Extracto
Para probar la hipótesis de que la orientación concomitante del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) puede ofrecer un nuevo enfoque terapéutico en el cáncer de páncreas, el silenciamiento EGFR por la interferencia de ARN (shEGFR) se combinó con TGF-β secuestro por el receptor soluble de TGF-β II (sTβRII). Se monitorizaron Efectos sobre la formación de colonias en cultivo de 3 dimensiones, la formación de tumores en ratones desnudos, y la señalización aguas abajo. Tanto en células T3M4 ASPC-1 y, o bien shEGFR o sTβRII inhibió significativamente la formación de colonias. Sin embargo, en las células ASPC-1, la combinación de shEGFR con sTβRII reduce la formación de colonias más eficiente que cualquiera de los enfoques solo, mientras que en las células T3M4, shEGFR mediada por la inhibición de la formación de colonias fue revertida por sTβRII. Del mismo modo,
in vivo
crecimiento de los tumores derivados de ASPC-1 fue atenuada por cualquiera shEGFR o sTβRII, y fue suprimida significativamente por ambos vectores. Por el contrario, los tumores derivados de T3M4 o bien dejaron de formar o eran muy pequeños cuando EGFR solo fue silenciado, y estos efectos fueron contrarrestados por sTβRII debido al aumento de la proliferación de células cancerosas. La combinación de shEGFR y sTβRII disminuyó fosfo-HER2, HER3-fosfo, los niveles de fosfo-src (Tyr416) phoshpo-ERK y en las células ASPC-1, pero aumentó sus niveles en las células T3M4. Por otra parte, la inhibición de los receptores EGFR y HER2 por lapatinib o de src por SSKI-606, PP2, o dasatinib, bloqueó el antagonismo mediada por sTβRII de la formación de colonias de células T3M4. En conjunto, estas observaciones sugieren que la orientación de forma concomitante EGFR, TGF-β, y src puede constituir un nuevo enfoque terapéutico en PDAC que impide deletéreo diafonía entre miembros de la familia EGFR y vías de TGF-β-dependientes
Visto.: Deharvengt S, M Marmarelis, Korc M (2012) la focalización concomitante de receptor EGF, TGF-beta y Puntos Src a una nueva forma terapéutica en el cáncer de páncreas. PLoS ONE 7 (6): e39684. doi: 10.1371 /journal.pone.0039684
Editor: G. Hidayatullah Munshi, Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Abril, 2012; Aceptado: 29-may de 2012; Publicado: 27 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Deharvengt et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer (NCI) conceder CA-R37-075059 (MK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos, con una tasa de supervivencia a 5 años, de 6% [1]. Estas estadísticas deprimentes se deben, en parte, a la etapa avanzada del cáncer en la presentación, una baja tasa de resecabilidad, múltiples alteraciones moleculares que promueven el crecimiento de células de cáncer de páncreas y la supervivencia, marcada quimio-resistencia, e intenso desmoplasia que atenúa la penetración del fármaco [2] - [5]. PDAC se asocia con una alta frecuencia de mutaciones en el K-
ras
oncogén (95%), y el p16 (85%), p53 (75%) y SMAD4 (55%) genes supresores de tumores [4 ]. Por otra parte, cuando el gen p16 no está mutado, se silenció epigenetically [6]. Hay también una expresión elevada del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (EGFR), otros receptores de tirosina quinasa y sus ligandos, y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) isoformas [7]. EGFR media cascadas de señalización mitogénica y motogénica células autónomas mediante la activación de diversas vías, incluyendo la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), MAPK p38, y Jun quinasa (JNK), mientras que TGF-β activa Smad-dependiente y señalización -independiente y se cree que ejercen efectos paracrinos sobre las células dentro del tumor en mircroenvironment PDAC [8] - [10].
el exceso de activación del EGFR y la señalización disfuncional por el receptor de TGF-β (TβR) dependientes de las vías, como se observa en la PDAC, genera múltiples interacciones autocrinos y paracrinos aberrantes entre las células cancerosas y el microambiente tumoral que contribuyen a la desmoplasia tumor y que pueden cruzarse con una u otra de las señalización docena de cascadas que están implicados en la mayoría de los PDAC [5], [11]. Lamentablemente, la orientación de EGFR prolonga ligeramente la supervivencia de los pacientes con PDAC, y sólo cuando se administra en combinación con gemcitabina [12], mientras que las terapias anti-TGF-beta para PDAC están siendo desarrolladas y probadas en estudios pre-clínicos [13] Actualmente - [15].
establecido recientemente un sistema de cultivo de 3 dimensiones en el que están incrustadas las células en Matrigel que consta de 3% de colágeno IV /medio gelatinoso laminina-enriquecido y se coloca sobre una capa solidificada de agar blando [16] . Se determinó que el tratamiento concomitante con TGF-β1 y el crecimiento EGF reforzada en este sistema de modelo 3-D en un grado mayor que cualquiera de los factores de crecimiento solo, y confirieron aumento de quimiorresistencia a los compuestos citotóxicos [16]. Por otra parte, la inhibición farmacológica de TβRI con SB431542 o EGFR con erlotinib mejoró la eficacia de gemcitabina y cisplatino en células de cáncer de páncreas humano y en cultivos de células primarias establecidas a partir de páncreas de modelos de ratones genéticamente modificados de PDAC [16], lo que subraya la utilidad de este 3 -D sistema de cultivo para probar la eficacia de los agentes terapéuticos.
a la vista de la importancia de EGFR y TGF-β en la PDAC, hemos tratado de probar la hipótesis de que la orientación de ambas vías pueden ejercer efectos beneficiosos de crecimiento supresores de que son mayores que la supresión ya sea vía solo. Debido a que los inhibidores de moléculas pequeñas que se dirigen a EGFR y TβRI pueden ejercer efectos no específicos y /o se pueden orientar quinasas estrechamente relacionadas, se utilizó un enfoque más específico que consiste en una estrategia de silenciamiento para suprimir la expresión de EGFR y una estrategia TβRII soluble para secuestrar los ligandos TGF-β . Ahora informe que la supresión simultánea de ambas vías atenuadas la formación de colonias de 1 ASPC células humanas de cáncer de páncreas crecidas en cultivo y el crecimiento tumoral 3-D
in vivo
, pero la orientación TGF-β invirtió los efectos inhibidores del crecimiento ejercidas por silenciamiento de EGFR en células de cáncer de páncreas humano T3M4, y este cambio producido en conjunción con la activación src como se refleja en el aumento de la fosforilación de la tirosina en src 419.
Resultados
Efectos de EGFR Derribo y Expresión en sTβRII Formación de colonias
líneas celulares de cáncer de páncreas humanos expresan factor de crecimiento transformante alfa (TGF-α) y otros factores de crecimiento que activan EGFR [17] - [19], así como los tres TGF-betaS [20]. Para determinar si la derogación de EGFR y TGF-β señalización modula el crecimiento de dichas líneas celulares, ASPC-1 y células T3M4 fueron co-infectados a una moi de 10 para cada virus con shRNA-lentivirus la orientación de la luciferasa (shLuc-LV con pWPT-GFP), EGFR (shEGFR-LV con pWPT-GFP), sTβRII (hLuc-LV con pWPT-sTβRII), o ambos EGFR y sTβRII (shEGFR -lv con pWPT-sTβRII). shEGFR-LV suprime eficientemente los niveles de EGFR, mientras que la expresión pWPT-sTβRII se asoció con la presencia de abundantes niveles de proteína sTβRII en el medio en las cuatro líneas celulares (Fig. 1A).
(A) ASPC-1 y las células de cáncer de páncreas humanos T3M4 se infectaron con shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), WPT-sTβRII (sTβRII), o ambos shEGFR y sTβRII. Los lisados celulares y medios acondicionados se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-HA-tag anti-EGFR y, respectivamente, este último sirve para confirmar la liberación sTβRII por las células cancerosas. Un anticuerpo anti-ERK sirvió para evaluar la carga de carril. (B) Las consecuencias de EGFR silenciamiento con shEGFR y secuestro de TGF-β con sTβRII se evaluaron mediante el control de la formación de colonias en cultivo de 3-D (B). Los datos son la media ± SE de las determinaciones por triplicado a partir de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, en comparación con los controles respectivos
Las consecuencias de silenciamiento EGFR y secuestro de TGF-β se evaluaron siguiente mediante el control de la formación de colonias en un ensayo de cultivo de 3-D. en el que Matrigel proporciona un andamio acelular y agar blando apoya anclaje independiente de crecimiento [16]. Se optó por utilizar este sistema modelo en 3-D, ya que hemos demostrado que el tratamiento concomitante con TGF-β1 y EGF en este modelo de crecimiento mejorado en un grado mayor que cualquiera de los factores de crecimiento solos [16], la recapitulación de ese modo el tumor de TGF-β efectos promotores previamente demostrada en modelos de xenoinjerto y de ratón ortotópico de PDAC [13] - [14]. La formación de colonias con células ASPC-1 infectadas con pWPT-sTβRII o shEGFR-LV se redujo en un 21% (p & lt; 0,05) y 33% (p & lt; 0,01), respectivamente, mientras que la infección con ambos shEGFR-LV y pWPT-sTβRII dio lugar a un 56% (p & lt; 0,01) disminución en el número de colonias en comparación con shLuc expresan ASPC-1 en las células (Fig 1B.). Por el contrario, después de la infección con shEGFR-LV, la formación de colonias por las células T3M4 se redujo en un 45% (p & lt; 0,05), mientras que pWPT-sTβRII atenúa la formación de colonias en las células T3M4 en un 27% (p & lt; 0,05). Sin embargo, pWPT-sTβRII revirtió completamente las acciones inhibidoras de shEGFR-LV sobre la formación de colonias (Fig. 1B). Por lo tanto, las células ASPC-1 mostró efectos inhibidores sinérgicos sobre la formación de colonias cuando están infectadas con ambos shEGFR-LV y pWPT-sTβRII, mientras que en las células T3M4 hubo reversión paradójica por pWPT-sTβRII de las acciones inhibidoras de shEGFR-LV.
Para determinar si otras células de cáncer pancreático alineados que se comporta como células T3M4, a continuación realizó el ensayo de formación de colonias se detalla en COLO-357 y PANC-1 células de cáncer de páncreas (Fig. S1). COLO-357 células fueron sólo inhibe el crecimiento en respuesta a la caída concomitante de EGFR y la expresión sTβRII. Por el contrario las células PANC-1 fueron inhibidas por el crecimiento knockdown EGFR, pero mostraron una inversión de este efecto inhibidor del crecimiento en presencia de sTβRII (Fig. S1).
Efectos in vivo de EGFR Desmontables y Expresión sTβRII
a continuación examinó las consecuencias de silenciamiento EGFR y expresión sTβRII en un modelo de tumor de ratón desnudo subcutánea, para determinar si la reversión paradójica de EGFR silenciamiento observó en el 3-D
in vitro
modelo también se produjo
in vivo
. En comparación con los tumores generados por las células ASPC-1 infectadas con shLuc-LV, volúmenes de los tumores en el día 24 se redujeron en un 36% (p & lt; 0,05) con shEGFR-LV, 38% (p & lt; 0,05) con pWPT-sTβRII, y 85% (p & lt; 0,01) con los dos vectores (Fig 2A.). Además, 2 de 8 ratones inyectados con pWPT-sTβRII que expresan ASPC-1 en las células estaban libres de tumor. Dramáticamente, 4 de 8 ratones inyectados con células ASPC-1 que expresan tanto pWPT-sTβRII y shEGFR-LV estaban en día 24 libre de tumor, y los 4 tumores restantes únicamente se hicieron visibles 21 días después de la inyección de las células cancerosas. En el caso de los tumores derivados de T3M4, los experimentos se terminaron en el día 16 debido al rápido crecimiento del tumor en dos de los cuatro grupos. En este punto de tiempo, el volumen del tumor se redujo en un 37% (p & lt; 0,05) para las células infectadas con pWPT-sTβRII y por 97% (p & lt; 0,01) para las células infectadas-LV shEGFR (Fig. 2B). Por el contrario, las células infectadas con T3M4 tanto pWPT-sTβRII y shEGFR-LV formaron tumores grandes, cada uno de los cuales exhiben áreas de necrosis (Fig. 2B).
células
ASPC-1 (A) y (B) T3M4 estaban infectados con shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), sTβRII, o ambos EGFR-LV y sTβRII, y se inyecta por vía subcutánea (una inyección por ratón) en la región del flanco de ratones desnudos. Los volúmenes tumorales fueron monitorizados para el número indicado de días. Los valores son la media ± SEM de 8 ratones por grupo, se indica en el denominador de la derecha de cada curva. El número de tumores que se formaron en cada grupo se indica en el numerador. * P & lt; 0,05, y ** p & lt;. 0,01, en comparación con los controles respectivos
Los tumores que surgen a partir de cualquiera de las células ASPC-1 o T3M4 exhibidos abundante Ki-67 inmunoreactividad y focos de CD-31- células endoteliales positivas (Fig. 3A). En los tumores derivados de ASPC-1, la expresión de pWPT-sTβRII no alteró la proliferación, mientras que la expresión de shEGFR-LV se asoció con un 60% (p & lt; 0,05) disminución tanto Ki-67 y CD31 inmunoreactividad, y la expresión de ambos vectores causado una disminución adicional en Ki-67 (72%, p & lt; 0,01) y CD31 (76%, p & lt; 0,01) inmunoreactividad (Fig. 3A). En las células T3M4, la expresión de pWPT-sTβRII se asoció con disminución de la proliferación (40%, p & lt; 0,01) y la angiogénesis (77%, p & lt; 0,01), la expresión de shEGFR-LV no alteró significativamente la proliferación pero disminuyó notablemente inmunorreactividad CD31 (71 %, p & lt; 0,01), mientras que la expresión de ambos vectores aumentó notablemente la proliferación de células de cáncer (196%, p & lt; 0,01) a pesar de una disminución persistente (85%, p & lt;.. 0,01) en CD31 inmunoreactividad (figura 3A)
A. Los ASPC-1 y derivados de T3M4 tumores descritos en la figura 2 se immunostained para Ki67 para evaluar la proliferación y CD31 para evaluar la angiogénesis. B. Los mismos tumores se anotó para células TUNEL-poisitive y troceados inmunorreactividad PARP para evaluar la apoptosis. Los datos son la media ± SEM de determinaciones por triplicado a partir de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, y ** p & lt; 0,01, en comparación con los controles respectivos
A la vista de la presencia de regiones de necrosis en los tumores que expresan tanto T3M4 pWPT-sTβRII y shEGFR-LV, ella. era importante evitar resultados falsos que pueden ocurrir en áreas que van a sufrir necrosis. Por lo tanto, tanto el ensayo de TUNEL y se escindió inmunotinción PARP se realizaron junto a evaluar la apoptosis, ambos métodos que producen resultados generalmente concordantes (Fig. 3B). Por lo tanto, pWPT-sTβRII no alteró significativamente el porcentaje de células que experimentan apoptosis en cualquiera de los tumores ASPC-1 o drived-T3M4, mientras que la expresión shEGFR-LV se asoció con un aumento marcado en la apoptosis en las células ASPC-1 (p & lt; 0,01), pero no en células T3M4. Por otra parte, en los tumores derivados de ASPC-1, pWPT-sTβRII no alteró la apoptosis shEGFR-LV-asociado, pero en los tumores derivados de T3M4 se asocia con aumento de la apoptosis (Fig. 3B).
Efectos de EGFR Expresión desmontables y sTβRII sobre la fosforilación de EGFR Estado miembros de la familia
EGFR, HER2 y HER3 han sido implicados en la patobiología del PDAC [7], [21] - [23]. Desde EGFR forma heterodímeros con HER2 y HER3, era importante determinar si su silenciamiento podría modular la señalización de estos miembros de la familia EGFR. Por lo tanto, ASPC-1 y T3M4 lisados de células se sometieron a inmunotransferencia para evaluar los niveles de fosfo-HER2, y fosfo-HER3 (Fig. 4A). El análisis densitométrico de los datos de tres experimentos mostró que la expresión pWPT-sTβRII en células ASPC-1 indujo una disminución del 17% y 20% en los niveles, respectivamente fosfo-HER2 y fosfo-HER3 (p & lt; 0,05), mientras que EGFR desmontables indujo un 61% disminución de los niveles de fosfo-HER2 (P & lt; 0,01) y una disminución del 30% en fosfo-HER3 (p & lt; 0,01) los niveles. células ASPC-1 que expresan tanto shEGFR-LV y pWPT-sTβRII mostraron una disminución similar en los niveles de fosfo-HER2 (52%, p & lt; 0,01), pero una disminución más pronunciada en los niveles de fosfo-HER3 (56%, p & lt; 0,01). Por el contrario, en las células T3M4, pWPT-sTβRII no alteró los niveles de fosfo-HER2 o fosfo-HER3, mientras que EGFR desmontables se asocia con aumento de los niveles de ambos fosfo-receptores (Fig. 4A). En tres experimentos, hubo un aumento del 60% en fosfo-HER2 y los niveles de fosfo-HER3 en las células T3M4 siguientes knockdown EGFR, y 100% y 80% de incremento en fosfo-HER2 y los niveles de fosfo-HER3, respectivamente, en células que expresan ambos vectores .
(A) Efectos sobre la fosforilación del receptor. células ASPC-1 y T3M4 se infectaron como se indica con shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), WPT-sTβRII (sTβRII), o ambos shEGFR y sTβRII. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos dirigidos contra los receptores indicados y receptores fosfo. (B) Las células se infectaron como se indica en A, y los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos dirigidos contra las proteínas indicadas y fosfo-proteínas. Cada panel muestra los datos de un representante de al menos dos experimentos independientes. Tanto en los grupos A y B, immnoblotting con un anticuerpo anti-ERK confirmó carga carril equivalentes, pero no se muestran todas las transferencias de ERK.
Para determinar si HER2 y HER3 fosforilación también fue modulada
In vivo
en células T3M4, los tumores derivados de estas células fueron evaluados por immunohistochemsitry (Fig. S2). Moderado inmunorreactividad fosfo-HER2 fue evidente en los tumores de células infectadas con shLuc, y shEGFR-LV, que se redujo en los tumores infectados con pWPT-sTβRII, pero aumentó en los tumores que expresan ambos vectores. Por el contrario, fosfo-HER3 inmunoreactividad fue baja en los tumores de células T3M4 infectados por shLuc, un ligero aumento en los tumores, un aumento moderado en los tumores shEGFR-LV-expresan, y marcadamente elevados en los tumores que expresan ambos vectores (Fig pWPT-sTβRII expresan. S2 ). De este modo, tanto HER2 y HER3 se activan aberrantemente
in vivo en las células
T3M4 cuando ambos EGFR y vías de TGF-beta han sido atacados.
Efectos de EGFR y Derribo sTβRII expresión de señalización corriente abajo
ERK, src, y AKT son mitogénica y módulos que están aguas abajo de miembros de la familia EGFR y que contribuyen a la progresión de la PDAC [12] señalización pro-supervivencia, [24]. Por lo tanto, ASPC-1 y lisados de células T3M4 se sometieron a inmunotransferencia para evaluar los efectos de la caída EGFR y expresión sTβRII en estas vías (Fig. 4B). En células ASPC-1, shEGFR-LV, pWPT-sTβRII, y su combinación se asoció con niveles de fosfo-ERK atenuadas, pero sólo la combinación de disminución de los niveles de fosfo-AKT mientras que ninguna de estas condiciones de transfección inducidas la des-fosforilación de Src (Tyr527 ), lo que sería un reflejo de la activación de src (Fig. 4B). Por el contrario, en las células T3M4, shEGFR-LV sola o en combinación con pWPT-sTβRII resultó en un incremento de fosfo-ERK y la disminución de fosfo-src (Tyr527) niveles, sin alteraciones en los niveles de fosfo-AKT (Fig. 4B).
para confirmar que la combinación de shEGFR-LV y pWPT-sTβRII activada en las células src T3M4, lisados se sometieron también a una matriz de anticuerpos fosfo-quinasa. silenciamiento EGFR condujo a la inhibición de la fosforilación de src (Tyr419), Fyn, Hck, Lyn, Yes y FGR, que fue especialmente pronunciado con respecto al src (Fig. 5). Por el contrario, la expresión de sTβRII inhibe la fosforilación de Lyn Sí, y Fgr, sin alterar src, Fyn o Hck fosforilación (Fig. 5). Sin embargo, los efectos inhibidores de shEGFR-LV en los 6 quinasas fueron completamente revertidas por sTβRII (Fig. 5), lo que indica que la expresión de sTβRII reactivado quinasas de la familia src.
células T3M4 se infectaron con shLuc-LV (shLuc ), shEGFR-LV (shEGFR), y /o WPT-sTβRII (sTβRII) como se indica. Los lisados celulares se analizaron a continuación con una matriz de anticuerpos fosfo-quinasa para evaluar el estado de fosforilación de los miembros de la familia src indicados. Los resultados se cuantificaron como se describe en Métodos. Los datos son la media ± SEM de determinaciones por triplicado a partir de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt; 0,001 en comparación con el control
Efectos de HER2 silenciamiento y la inhibición src en la formación de colonias de células T3M4
a continuación trató de evaluar el papel de HER2 en la mediación de los efectos deletéreos de EGFR de orientación simultánea y TGF-β. Como era de esperar, shEGFR-LV marcadamente suprimida niveles de EGFR en las células T3M4, shHER2-LV marcadamente suprimida niveles de HER2, mientras que la infección con ambos vectores silenciado la expresión de EGFR y HER2 (Fig. S3). Además, las células que expresan bien T3M4 shEGFR-LV o shHER2-LV mostraron una disminución significativa en el número de colonias en el ensayo de 3-D (Fig. 6A). En el caso de shEGFR-LV, pero no shHER2-LV o shEGFR-LV junto con shHER2-LV, este efecto se invirtió por pWPT-sTβRII (Fig. 6A). el crecimiento de colonias Así, la infección concomitante con shEGFR-LV y shHER2-LV marcadamente inhibida (66%, p & lt; 0,01). Del mismo modo, lapatinib (1 M), un inhibidor de quinasa dual de la tirosina que interrumpe HER2 y EGFR vías de señalización, reducido número de colonias por 47% (p & lt; 0,01) e impidió la reversión observada después de co-infección con shEGFR-LV y pWPT-sTβRII ( La Fig. 6).
A. silenciamiento HER2 y la inhibición. células T3M4 se infectaron con shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), shHER2-LV (shHER2), o ambos shEGFR y shHER2, en ausencia o presencia de WPT-sTβRII (sTβRII) o lapatinip 1 M. La formación de colonias se monitorizó en la cultura 3-D. Los datos son la media ± SEM de determinaciones por triplicado a partir de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, y ** p & lt; 0,01, en comparación con el control. B. Efectos de la inhibición de c-Src. células T3M4 se incubaron en ausencia o presencia de los inhibidores de la quinasa src SKI-606 (1 M), PP2 (1 M) y dasatinib (100 nM), y se determinaron los efectos sobre la formación de colonias en cultivo de 3-D. Los datos son la media ± SE de las determinaciones por triplicado a partir de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, en comparación con los controles respectivos
A la vista de la sobre regulación de fosfo-src (Tyr419) y la desfosforilación de Src (Tyr527) por el. combinación de shEGFR-LV y pWPT-sTβRII en T3M4 células, hemos tratado de determinar si los efectos nocivos de esta combinación pueden estar mediados por src activado. Por lo tanto, los efectos de tres inhibidores de src distintos en la formación de colonias en cultivo 3-D se examinaron siguiente. Sólo dasatinib (100 nM) inhibió significativamente el crecimiento de las células infectadas con T3M4 shLuc-LV (Fig. 6B). Sin embargo, SKI-606 (1 M), PP2 (1 M), y dasatinib (100 nM) bloqueó completamente la inversión mediada por pWPT-sTβRII de inhibición del crecimiento inducida por shEGFR-LV (Fig. 6B), lo que indica que este efecto era dependiente de la actividad quinasa src.
Discusión
los miembros de la familia del EGF, incluyendo TGF-α, factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF), betacelulina, y anfirregulina, son expresado en altos niveles en PDAC y actuar sobre las células cancerosas en PDAC y en los elementos estromales adyacentes [7]. la activación del EGFR por estos ligandos inicia múltiples cascadas de señalización, tales como Ras /Raf /MAPK y Rac /JNK /MAPK-p38 [24]. heterodimerización EGFR con otros miembros de la familia EGFR conduce a la activación de otras vías de señalización que incluyen Src, Raf1, B-Raf, Crk, y Nck, que promueven la progresión del tumor y la agresividad biológica [25]. diafonía EGFR con múltiples vías se ve reforzada por la alta frecuencia de mutaciones de KRAS y Smad4, y por la abundancia de TGF-β que altera la matriz extracelular de una manera que promueve el crecimiento de células de cáncer, induce interacciones epitelio-mesenquimal aberrantes, mejora la angiogénesis, y promueve la metástasis [4] - [7], [10], [13] - [14], [26] - [27]. Por otra parte, el TGF-β sinergia con EGF en la promoción de la proliferación en cultivo de 3-D [16]. En conjunto, estas observaciones sugieren que el EGFR aberrante y TGF-β-dependiente vías de señalización son fundamentales en la promoción de la progresión del cáncer de páncreas y pueden representar dianas terapéuticas cruciales en PDAC.
En el presente estudio hemos demostrado que el silenciamiento basado en lentiviral de EGFR atenúa eficazmente sus acciones pro-mitogénica en 3 de 4 líneas celulares de cáncer de páncreas, y que el secuestro basada en lentiviral de TGF-β también atenúa la proliferación en cultivo de 3-D en las mismas tres líneas celulares. Sin embargo, en ASPC-1 y las células COLO-357, de forma concomitante silenciamiento EGFR y secuestrantes TGF-β dado lugar a la supresión del crecimiento mejorado, mientras que en las células T3M4 y PANC-1 había reversión casi completa de los efectos de crecimiento supresores de EGFR abajo-regulación . En condiciones de cultivo de tejidos estándar, células ASPC-1 y T3M4 son resistentes a la inhibición del crecimiento mediada por TGF-β, mientras que COLO-357 y las células PANC-1 son el crecimiento inhibido por el TGF-β [19], [28]. Por lo tanto, la inversión paradójica observada no se puede atribuir a las diferencias en la capacidad de respuesta inhibidora del crecimiento de las células cancerosas. En cambio, en las células T3M4, este cambio se debe, en parte, a la regulación de fosfo-HER2 y HER3 fosfo-EGFR provocada por regulación a la baja y el aumento en la presencia de sTβRII. De acuerdo con esta conclusión, los efectos inhibidores del crecimiento inducida por silenciar HER2 o EGFR y HER2 no fueron contrarrestados por sTβRII. Del mismo modo, lapatinib, que inhibe ambas actividades de EGFR y HER2 quinasa, también inhibió el crecimiento de células T3M4 y este efecto era resistente a la inversión mediada por sTβRII. ERK puede ser activado por múltiples señales de aguas arriba, y el aumento de HER2 /3 fosforilación en células T3M4 se asoció en el presente estudio con aumento de la fosforilación de ERK, lo que indica que HER2 /3 de señalización aguas abajo también se está activando
.
Varias líneas de evidencia sugieren que la activación mediada por el secuestro de src TGF-β también es crucial para el fenómeno de reversión. En primer lugar, la inhibición src por el silenciamiento de EGFR fue completamente revertido por el secuestro de TGF-β. En segundo lugar, EGFR señalización es conocida por activar src [29], y la activación src se sabe que inducen la liberación de los precursores de ligandos similares a EGF [6] y atenuar EGF internalización [29], [30]. Estos mecanismos pueden promover la heterodimerización de EGFR con HER2 y HER3, mejorando más por ello la señalización mitogénica. En tercer lugar, sTβRII incrementó los niveles de fosforilación de la tirosina src en 419 residuos en T3M4, y la fosforilación en este sitio se correlaciona con una mayor actividad src. Por otra parte, sTβRII no alteró la fosforilación de Src (Tyr527) en células ASPC-1, pero disminuyó su fosforilación en las células T3M4 en ausencia y presencia de shEGFR, confirmando que se src siendo activado en las células T3M4 por sTβRII. En cuarto lugar, tres inhibidores de la quinasa Src, SKI-606, PP2 y dasatinib, bloquearon la reversión mediada por TβRII de inhibición del crecimiento.
Hemos determinado que la adición de la proteína purificada sTβRII al medio de estas células también secuestra TGF-ß y bloquea las acciones de TGF-β
in vitro gratis (observaciones no publicadas). TGF-β se une al tipo II homodímero de TGF-β receptor (TβRII), que luego forma un complejo con el homodímero heterotetrameric TβRI, que conduce a la activación de la actividad de serina-treonina quinasa TβRI [9]. Esta activación inicia una cascada de señalización que incluye la fosforilación de Smads regulados por el receptor (R-Smads), Smad2 y Smad3, en su motivo SSXS C-terminal, su oligomerización posterior con el mediador común Smad4, y la translocación del complejo al núcleo donde a continuación se efectúa la regulación de la transcripción de genes [9], [31]. TβRII también puede ser fosforilada en la tirosina 284 residuos que conduce a la activación de las vías alternativas, tales como p38 MAPK [32]. Si bien la activación src menudo se produce aguas abajo de receptores de tirosina quinasa, TGF-β también puede aumentar la actividad src, pero de una manera transitoria [33]. Sin embargo, TGF-β también actúa para inducir la degradación src [34]. Es posible, por tanto, que el secuestro de TGF-β en células T3M4 puede prevenir el cáncer derivado de células de TGF-β de la inducción de la degradación src y /o inactivación.
Para evaluar la importancia biológica de estos
in vitro
la hallazgos, se utilizó un modelo de ratón desnudo subcutánea que permite la evaluación reproducible de la
in vivo
relevancia biológica de las vías de señalización que son alterados
in vitro
. Por lo tanto, con respecto a las células ASPC-1, ya sea EGFR baja regulación o el secuestro de TGF-β resultó en significativa (36-38%) disminuye en el volumen tumoral, con una disminución adicional de 85% cuando se combinaron ambos enfoques. Sorprendentemente, los tumores no lograron formar en 2 de 8 ratones inyectados con células ASPC-1 que expresa pWPT-sTβRII, y en 4 de 8 ratones que expresan tanto pWPT-sTβRII y shEGFR-LV. Además, hubo un marcado retraso en la aparición de los 4 tumores que surgieron a partir de células que expresan tanto pWPT-sTβRII y shEGFR-LV, todos los cuales exhiben en gran medida disminución de la proliferación y la angiogénesis, y el aumento de la apoptosis. Estos hallazgos apoyan las estrategias para la orientación de TGF-β en PDAC [13], [14], [35], y son consistentes con la observación de que existe una fuerte EGFR
In situ
señal de hibridación en la vasculatura tumoral en PDAC en los seres humanos [36] y con funciones propuestas de EGFR en la angiogénesis tumoral. Si bien la orientación de TGF-ß por el secuestro de ligando o por la inhibición de la quinasa TβRI atenúa el crecimiento del tumor de páncreas y metástasis en modelos de ratón [13] - [15], nuestros resultados indican que, vías en ciertos casos, dirigidos a los receptores EGFR y TGF-β-dependiente puede ejercer efectos inhibidores sinérgicos sobre la proliferación y la angiogénesis PDAC.
en los tumores derivados de T3M4, el secuestro de TGF-β dio lugar a una disminución del 37% en el volumen tumoral y la disminución de la proliferación y la angiogénesis, mientras que la baja regulación de EGFR como resultado ya sea en el fracaso para formar tumores o en la formación de tumores muy pequeños y la angiogénesis marcadamente atenuada. Así, las células T3M4 son altamente dependientes de EGFR para la iniciación del tumor, la progresión y la angiogénesis
in vivo
, y esta exquisita dependencia de EGFR es consistente con la mitogénesis mediada por EGFR, así como con su papel en la angiogénesis dependiente de la adicción oncogén [37], [38]. Estos efectos dramáticos fueron contrarrestados por sTβRII que restauraron la proliferación, pero no alteran la angiogénesis o apoptosis, lo que resulta en grandes tumores que presentaban focos de necrosis. Por lo tanto, mientras que el
in vitro
y
in vivo
acciones inhibidoras del crecimiento de silenciamiento EGFR fueron contrarrestados por el secuestro de TGF-β, los paracrinos efectos anti-angiogénicos de silenciamiento EGFR y los efectos sobre la apoptosis persistieron, subrayando los efectos pro-mitogénicos de activación src. Por otra parte, se ha demostrado recientemente que la angiogénesis es importante en un modelo de ratón genéticamente modificado impulsado por Kras de PDAC [39], y que forma variante 161R de interleucina-17F (IL-17F), que es un antagonista natural de la anti-angiogénico efectos de tipo salvaje 161h IL-17F, se asocia con un peor pronóstico en PDAC [40], proporcionando evidencia indirecta de que la angiogénesis puede jugar un papel importante en la diseminación metastásica. En vista de estas observaciones, los resultados actuales sugieren que la orientación EGFR y TGF-β puede ser importante para la normalización de la angiogénesis tumoral en el tumor primario y la supresión de la angiogénesis en las lesiones metastásicas en PDAC.
células ASPC-1 y T3M4 albergan KRAS mutado p53 y genes, y expresan altos niveles de EGFR [5], [41]. Estas células también producen altos niveles de TGF-β, TGF-α y anfirregulina [19], [42], que son auto-inducible, TGF-β-inducible, y pro-angiogénico. Por otra parte, las células ASPC-1 albergan un gen mutado SMAD4 [43], mientras que las células de tipo salvaje son T3M4 de Smad4 [44]. Como tales alteraciones, células ASPC-1 y T3M4 exposición que sean representativos del espectro de alteraciones moleculares típicos vistos en PDAC.