FoxM1 de tipo salvaje se upregulated dramáticamente por la torcedura 1, mientras que la actividad transcripcional fue abolida en el promotor que lleva una mutación en la torcedura de los sitios de unión a 1 (Figura 7B). Por otra parte, los ensayos de chip mostraron que la torcedura 1 podría obligar única para FoxM1 promotor (Figura 7C). Para determinar si se requiere la inducción de FoxM1 por la torcedura 1 por su efecto proliferativo, llevamos a cabo experimentos con FoxM1 desmontables utilizando oligos siRNA en células NCI-N87 (Figura S3 A-S3B). Como resultado, el siRNA rescató células del efecto proliferativo de Twist 1 sobreexpresión (Figura S3C). Consistentemente, las funciones de la torcedura 1 en los niveles de expresión de los reguladores del ciclo celular también fueron contrarrestados por oligos FoxM1 siRNA (Figura S3D), lo que sugiere que FoxM1 es necesaria para las funciones de la torcedura 1 en células de cáncer gástrico.
(A) Diagrama de la página 1 de unión a la torcedura en el promotor humanos FoxM1 (1 kb) y dos reporteros de luciferasa FoxM1. WT-Luc: de tipo salvaje indicador de luciferasa; Mut-Luc: indicador de luciferasa que portan mutaciones puntuales de la torcedura 1 sitio de unión. Las mutaciones fueron subrayados.
(B) La activación de FoxM1 reporteros de luciferasa por la torcedura 1 en células NCI-N87.
(C) La unión de Twist 1 en las regiones promotoras de los genes humanos eran FoxM1 analizada por los ensayos de chip y cuantificados por PCR en tiempo real. La región que contiene -2000 a -1800 pb se utilizó como control negativo.
(D) Co-inmunoprecipitación de p300 y la torcedura 1 en células NCI-N87
.
(E) La activación de FoxM1 reporteros de luciferasa por la torcedura 1 y P300 en las células NCI-N87.
(F) Western blot Representante de expresión p300 en células NCI-N87 transfectadas con siRNA dirigidos p300 o control negativo (Ctrl).
(GH) cuantitativo PCR en tiempo real (G) y occidental análisis de transferencia (H) de la expresión de FoxM1 en células NCI-N87 transfectadas con adenovirus que expresan el vector vacío (EV) o torcedura 1. Las células se pre-transfectadas con oligos siRNA dirigidos p300 o control negativo siRNA (Ctrl) durante 24 horas.
Como factor de transcripción, la torcedura 1 puede reclutar coactivadores en la regulación de la expresión del gen diana. Estudios anteriores demostraron que p300 podría actuar como un coactivador para muchos factores de transcripción. por tanto, se examinó si la p300 podría ser un coactivador de la torcedura 1 regulación de la expresión FoxM1. Como se muestra en la Figura 7D, la torcedura 1 podría interactuar con p300 por coimmunoprecipitation. La actividad transcripcional del promotor FoxM1 se reguló aún más por la co-transfección de p300 y la torcedura 1 (Figura 7E). Por otra parte, aboliéramos adicionalmente la expresión de p300 utilizando oligos siRNA en células NCI-N87 (Figura 7F). Como era de esperar, la torcedura 1 inducida por la expresión FoxM1 fue mitigado significativamente por el silencio de p300 (figura 7G-7H). Los datos anteriores demostraron que la torcedura 1 aumentó la expresión de FoxM1 a través de una contratación de coactivator complejos de transcripción, incluyendo p300.
Discusión
En el estudio actual, nuestros resultados implican la torcedura 1 como un regulador crítico de la gástrico la progresión del cáncer. Esto es sugerido por varias líneas de evidencia. En primer lugar, la torcedura 1 sobreexpresión promueve mientras que su deficiencia inhibe la proliferación celular, como se muestra por BrdU y análisis del ciclo celular. En segundo lugar, la torcedura 1 afecta a los genes moduladores de la expresión del ciclo celular, incluyendo los inhibidores de CDK p21Cip1, p27Kip1, el regulador de CDK ciclina B1, Ciclina D1, ciclina D2 y ciclina E. En tercer lugar, la torcedura 1 regula al alza la expresión directa FoxM1 a nivel transcripcional, a través reclutamiento de P300. Además, desmontables de expresión endógena FoxM1 atenúa el efecto proliferativo de Twist 1, lo que sugiere que FoxM1 es esencial para las funciones de la torcedura 1 en células de cáncer gástrico.
En los adultos, la torcedura 1 se expresa principalmente en las células precursoras que incluyen los osteoblastos, miogénica, linajes y odontoblásticos mielomonocítica, mantener su estado indiferenciado [17]. Además, TWIST1 es también un importante regulador de muchos otros procesos biológicos, incluyendo el desarrollo mesenquimales y metabolismo de la grasa marrón. Por ejemplo, TWIST1 se cree que inhibe la diferenciación de osteoblastos, regulando negativamente Runx2 [17]. Además, Twist-1 se expresa selectivamente en el tejido adiposo, interactúa con PGC-1α, para suprimir el metabolismo mitocondrial y desacoplamiento. Como resultado, los ratones transgénicos que sobreexpresan Twist-1 en el tejido adiposo son propensos a la obesidad alto contenido de grasa-inducida por la dieta, mientras que sus ratones knockout heterocigóticas son resistentes obesidad [18]. Por otra parte, la torcedura 1 de expresión nuclear también se observó en el epitelio no canceroso, lo que sugiere que la torcedura 1 puede tener un papel fisiológico en las células normales [19]. Estudios posteriores demuestran que la expresión de la torcedura 1 se correlaciona con la potente capacidad de invasión, así como de mal pronóstico en el cáncer epitelial. En el cáncer gástrico, un informe reciente ha demostrado la sobreexpresión del gen de la torcedura 1 se encuentra con mayor frecuencia en tejidos de carcinoma de tipo difuso con alta expresión de los genes N-cadherina [20]. Torsión Sin embargo, no hay resultados definitivos han indicado promueve la proliferación de cáncer gástrico. Nuestros hallazgos de la torcedura sugeridas probablemente promovieron la proliferación de células de cáncer gástrico, el uso de los ensayos de incorporación de BrdU. Además, FoxM1 se identificó en primer lugar como una nueva diana transcripcional de Twist 1.
FoxM1 une regiones promotoras con una preferencia por una secuencia de reconocimiento [TAAACA] consenso, aunque con menor afinidad que otras proteínas forkhead [21]. Su expresión está restringida a las células proliferantes, y excluidos de las células quiescentes y diferenciadas terminalmente. Se controla la expresión de los genes necesarios para ambos G1 /S y G2 /M transición y es esencial para la entrada y la progresión mitótico, lo que garantiza el mantenimiento de la estabilidad de los cromosomas [22,23]. Las amplificaciones del gen de FoxM1 se ha descrito en numerosos tumores tales como carcinomas de páncreas, cáncer de mama y carcinoma hepatocelular [24-27]. En el cáncer gástrico, la expresión FoxM1 es también hasta reguladas y su inhibición conduce a la senescencia celular, que es al menos en parte, dependiente de p27 Kip1 [28,29]. Además de su papel positivo en la proliferación celular, FoxM1 se ha demostrado que desempeñan papeles en otros procesos relacionados con el cáncer, tales como la invasión y metástasis [30]. Sus niveles de expresión se correlacionan con un mal pronóstico y la metástasis en diferentes tumores, incluyendo carcinoma gástrico [31], lo que sugiere la posibilidad de utilizar FoxM1 como pronóstico y /o el marcador de diagnóstico. Tomados en conjunto, FoxM1 es un objetivo prometedor y atractivo para la terapia del cáncer. Por lo tanto, es fundamental para entender cómo se regula FoxM1 con el fin de diseñar mejores enfoques terapéuticos.
FoxM1 expresión está regulada fuertemente tanto en los niveles de ARNm y proteínas. Su abundancia aumenta a la entrada de la fase S, picos durante la fase G2 y M, y se degrada durante la salida de mitosis. Del mismo modo, su actividad transcripcional está estrechamente regulada largo del ciclo celular por fosforilación en múltiples sitios por diferentes quinasas, fosfatasas y sus contrarrestan, alcanzando su máxima actividad en la fase G2 del ciclo celular [32]. Recientemente, se ha informado de que la expresión de FoxM1 también puede ser modulada por microRNAs. FoxM1 ha sido identificado como un objetivo directo de miR-134, cuyos niveles se correlacionan inversamente con el potencial invasivo de algunas células de NSCLC [33]. Por otra parte, FoxM1 también es reprimida por el miR-370 en células de cáncer gástrico [29], lo que sugiere que se necesitan más estudios para investigar si la torcedura 1 podría cooperar estas vías de regulación.
En conclusión, aquí muestran que la torcedura 1 sobreexpresión conduce a una regulación significativa de FoxM1, que desempeña un papel clave en la progresión del ciclo celular en células de cáncer gástrico. Por el contrario, desmontables de torsión 1 reduce la expresión FoxM1, lo que sugiere que FoxM1 podría ser una diana transcripcional directa de Twist 1. Nos revelan además que la torcedura 1 podría unirse a la región promotora de FoxM1, y posteriormente reclutar p300 para inducir FoxM1 mRNA transcripción. Por lo tanto, nuestros resultados revelan un toque desconocida anterior 1 /vía de reglamentación FoxM1, que puede ayudar a comprender los mecanismos de proliferación del cáncer gástrico.
Apoyo a la Información
Figura S1. gratis (AB) mRNA y los niveles de proteína de E-cadherina en NCI-N87 (A) y células AGS (B) transfectadas con adenovirus que expresan el vector vacío (EV) o torcedura 1.
doi: 10.1371 /journal.pone .0077625.s001 gratis (TIF)
figura S2.
(A-B) La célula proliferativa potencial (BrdU) se determinó en NCI-N87 (A) o AGS (B) células sin o con transfección de vector vacío (EV) o GFP siRNA. (C) Endógena expresión Giro 1 se determinó por Western blot en cuatro células de cáncer gástrico (NCI-N87, AGS, HGC-27 y MGC80-3). Se midió la curva de crecimiento de cuatro líneas celulares
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
(A-B) de ARNm (A) y la proteína (B) Niveles de FoxM1 en células NCI-N87 transfectadas con oligos siRNA contra NCI-N87 o un control negativo (Ctrl). (C) la actividad de proliferación celular se midió por ensayos de BrdU en las células NCI-N87. Las células se pre-transfectadas con siRNA oligos durante 24 horas y luego se transfectaron con el vector vacío (EV) o torcedura 1 durante otras 24 horas.
Niveles (D) de ARNm de p21, p27, ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2 y ciclina E se determinó por PCR en tiempo real en células NCI-N87. Las células se pre-transfectadas con siRNA oligos durante 24 horas, y a continuación, transfectadas con el vector vacío (EV) o torcedura 1 durante otras 24 horas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s003
(TIF)