Extracto

Antecedentes

Un reto importante en el tratamiento de la ductal pancreático adenocarcinoma es el fracaso de la quimioterapia, que es probable que se deba a la presencia de las células madre del cáncer (CSC).

Objetivo

para identificar lado la población de células (SP) y caracterizar las propiedades s parecido a en líneas celulares de cáncer de páncreas humano (h-PCCLs) y explotar la eficacia de la orientación simultánea de múltiples factores de transcripción clave que rigen la troncalidad de células madre cancerosas pancreáticas en la supresión de los fenotipos de CSC-como.

Métodos

La citometría de flujo y Hoechst 33342 ensayo de flujo de salida de colorante de unión a ADN se utilizaron para clasificar las células no-SP (NSP) y SP a partir de tres h-PCCLs: PANC-1, SW1990, y BxPC-3. Se evaluó la resistencia a la capacidad de auto-renovación, invasión, la migración y el fármaco de células SP. Se analizó la expresión de genes marcadores de CSC. Tumorigenicidad se evaluó mediante un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos. Efectos de un complejo oligonucleótido señuelo (cdODN-SCO) diseñado para la orientación simultánea Sox2, Oct4 y c-Myc fueron evaluados.

Resultados

Los CCC fueron enriquecidos en la proporción lateral células (SP) contenían en el H-PCCLs y que poseían propiedades de crecimiento, la invasión, la migración y resistentes a los medicamentos agresivos, en comparación con las células de NSP. células SP sobreexpresados ​​marcadores de células madre CD133 y ALDH1, factores de mantenimiento de pluripotencia Nanog, Sox2 y Oct4, oncogénica factor de transcripción c-Myc, molécula de señalización Notch1, y ABCG2 gen resistente a los medicamentos. Por otra parte, las células SP demostraron consistentemente significativamente mayor tumorigenicidad de las células de NSP en el modelo de xenoinjerto de ratones desnudos. CdODN-SOC suprimida de manera eficiente todas las propiedades de CSC y fenotipos, y reduce al mínimo la capacidad tumorigénico de las células SP y la resistencia a la quimioterapia. En comparación, el control negativo no lo hizo.

Conclusión

Los resultados indican que la orientación de los genes clave que confieren la troncalidad de las CSC puede eliminar eficazmente fenotipos CSC-como, y por lo tanto puede ser considerado un nuevo enfoque para la terapia del cáncer. En concreto, el presente estudio ha permitido establecer la combinación de Sox2 /Oct4 /c-Myc focalización como un agente anti-cáncer de páncreas potencial digno de más estudios preclínicos en la configuración

Visto:. Wang X, Liu Q, Hou B, Zhang W, Yan M, Jia H, et al. (2013) La focalización concomitante de múltiples factores de transcripción clave Interrumpe eficazmente las células madre del cáncer enriquecidos en Side población de células de cáncer pancreático humano. PLoS ONE 8 (9): e73942. doi: 10.1371 /journal.pone.0073942

Editor: Kamyar Afarinkia, University of Bradford, Reino Unido

Recibido: 19 Abril, 2013; Aceptado: July 24, 2013; Publicado: 11 Septiembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC), conocidos por su agresividad en la naturaleza, es un tumor maligno altamente letal que generalmente se diagnostica en una etapa tardía de la que se han omitido las opciones terapéuticas óptimas [1]. El mal pronóstico puede ser explicado por la detección tardía del proceso neoplásico, la falta de un tratamiento eficaz, y el conocimiento limitado de sus características biológicas. Por lo tanto, es urgente mejorar la comprensión de las propiedades moleculares /celulares asociados con esta condición para explorar nuevos lugares de diagnóstico y tratamiento de esta enfermedad pésimo.

Nuevas evidencias sugieren que los tumores malignos se componen de un pequeño subconjunto de distinta células de cáncer, denominadas "células madre del cáncer" (CSC), típicamente menos de 5% de las células cancerosas en total sobre la base de la expresión de marcadores de superficie celular [2-6]. Células madre cancerosas se encuentran en una subpoblación de células que es distinta de la principal población dentro de los tumores o cánceres hematológicos, llamadas células "lado la población" (células SP) que presentan características similares a las células madre. Los CCC poseen la capacidad de auto-renovación y para generar los linajes heterogéneas de células cancerosas que componen el tumor; por lo tanto son tumorigénicas, en contraste con otras células de cáncer no tumorigénicas, y son conductores esenciales para la progresión tumoral y la metástasis. Clínicamente aún más importante, sin embargo, es el hecho de que los CAC también confieren virulencia a través de la evasión del sistema inmune y resistencia a múltiples fármacos de la quimioterapia y la radioterapia que resulta en su enriquecimiento relativo durante el tratamiento y rápida recidiva de la enfermedad [2-6]. La eficacia de los tratamientos del cáncer a menudo se mide por la fracción de la ablación de la masa tumoral, y las quimioterapias convencionales matan células diferenciadas o de diferenciación, que forman la mayor parte del tumor, pero que son incapaces de generar nuevas células. Como células madre cancerosas forman una proporción bastante pequeña del tumor, podrían permanecer un-atacado, causando una recaída de la enfermedad. Por lo tanto, el desarrollo de terapias específicas dirigidas a las células madre cancerosas es una enorme esperanza para la mejora de la supervivencia y la calidad de vida de pacientes con cáncer, especialmente para los que sufren de la enfermedad metastásica.

células madre cancerosas se han identificado en PDAC y líneas celulares de cáncer pancreático por varios laboratorios [7-14]. Células madre cancerosas pancreáticas humanas que expresan altos niveles de CD133, CD24, CD44, ESA, y aldehído deshidrogenasa (ALDH1) también tienen más abundante Nanog, Oct4, Notch1, MDR1 y ABCG2 que los tejidos normales de páncreas y cáncer de páncreas células primarias [10-12,14, 15]. Parece que PDAC no sólo contiene una población homogénea de células madre cancerosas en lugar de diversas subpoblaciones que pueden haber evolucionado durante la progresión tumoral, basado en el uso de combinaciones de marcadores de superficie que permiten su aislamiento, propagación y caracterización adicional. Una de estas poblaciones se llama migración de células madre cancerosas y estas células son capaces de evadir el tumor primario y viajar a sitios distantes tales como el hígado como el sitio preferido de diseminación metastásica.

Por lo tanto, los tratamientos exitosos de los cánceres no sólo se basan en la identificación de la fuente de células de cáncer y la terapia contra el cáncer para las células cancerosas diferenciadas, sino también en la búsqueda de potencial de población CSC y alcanzar suficiente destrucción de células madre cancerosas en el tumor. De hecho, los enfoques dirigidos-CSC han demostrado una gran promesa en modelos preclínicos [2-6]. Estos enfoques incluyen estrategias directas, como la ablación por la orientación marcadores moleculares de células madre cancerosas o vías de CSC-específicas, la inversión de los mecanismos de resistencia, y la terapia de diferenciación, y estrategias indirectas, como la terapia antiangiogénica, enfoques inmunoterapéuticos, y la interrupción de las interacciones protumorigénicas entre células madre cancerosas y su microambiente.

El presente estudio se llevó a cabo para lograr los siguientes dos objetivos principales. En primer lugar, para tener una caracterización completa de las poblaciones de CSC en líneas celulares de cáncer de páncreas humano, se compararon las células SP en, líneas de PANC-1 y SW1990 células BxPC-3. En segundo lugar, para explotar la posibilidad de dirigir simultáneamente múltiples factores de transcripción que regulan la troncalidad de las células madre cancerosas pancreáticas para interrumpir los CAC con ello la tumorigénesis y metástasis, se diseñó un fragmento de oligonucleótidos señuelo por el "un agente, múltiples objetivos" concepto y prueba la eficacia de esta molécula para el silencio de la troncalidad de células madre cancerosas pancreáticas.

Materiales y Métodos

Ética declaración

el utilizada de todos los animales en este estudio fue aprobado por, y todos los procedimientos operativos y cuidado de los animales estrictamente hechos conforme a las directrices establecidas por el Comité de Ética Animal de la Universidad médica de Xinjiang y la Universidad Sun Yat-sen.

cultivo de células

las líneas celulares de cáncer de páncreas humanos BxPC-3, PANC-1 y SW1990 establecido originalmente de adenocarcinoma de páncreas humano primario por ATCC se adquirieron de Shanghai Cell Bank (Shanghai, china) y se propaga en nuestro laboratorio. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Medio fue suplementado con 1% de penicilina /estreptomicina, 3 mM L-glutamina, y suero bovino fetal al 10% (FBS) (Gibco). Las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C que contiene 5% de CO
2.

La citometría de flujo análisis y clasificación de células

células SP son un pequeño grupo de células que se tiñen débilmente o no es en absoluto cuando se trata con Hoechst 33342. Estas células se pueden aislar utilizando protocolos de citometría de flujo inicialmente establecidos por Goodell et al. En un estudio de la médula ósea murina [16,17]. H-PCCLs se separaron de la placa de cultivo con 0,25% de tripsina, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se suspendieron a 1 x 10
6 células /ml en medio de cultivo que contiene 2% de FBS. Las células tumorales y líneas de células se incubaron con colorante Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 5 mg /ml con o sin verapamil (100 M; Sigma-Aldrich) a 37 ° C durante 90 min con agitación intermitente cada 15 min. El verapamilo se utilizó para verificar el fenotipo SP, ya que puede reducir la rama lateral mediante el bloqueo de los transportadores de múltiples fármacos. Después se lavó dos veces con PBS, las células se resuspendieron en PBS enfriado con hielo que contiene 2% de FBS, pasaron a través de un filtro de malla de 40 micras para obtener suspensiones de una sola célula, y se mantienen en hielo hasta que la citometría de flujo análisis. Se añadió a la etiqueta y excluir las células muertas de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich PI;; 2 g /ml). análisis de las células y la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se llevaron a cabo utilizando un FACS Vantage SE equipado con el software versión 6.0 FACS DIVA (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica). Hoechst 33342 se excita con un láser ultravioleta de 350 nm, y la emisión de fluorescencia era de doble longitud de onda analizada (Hoechst azul con filtro de 402-450 nm; Hoechst roja con filtro de 650-670 nm).

La proliferación celular y ensayos de ciclo celular

un millar de SP ordenados y no SP células (NSP) se sembraron en pocillo separado de una placa de 96 pocillos por triplicado y se cultivaron en de Leibovitz L-15 medio con 1% de penicilina /estreptomicina y 10 % de FBS durante 3 días. El crecimiento se midió utilizando el método de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT). Brevemente, 20 l solución de MTT (5 mg /ml en PBS; Sigma) se añadió a cada pocillo y se incubó a 37 ° C durante 4 h. Se añadió una alícuota de 150 l de DMSO a continuación, y la absorbancia se midió mediante un lector de microplacas (Multiscan MK3, Thermo Labsystem, EE.UU.) a una longitud de onda de 490 nm.

Para el ensayo del ciclo celular, 5 × 10
5 células recién según se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con 2 ml de 70% de etanol enfriado en hielo a 4 ° C durante la noche. Las células se transfirieron entonces a PBS, se tiñeron con 20 mg PI /ml y 1 mg /ml de RNasa, y se analizaron usando citometría de flujo. Los resultados se expresan como el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular.

ensayos de formación de Clone

Se aplicaron los siguientes pasos para los ensayos (1). Agar (10 g /l; grado ADN) se fundió en el microondas y 2 × DMEM suplementado con 200 ml /l de FBS se calentó a 40
oC en un baño de agua. Volúmenes iguales de estas dos soluciones se mezclaron a continuación para producir una nueva solución de 5 g /l de agar + 1 × DMEM + 100 ml /l de FBS (2). A continuación, se añadió 1 ml de solución mixta a cada pocillo de una placa de 6 pocillos para formar el agar base (3). A continuación, se fundió 7 g /l de agar (grado de ADN) en el microondas y se enfrió a 40
oC en un baño de agua, y 2 × DMEM y 200 ml /l de FBS se calentó a la misma temperatura (4). se pasaron células SP recién ordenados y no SP a través de un filtro de 40-micras para proporcionar una única suspensión de células y se contaron. Tres ml de DMEM, 1,5 ml 2 × DMEM que contenía 200 ml /l de FBS y 1,5 agar ml incluyendo 500 células clasificadas a continuación, se mezclaron entre sí, y una suspensión de 1,5 ml de células de esta solución se colocó en cada pocillo de una placa de 6 pocillos como el agar superior (5). Finalmente, 100 células se sembraron en cada pocillo, y se incubaron a 37
oC en un incubador humidificado durante 2 a 3 semanas. Las colonias eran o sin teñir izquierda, o se tiñeron con 5 g /l de MTT (Sigma-Aldrich) durante 1 h, y se contaron bajo un microscopio de disección (el procedimiento se repitió tres veces) (6). Después de células SP se sembraron en los ensayos de agar blando, las colonias que contienen más de 50 células (colonias primaria) se retiraron del agar blando con pipetas Pasteur estériles, tratadas con tripsina y se disocian mecánicamente en células individuales. Entonces, la etapa (5) se repitió para la colonia secundaria.

ensayos de formación de Esfera

Las células clasificadas SP y NSP de los tres h-PCCLs se pasaron a través de un filtro de 40-micras para obtener una suspensión de células individuales. Entonces, 4 ml de medio que contiene 100 células se añadieron a placas de 6 pocillos con cultivo libre de suero medio DMEM-F12 (Invitrogen-Life Technologies), suplementado con factor de crecimiento epidérmico (10 g /l), insulina (20 mg /L) y bFGF (10 g /l). Se añadieron alícuotas de factor de crecimiento epidérmico, insulina y factor de crecimiento de fibroblastos básico dos veces a la semana. Después de 10 d, las placas se analizaron visualmente para la formación de esferas flotantes y las esferas se contaron bajo un microscopio de disección.

ensayo de invasión

se determinó invasividad de SP ordenados y células NSP utilizando 6 pocillos cámaras de invasión Matrigel (BD Biosciences Descubrimiento de laboratorios). Se sembraron las células en la cámara superior sobre la membrana de Matrigel recubierto (24 pocillos de inserción; tamaño de poro, 8 mm; Corning Costar) a 2 × 10
5 por inserción en DMEM libre de suero a 37
oC, con 5 % de CO
2 durante 48 h. pocillos externos se llenaron con DMEM que contenía FBS al 5% como quimio-atrayente. Las células no invasoras se retiraron muestras de secreciones capa superior de Matrigel con Q-tip. La membrana que contiene células invasoras se tiñó con hematoxilina durante 3 min, y después se lavó y se montó en portaobjetos. Las células invasoras en toda la membrana fueron contados bajo un microscopio de luz a 40 × objetivo.

Transwell ensayo de migración de células

Ordenada SP o NSP a 1 × 10
5 se sembraron en el cima de la cámara sobre la membrana no recubierta (24 pocillos inserto; tamaño de poro, 8 mm; Corning Costar) y se dejó a migrar hacia medio que contiene suero en la cámara inferior. Las células se fijaron después de 24 h de incubación con metanol y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta (2 mg /ml, Sigma-Aldrich). El número de células que invaden a través de la membrana se contó con un microscopio óptico (40 ×, tres campos al azar por pocillo).

La resistencia a fármacos análisis

Las alícuotas de 2 × 10
3 recién ordenados SP y las células de NSP se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado con 200 DMEM l por pocillo. Después de un período de recuperación de 12 h, las células se expusieron a diversas concentraciones de gemcitabina para 72 h. Los efectos sobre el crecimiento celular se examinaron mediante el ensayo MTT como se describió anteriormente. La tasa de supervivencia celular (SR) se calculó usando la fórmula: SR = (absorbancia media de la prueba así /absorbancia media del control) x 100%; la tasa de resistencia de las células (RR) se calculó usando la fórmula:. RR = 100% -SR

Las células apoptóticas se determinaron por métodos isotiocianato de fluoresceína (FITC) -Annexin-V. En resumen, las células recién ordenados se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo. Después de 12 h de recuperación, las células se expusieron a concentraciones variables de gemcitabina para 48 h. Las células fueron teñidas con anexina-V y PI utilizando el Kit ™ ApoAlert Anexina V Apoptosis (Clontech, Cosete Tech, Jinan) según el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se recogieron por tripsinización y se lavaron dos veces con PBS frío. Los sedimentos se resuspendieron en tampón de unión 100 l 1 × anexina y 5 l de FITC-anexina-V. Se añadió una solución de trabajo 1-l de PI a 100 g /ml a cada uno de 100 l de suspensión celular. Las células se incubaron en hielo durante 1 h, se lavaron de nuevo con PBS frío y se resuspendieron en 300 l 1 x tampón de unión a anexina. Las células teñidas se analizaron inmediatamente por citometría de flujo.

diferenciación in vitro estudio

SP recién ordenados y las células del NSP se cultivaron a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo en una placa de cultivo de 6 pocillos en medio L-15 de Leibovitz con 1% de penicilina /estreptomicina y 10% de FBS y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2. Después de 7 días, SP-SP y no las células derivadas fueron re-analizados para detectar la presencia de una fracción SP utilizando los métodos descritos anteriormente.

ensayo de tumorigenicidad in vivo

atímicos de 4 a 5 -Semana ratones de edad (BALB /c ratones desnudos) fueron suministrados por Slac Animales de Laboratorio (Shanghai). Los animales fueron alojados y mantenidos en cabinas de flujo laminar en condiciones libres de patógenos. Grupos de ratones se inocularon s.c. ortotópicamente al flanco dorsal izquierdo de ratones con células SP recién ordenados a 1 × 10
3, 1 × 10
4, 1 × 10
5, y 1 × 10
6 o NSP células en 1 x 10
3, 1 × 10
4, 1 × 10
5, y 1 × 10
6 (cuatro ratones por grupo). El crecimiento tumoral se monitorizó cada 2 días después de la segunda semana de la inoculación. Los ratones se sacrificaron en el día 50 o cuando los tumores crecen hasta un máximo de 1.000 mm
3. El volumen del tumor se calculó mediante la fórmula 0,52 x longitud x anchura
2. Doblez diferencia en la tumorigenicidad se calculó mediante la siguiente fórmula: NSP
min /SP
min, donde NSP
min es el número mínimo de células de NSP necesarios para generar un tumor y SP
min es el mínimo número de células SP necesarios para generar un tumor. Por último, los tumores también fueron digeridos para hacer la suspensión de una sola célula para SP re-análisis mediante el ensayo de tinte de flujo de salida Hoechst33342 como se describe anteriormente.

Cuando los tumores inducidos-h-PCCL alcanzaron un volumen de aproximadamente 200 mm
3, un grupo de ratones recibieron gemcitabina (200 mg /kg ip de peso corporal, 1 de inyección de cada 3 días, 6 inyecciones en total) y el otro grupo (teniendo los tumores correspondientes) se inyectaron con vehículo (NaCl 0,9%; grupo de control ). diámetro del tumor se midió cada 3 días después de la primera inyección. La gemcitabina se consideró eficaz cuando el volumen del tumor disminuyó al menos 50%. Tres días después de la última inyección, los ratones fueron sacrificados y los tumores analizados para determinar la proporción de células SP como se ha descrito anteriormente.

extracción de RNA y PCR en tiempo real análisis

Las células clasificadas y las células cultivadas fueron se trata con el reactivo Trizol (Invitrogen china Limited, Shanghai) y mezclarse bien con la pipeta. Los Trizol-lisados ​​se mezclaron después con cloroformo y se centrifugaron a 15.000 xg durante 15 min. Después de la centrifugación, el ARN total se obtuvieron por precipitación con isopropanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

cDNA de cadena sencilla se transcribe de forma inversa a partir de ARN total usando cebador aleatorio en condiciones estándar con el ADNc de alta capacidad de revertir kit de transcripción (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Cuantitativa en tiempo real PCR con ADNc total se lleva a cabo con SYBR Green Master Mix Real-Time Core Reactivos en un ABI 7500 (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las amplificaciones se llevaron a cabo a 95 ° C durante 10 seg seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 30 s. Para cuantificar la expresión relativa de cada gen, los valores de Ct (ciclo umbral) se normalizaron para la referencia endógena (
Ct = Ct Ct focalización β-actina) y en comparación con un calibrador, utilizando el "
ΔΔCt método "(
ΔΔCt =
Ct
muestra -
Ct
calibrador). Usando el valor
ΔΔCt, se calculó la expresión relativa (
2-ΔΔCt). A medida que el
método? Ct sólo es aplicable cuando las eficiencias de amplificación de la diana y la referencia son esencialmente iguales, a fin de determinar las eficiencias de 5 diluciones y el delta de los valores de Ct (Ct
target-Ct
β- actina) se representa frente a la dilución (log). A continuación se determinó la pendiente de la línea ajustada. Todas las muestras se analizaron por triplicado, y los valores medios se utilizaron para la cuantificación.

análisis de transferencia de Western

membrana y muestras de proteínas citosólicas se extrajeron de células SP y NSP de los tres h-PCCLs. La concentración de proteína se determinó mediante el contenido de proteína se determinó mediante BCA Protein Assay Kit usando albúmina sérica bovina como estándar (Pierce, EE.UU.). Cantidades iguales de muestras de proteína (~ 50 g) se fraccionaron mediante SDS-PAGE (12% geles de poliacrilamida) y se transfirió electroforéticamente a una membrana de PVDF (Millipore, Bedford, MA) utilizando un Mini Trans-blot (Bio-Rad Laboratories, Shanghai). Las muestras de proteína (muestra de membrana para ABCG2 y CD133; muestra citosólica para ALDH1, Oct4, Sox2 y Nanog) se incubaron con los anticuerpos primarios en 1: 200 a 4 ° C durante la noche. Conejo purificado por afinidad policlonal anti-ABCG2 (Shanghai Ruiqi biotecnología Co LTD), policlonal de conejo anti-CD133 (Shanghai Xiangsheng Biotech Co. LTD), policlonal de conejo anti-Oct4 (Señalización Celular de Shanghai), policlonal de conejo anti-Sox2 (Shanghai Excell Bio Co. LTD), policlonal de conejo anti-ALDH1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA), y anticuerpo policlonal de conejo anti-Nanog (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA) se utilizaron como los anticuerpos primarios. Al día siguiente, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios (Molecular Probes) diluido en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. Por último, la membrana se lavó con PBS antes de escanear utilizando el sistema de imágenes por infrarrojos (LI-COR Biosciences). GAPDH se utilizó como un control interno para la igualdad de entrada de muestras de proteínas, usando el anticuerpo anti-GAPDH. bandas de transferencia de Western se cuantificaron usando software QuantityOne mediante la medición de la intensidad de la banda (Area × OD) para cada grupo y normalización a GAPDH. Los resultados finales se expresan como cambios veces por la normalización de los datos a los valores de control.

Preparación de oligodesoxinucleótido señuelo compleja (cdODN)

Hemos diseñado un cojinete cdODN secuencias consenso para cuatro factores de transcripción Sox2, Oct4, y c-Myc, siguiendo el principio establecido por Gao et al. [18]. oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla fosforotioato se sintetizaron por IDT incorporación (Coralville, IA). Los ODNs se lavaron en 70% de etanol, se secaron y se disolvieron en tampón Tris esterilizada-EDTA (Tris 10 mM + EDTA 1 mM). El sobrenadante se purificó usando columnas Micro Bio-SPIN30 (BioRad, Shanghai) y se cuantificó por espectrofotometría. Los dODNs de doble cadena se prepararon a continuación, por recocido oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla complementarios por calentamiento a 95
oC durante 10 min seguido de enfriamiento a temperatura ambiente (RT) lentamente durante 2 h. Para mayor comodidad, hemos designado esta cdODN-SOC. Un fragmento de control negativo (NC-cdODN) que lleva la sustitución de pares de bases también fue sintetizado.

ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)

EMSA se llevó a cabo según los procedimientos descritos en Gao et al. [18]. En pocas palabras, cdODN-SOC o NC-ODN se marcó con [
32P γ-] ATP. Después, la muestra se cargó en la columna G-25 y se centrifugó a 7000
g
por 2 min. Las proteínas humanas recombinantes Sox2, Oct4 y c-myc fueron (Santa Cruz Biotechnology) se incubaron por separado cdODN-SOC o NC-ODN a TA durante 15 min en 10 l de H
2O y 8 l de mezcla maestra (12 × ) que contiene 1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M EDTA, 5 M NaCl, 1 M de ditiotreitol, 50% de glicerol, 100 g /l de albúmina de suero bovino, y 1 g /l de poli (dIdC). Para los experimentos de supershift, anticuerpos (1 g) se incluyeron en la reacción. Para los experimentos de competición, se añadió sin marcar cdODN-SOC en exceso de 100 veces de las dODNs etiquetados en las reacciones de unión. complejos de ADN-proteína fueron separados por no desnaturalizante en gel de poliacrilamida (7,5% en 0,4 × Tris-borato EDTA /) electroforesis. Los geles se secaron y se filmaron.

La transfección de cdODN-SOC en líneas celulares

El SP ordenados o células NSP se transfectaron con cdODN-SOC utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen China Limited, Shanghai). Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Al 50% de confluencia, las células se lavaron con medio libre de suero una vez y luego se incubaron con 50 l fresco de suero bovino fetal (FBS) medio exento. ODNs Decoy de concentraciones variables y lipofectamina (0,25 l) se mezclaron por separado con 25 l de Opti-MEM® I medio de suero reducido (Invitrogen China Limited, Shanghai) durante 5 min. A continuación, las dos mezclas se combinaron y se incubaron durante 20 min a TA. La lipofectamina: mezcla cdODN se añadió gota a gota a las células y se incubó a 37 ° C durante 5 h. Posteriormente, se añadieron 25 l de medio fresco que contiene 30% de SFB al pozo y se mantuvieron las células en el cultivo hasta su uso.

Administración de cdODN-SOC a /c ratones desnudos BALB

Cuando tamaño del tumor alcanzó ~ 200 mm
3 (aproximadamente 7 días después de la inoculación), cdODN-SOC se administró diariamente por una única inyección intratumoral (20 l de 100 nM cdODN-SOC mezclados con Lipofectamine 2000). El crecimiento tumoral se controló con regularidad, y el volumen (V) de los tumores en el día 5 después del tratamiento cdODN-SOC se calculó utilizando la fórmula V = 1/2 x longitud x (anchura)
2.

Datos El análisis

los datos se presentan como media ± SEM para todos los datos experimentales. Grupo comparaciones se realizaron mediante ANOVA de una vía. Análisis post hoc de los efectos principales significativos fueron examinadas usando pruebas más PLSD de Fisher. Una de dos colas
P
& lt; 0,05 fue tomada valor para indicar una diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 11.5 y ajuste de curvas se realizó en el software GraphPad Prism.

Resultados

Características de las líneas celulares de cáncer de páncreas humano en cultivo

En cultivo normal de oxígeno medio, las líneas celulares de cáncer de páncreas humano (h-PCCLs) PANC-1, SW1990, y BxPC-3 todo demostrado límites de células claras, rica citoplasma, núcleo diferenciado, y nucleolos visible, muchas células en división en curso con incluso la morfología celular principalmente en la forma poligonal de tipo epitelial y rara vez en la forma de husillo en un microscopio invertido (Figura 1A). Bajo condiciones de cultivo hipóxicas, sin embargo, límites de las celdas se convirtieron en brumoso y tamaño de las células se hicieron más grandes, pero con citoplasma encogido, núcleo ampliada, y nucléolo difusa con menos células en división y las células en forma de huso más.

(A) microfotografías representativas de células PANC-1 y BxPC-3 72 h después de la siembra. (B) & amp; (C) Curvas de crecimiento de las células PANC-1 y BxPC-3. Los símbolos son los datos experimentales y las curvas representan los mejores ajustes a la ecuación de crecimiento exponencial: y = Y0 × exp (k × X), donde Y0 es el valor de Y cuando X (tiempo) es cero y K es la constante de velocidad. τ es la constante de tiempo (día) y DT (-tiempo de duplicación) está en las unidades de tiempo del eje X, calculadas como ln
2 /K.

El crecimiento de la PANC-1 y se evaluó BxPC-3 células. Con igual densidad de siembra inicial, estas células mostraron tasas similares de crecimiento en condiciones de normoxia. Tres días después de la siembra, las células entraron en la fase de crecimiento logarítmico y formaron una zona de crecimiento que fue expandiendo gradualmente radialmente. Las células tenían la morfología uniforme y alineados ordenada (Figura 1B). En comparación, bajo condiciones de cultivo hipóxicas, el crecimiento celular se redujo sustancialmente sin aparente fase de crecimiento logarítmico (Figura 1C). Las células fueron desordenados y las células dentro de la zona de crecimiento mostraron morfología heterogénea.

Identificación de células SP a partir de líneas celulares de cáncer de páncreas humano y los efectos de cdODN-SOC

De acuerdo con nuestro análisis Hoechst33342-FACS, la h-PCCLs PANC-1, SW1990, y BxPC-3 todo contenía una pequeña subpoblación de células SP con proporciones de 8,7 ± 0,8, 4,6 ± 0,6, y 2,2 ± 0,4%, respectivamente (Figura 2A, B). La fracción SP en las líneas celulares se redujo sustancialmente en presencia de verapamil.

(A) Ejemplos de témpano de análisis de citometría de células SP en presencia o ausencia de 30 mM verapamil, cdODN-SOC (un complejo oligodesoxinucleótido señuelo llevar a
cis
-elementos de Sox2, Oct4 y c-Myc), o NC-ODN (control negativo cdODN). (B) Las proporciones SP como porcentaje de la población total. ***
p Hotel & lt; 0,001
vs
de control; n = 4.

Para explotar si las células SP se pueden convertir a NSP por la orientación de las moléculas clave que determinan la troncalidad de los CAC, hemos probado los efectos de un fragmento de oligodesoxinucleótidos señuelo compleja (cdODN) en SP Células. El oligodesoxinucleótido señuelo compleja (cdODN-SOC) diseñado para este estudio contenía el típico
cis
elementos para Sox2, Oct4, y c-Myc-actuando. Sorprendentemente, después de pretratada con cdODN-SOC durante 48 h, las células SP se casi desaparecieron en los tres h-PCCLs, con 0,05 ± 0,03, 0,03 ± 0,1 y 0,03 ± 0,2% para PANC-1, SW1990, y BxPC-3, respectivamente (Figura 2A, B). Como control negativo, NC-cdODN no alteró significativamente las fracciones de SP en estas líneas celulares.

La secuencia de este cdODN-SOC se muestra en la Figura 3A y la capacidad de este cd-ODN-SOC para unirse proteínas Sox2, Oct4 y c-Myc fue verificado por nuestro EMSA en conjunción con supershift usando anticuerpos dirigidos contra estos factores de transcripción. Como se muestra en la Figura 3B, las bandas pasado indican que la unión cdODN-proteína y las bandas supersfift indica la unión cdODN específico de la proteína.

(A) Las secuencias de la cdODN-SOC llevan
cis
-Elementos de Sox2, Oct4 y c-Myc y el control ODN negativa con reemplazos de nucleótidos (NC-ODN). (B) Los ejemplos de imágenes EMSA que muestra la capacidad de cdODN-SOC para unirse Sox2 recombinante humana, Oct4 o proteína c-Myc. Las bandas de desplazamiento indican las posiciones de los complejos de ADN-proteína y las bandas de supershift indican el ADN de unión de proteínas específicas recogido por el anticuerpo respectivo. etiquetas de carril: 1, sin control de las proteínas; 2: en presencia de cdODN-SOC fría o no marcados; 3: en presencia de cdODN-SOC; 4: en la presencia de NC-ODN; y 5:. con el anticuerpo

La expresión génica diferencial entre SP y células NSP

A continuación comparó la expresión de marcadores de células madre CD133 y ALDH1 (aldehído deshidrogenasa-1) [19, 20], de pluripotencia factores que mantienen Nanog, Sox2 y Oct4, factor de transcripción c-Myc oncogénica, molécula de señalización Notch1, y el gen resistente a la droga ABCG2 [21,22] en SP ordenada y no SP (NSP) las células de QRT-PCR para la nivel de transcripción y Western blot a nivel de proteínas. Como se ilustra en la Figura 4, las células SP de PANC-1 expresaron sustancialmente más abundantes transcripciones de estos genes en comparación con las células de NSP, indicando claramente las características de células madre de células SP. Los resultados de análisis de transferencia Western fueron consistentes con los cambios en los niveles de mRNA (Figura 4B). SP células de otros dos H-PCCLs mostraron cuantitativamente los mismos resultados (Figura S1 y S2 Figura línea).
Expresión
(A) de CD133, ALDH1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-Myc, y Notch1 en el ARNm, determinado por el tiempo real de RT-PCR. Los valores se obtuvieron por primera normalizaron a GAPDH para el control interno y, a continuación presentan como una proporción de más de SP NSP. **
p Hotel & lt; 0,01 SP
vs
NSP; ***
p Hotel & lt; 0,001 SP
vs
NSP; n = 4. (B) Expresión de CD133, ALDH1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-Myc, y Notch1 a nivel de proteínas, determinada por análisis de transferencia de Western. Los valores se obtuvieron por primera normalizaron a GAPDH para el control interno y, a continuación presentan como una proporción de más de SP NSP. CD133: 120 kDa; ALDH1: 55 kDa; ABCG2: 72 kDa; Sox2: 40 kDa; Oct4: 45 kDa; Nanog: 35 kDa; c-Myc: 62 kDa; Notch1: 300 kDa. ** P & lt; 0,01 SP
vs
NSP;