Extracto
El presente estudio fue diseñado para determinar los efectos biológicos de nuevo análogo de alcaloides marinos 7- (4-fluorobencilamino) -1,3,4,8-tetrahidropirrolo [4,3,2-de] quinolin-8 (1H) -ona (FBA-TPQ) en células de cáncer de ovario humano por su potencial anti-tumor y los mecanismos como un agente quimioterapéutico novela subyacente. células de cáncer de ovario humano (A2780 y OVCAR-3), y células humanas no tumorigénicas inmortalizadas ovárico superficie epitelial (IOSE-144), se expusieron a FBA-TPQ para la evaluación de la citotoxicidad inicial (a través de kit de ensayo de MTS, Promega). El detallado
in vitro (nivel celular)
y
A continuación se realizaron in vivo gratis (modelo animal) estudios sobre los efectos antitumorales y los posibles mecanismos subyacentes de la acción de los compuestos. FBA-TPQ ejercida potente citotoxicidad contra A2780 cáncer de ovario humano y las células OVCAR-3 como un inhibidor eficaz del crecimiento y la proliferación celular, mientras se ejerce efectos menores sobre las células no tumorigénicas IOSE-144. El estudio adicional en la línea celular OVCAR-3 más sensible demostró que podía inducir potencialmente la apoptosis de las células (Anexina ensayo V-FITC), G2 detención del ciclo celular /M (análisis de la tinción PI) y también forma dosis-dependiente inhibir la OVCAR-3 xenoinjertos de tumores ' el crecimiento en ratones desnudos atímicos hembra (BALB /c, nu /nu). Estudios mecanicistas (ambos
in vitro
y
in vivo
) reveló que FBA-TPQ podría ejercer su actividad a través de especies reactivas del oxígeno (ROS) -asociado activación del receptor de muerte, p53-MDM2, y las vías PI3K-Akt en células OVCAR-3, que está de acuerdo con el
in vitro
microarrays (micromatrices genoma humano, Agilent) en el análisis de datos (GEO número de acceso: GSE25317). En conclusión, FBA-TPQ exhibe actividad contra el cáncer significativa contra las células de cáncer de ovario, con una toxicidad mínima para las células no tumorigénicas humanas IOSE-144, que indica que puede ser un agente terapéutico potencial para el cáncer de ovario
Visto:. Chen T, Xu Y, Guo H, Liu Y, Hu P, Yang X, et al. (2011) Terapia Experimental del cáncer ovárico con Makaluvamine sintética análoga:
in vitro
y
En Vivo
Mecanismos moleculares contra el cáncer de actividad y de acción. PLoS ONE 6 (6): e20729. doi: 10.1371 /journal.pone.0020729
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de noviembre de 2010; Aceptado: 11-may de 2011; Publicado: 6 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de cien talentos del programa de la Academia china de Ciencias, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (30870513, 31070680 y 91029715), el Ministerio de Ciencia y Tecnología de china (2007CB947100), la Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai ( 08391910800, 10391902100), Proyecto Principal de Tecnología Nacional de Ciencia y "clave de nuevo fármaco Creación y programa de fabricación" (2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011), la Comisión de Ciencia y Tecnología del Distrito Xuhui de la municipalidad de Shanghai (RCT201001, CRC2010002), director de la Fundación de INS (20090101), el Centro de Investigación de Seguridad Alimentaria y la clave Laboratorio de Nutrición y Metabolismo del INS, SIBS, CAS. R.Z. fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud /Instituto Nacional del Cáncer otorga R01 CA112029 y R01 CA121211. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario, que representa aproximadamente el 5 por ciento de los cánceres de la muerte de la mujer, es ahora el quinto cáncer común en las mujeres en Estados Unidos [1]. Alrededor del 70% de todos los pacientes con cáncer de ovario se diagnostican en las etapas más avanzadas de la enfermedad, lo que lleva a un mal pronóstico [2], [3]. Durante las últimas dos décadas, aunque la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes con cáncer de ovario se ha mejorado sustancialmente gracias a la aplicación de la cirugía exitosa y el desarrollo u optimización de fármacos tumoricida, la supervivencia sigue siendo bajo, aproximadamente un 30% [2] - [4]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos agentes terapéuticos que se pueden utilizar para tratar la enfermedad.
Los organismos marinos son una fuente rica de compuestos potenciales de plomo con propiedades farmacológicas únicas [5], [6]. Numerosos productos naturales marinos con estructuras moleculares nuevas y diversas funciones biológicas se han reportado en las últimas décadas [7]. Makaluvamines, una clase de alcaloides pyrroloiminoquinone marinos aislados de esponjas de los géneros
Zyzzya
, se ha informado que tienen una potente
in vitro e
in vivo
citotoxicidad contra varios cánceres humanos líneas de células, y esta actividad se atribuyó a su actividad como inhibidores de la topoisomerasa II [8] - [14]. Varios otros makaluvamines han demostrado que causa daño en el ADN directa resultando en efectos antitumorales [6], [15].
Hemos sintetizado más de 40 nuevos análogos makaluvamine y evaluado sistemáticamente sus actividades contra el cáncer de mama en las células del cáncer líneas. Nuestros datos muestran que el análogo de makaluvamine potente, FBA-TPQ, podría inhibir el crecimiento del tumor mediante la activación de los supresores de tumores, la inhibición de oncogenes, y la activación de la respuesta al daño de ADN [6], [16]. En el presente informe, hemos ampliado nuestro estudio para evaluar las actividades antitumorales de FBA-TPQ contra las células de cáncer de ovario y tratamos de dilucidar los posibles mecanismos de acción.
Resultados
La
in vitro
citotoxicidad de FBA-TPQ a las células A2780 y OVCAR-3 se evaluaron primero usando el ensayo de MTS (Promega). A2780 y OVCAR-3 y (células inmortalizadas no tumorigénicas de ovario epitelial superficie) humanos de ovario IOSE144 células fueron expuestas a FBA-TPQ (ver Fig. 1A) a diversas concentraciones durante 48 horas. La viabilidad de la A2780 y células OVCAR-3 se redujo significativamente, con IC
50 de 1.780 nM (A2780) y 980 nM (OVCAR-3) (Fig. 1B). La exposición a FBA-TPQ llevó a dependiente de la dosis efectos sobre la supervivencia celular, la inhibición de la viabilidad A2780 por 25.2%, 45.7% y 65.8%, mientras que la inhibición de células OVCAR-3 Viabilidad de 33,9%, 56,7% y 73,7%, respectivamente, para el 0,5, 1,0 y 2,5 M concentraciones, respectivamente, (Fig 1, p & lt;. 0,05). Por otro lado, las células IOSE144 eran mucho menos sensibles al tratamiento FBA-TPQ, con una CI
50 más de 10 M (Fig 1B, p & lt;. 0.01). La exposición a FBA-TPQ disminuyó la viabilidad de las células IOSE-144 por 2,7%, 7,7% y 25,6%, respectivamente, para los 0,5, 1,0 y 2,5 m concentraciones (Fig. 1B), lo que indica que FBA-TPQ tiene actividad selectiva contra Las células de cáncer de ovario. Además, FBA-TPQ inhibida A2780 y células OVCAR-3 proliferación de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1C y 1D), mientras que sus efectos anti-proliferativos fueron mucho menos evidentes en las células IOSE144 tratados con las mismas concentraciones de FBA- TPQ (Fig. 1E). De hecho, FBA-TPQ A2780 significativamente inhibido y OVCAR-3 células de proliferación comenzando a la concentración 0,5 M (Fig 1C y 1D, p & lt;. 0,05) mientras que no hubo una inhibición significativa en las células IOSE-144 en cualquiera de las concentraciones ( hasta 1 M; Fig. 1E, p & gt; 0,05). Estos datos sugieren que FBA-TPQ puede inhibir selectivamente A2780 y 3 OVCAR-crecimiento de células de cáncer de ovario y la proliferación mientras se ejerce menos efectos potentes sobre IOSE144 células no tumorigénicas.
A, estructura química y fórmula molecular de FBA-TPQ ; B, la viabilidad celular (MTS) de ensayo de células de carcinoma de ovario humano OSE células (A2780 y OVCAR-3) y nontumorigenic (IOSE144) después de un 48 h de incubación con FBA-TPQ; C & amp; D & amp; E, la inhibición del crecimiento celular después de 0, 24, 48 o 72 h de exposición de A2780 (C), las células a FBA-TPQ (a concentraciones de 0 OVCAR-3 (D) y IOSE-144 (E), 0,5 , 0,75 y 1,0 M). Todos los valores son representativos de al menos tres experimentos independientes con resultados similares, y se presentan como el porcentaje de inhibición del crecimiento celular, en los que se consideran las células tratadas con vehículo como (inhibición del crecimiento 0%) 100% viable.
Desde FBA-TPQ reducido drásticamente la supervivencia de células OVCAR-3 y la proliferación, el próximo eligió esta línea celular de cáncer de ovario más FBA-TPQ sensible para investigar el mecanismo subyacente responsable de la disminución de la viabilidad celular expuesto al compuesto. En primer lugar, se evaluó si FBA-TPQ puede inducir la apoptosis células OVCAR-3 '. Como se muestra en la Fig. 2A y 2B, FBA-TPQ fuertemente inducidos apoptosis de una manera dependiente de la dosis durante 24 h de exposición. A 0,5 concentración mu M, FBA-TPQ aumento de la apoptosis en los 3 OVCAR-células a 260% (de las células de control), mientras que a 1,5 M de concentración, el índice de apoptosis se incrementó en casi 4 veces (figura 2B, p & lt;. 0.05 ). Los efectos pro-apoptóticos fueron más profunda a la concentración de 2,5 M (índice apoptótico aumentó hasta aproximadamente 600% en comparación con el control) (Fig 2B, p & lt;. 0.01). Para concluir, nuestros datos demostraron que FBA-TPQ puede inducir apoptosis significativa en las células OVCAR-3 de una manera dependiente de la dosis.
A, la apoptosis de células OVCAR-3 tratadas con concentraciones en serie de FBA-TPQ para 24 h; B, resumen y análisis del índice apoptótico de datos (Q1 refleja la necrosis, Q2 refleja la apoptosis tardía, Q3 refleja población saludable de las células no afectadas por apoptosis o necrosis, mientras que Q4 refleja la apoptosis temprana). C, la evaluación del ciclo celular de las células OVCAR-3 tratadas con concentraciones en serie de FBA-TPQ para 12 hr; D, Análisis de los datos de las células se presentan como la distribución porcentual de una fase específica (*,
p
& lt; 0,05 frente al control, **,
p
& lt; 0,01 frente al control, respectivamente ). Los datos son representativos de los valores de al menos tres experimentos independientes con resultados similares.
También investigó si FBA-TPQ tiene ningún efecto sobre la progresión del ciclo celular en células OVCAR-3. Para este ensayo, hemos reducido el tiempo de incubación FBA-TPQ a 12 h para evitar la alta inducción de la apoptosis. Como se ilustra en la Fig. 2C y 2D, después de un tratamiento de 12 h, FBA-TPQ indujeron un aumento significativo en el número de células en el G
2 /M-fase en el 1500 nM (aumento de 21,6% de control, p & lt; 0,05) y 2,5 M (aumento 30,0% de control, p & lt; 0,05) concentraciones. Además, el tratamiento FBA-TPQ también condujo a un aumento significativo en el número de células en la fase S en la concentración de 2,5 mM (Fig 2D, p & lt;. 0.05). Como se resume en la Fig. 2D, FBA-TPQ causó una concomitante, dependiente de la dosis, la disminución del número de células en el /G1-fase G0 (p & lt; 0,01). Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que los efectos inhibitorios de la FBA-TPQ sobre la viabilidad celular y el crecimiento pueden estar asociados con la inducción de la apoptosis y la detención del ciclo celular.
En nuestro trabajo anterior, se informó de que FBA-TPQ puede ejercer daño del ADN en las células de cáncer de mama [6]; aquí, se investigó si FBA-TPQ puede inducir estrés ROS celular y causar daño oxidativo en el ADN de las células de cáncer de ovario. En este ensayo, se disminuyó el tiempo de incubación de nuevo a 4 h (para evitar ROS atenuación), mientras que aumentó las concentraciones de serie a 0, 1,0, 2,0 y 3,0 mM (para producir la inducción de ROS rápida para agarrar la imagen). Como se muestra en la Fig. 3A y 3B, después de 4 horas de incubación, FBA-TPQ indujeron una disminución significativa (p & lt; 0,05) aumento dependiente de la dosis en la producción de ROS celular en células OVCAR-3 (Fig 3B.). Sobre la base de nuestra observación de que FBA-TPQ podría inducir la apoptosis, se evaluó la mitocondria potencial trans-membrana (
ΔΨm
) disipación como un indicador de alteración de la membrana mitocondrial y la apoptosis en las células. Usando el colorante JC-1, se observó que el tratamiento FBA-TPQ resultó en una disminución significativa (p & lt; 0,05) dependiente de la dosis
disipación ΔΨm
(reducción dependiente de la dosis de JC-1 agregados se indica por la disminución de las proporciones de intensidad de color rojo /verde de fluorescencia) después de 24 horas de exposición (Fig. 4A y 4B). Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de que la FBA-TPQ induce la producción elevada celular ROS y la pérdida de potencial de membrana mitocondrial, que inicia la vía de la apoptosis endógena ROS estrés provocado temprana celular
A & amp;. B, FBA-TPQ induce dosis dependiente de ROS estrés en células OVCAR-3 (a, el aumento dependiente de la dosis en el ROS como se indica por CM-H
2DCFDA; B, datos resumidos como el porcentaje en comparación con el control). C, Western blot de celulares los niveles de expresión de proteínas de la vía relacionada, indicando FBA-TPQ puede tener efectos a través de la acompañados por ROS, y la proliferación celular, la vía de la apoptosis y la progresión del ciclo celular asociado PI3K-Akt mediada /relacionados con la p53-MDM2 en 3 OVCAR-líneas celulares de cáncer de ovario después de 24 h de exposición (en 250,750 y 1000 nM concentraciones).
a y B, la intensidad de fluorescencia (JC-1 produce fluorescencia roja dentro de la mitocondria como JC-1 -aggregates mientras que emite fluorescencia verde cuando hay fugas en el citoplasma como JC-1-monómeros; fluorescencia cambio de intensidad entre verde y rojo es proporcional a la
ΔΨm
cambio) valores de JC-1 tinte en longitudes de onda de excitación específicas y la relación de Red /cambio de verde correspondiente (% del control) después de la exposición a FBA-TPQ durante 24 h (*,
p
& lt; 0,05 frente al control). C & amp; D, la inhibición de crecimiento tumoral en ratones portadores de OVCAR-3 tumores de xenoinjertos (*,
p
& lt; 0,05 frente al control; **,
p
& lt; 0,01 frente al control) y los correspondientes cambios en el peso corporal durante los tratamientos (
p Hotel & gt; 0,05); E, análisis Western-blot de proteínas (de los ratones xenoinjertos de tumores después del tratamiento FBA-TPQ de 0, 1 o 10 mg /dosis kg) activan-FBA-TPQ involucrado en el, y PI3K-Akt mediada /p53-MDM2 relacionada vía.
Para definir aún más los efectos de la FBA-TPQ sobre la apoptosis celular, la progresión del ciclo celular y la proliferación, se determinó el nivel de expresión de un grupo de proteínas implicadas en estas vías en OVCAR-3 células (ver Fig. 3C). Después de un tratamiento de 24 h de FBA-TPQ (con concentraciones de 0, 0,25, 0,75 y 1,0 M), se observó un aumento dependiente de la dosis en la expresión de poli cleaved- (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y caspasa 3, así como Bax, con una disminución dependiente de la dosis concomitante de la Bcl-2. Además, investigó los posibles mecanismos responsables de los efectos reguladores anti-proliferativa del ciclo celular y de FBA-TPQ. Como el anterior, se evaluó el nivel de expresión de varias proteínas asociadas con la proliferación y la progresión del ciclo celular, y observamos la baja regulación de Cdc25C, CyclinB1 y ciclina quinasa dependiente de ciclinas (CDK) 1, que son responsables de la transición de fase G2 /M, y encontrado un aumento en la expresión de proteínas Rb, p21 y p27, así como una disminución en la proteína E2F1, todos los cuales están involucrados en la proliferación celular (Fig. 3C). Además, nuestros datos muestran que FBA-TPQ puede disminuir la expresión y la activación (indicado por la fosforilación) de Akt, así como su quinasa aguas arriba catalítica subunidad PI3K-110α de PI3K. Además, evaluó los efectos reguladores de FBA-TPQ en p53, y se encontró que FBA-TPQ activa p53, con una baja regulación de acompañamiento en la expresión de MDM2 (ver Fig. 3C), y una mayor división de PARP y caspasas-3. Estos hallazgos son indicativos de apoptosis y /o anti-proliferativos y del ciclo celular efectos inhibidores. Como se demuestra en la Fig. 3C, también se observó un dependiente de la dosis sobre regulación de Fas, indicando que la vía del receptor de muerte, junto con p53, puede jugar un papel importante en la respuesta a FBA-TPQ y su estimulación de estrés ROS. Tomados en conjunto, podemos concluir que el FBA-TPQ puede ejercer sus
in vitro
efectos a través de la asociada a ROS y /proliferación celular, la apoptosis y la progresión del ciclo celular asociado vías relacionadas-p53-MDM2 PI3K-Akt mediada (Fig. 5).
estableció el modelo de xenoinjerto de tumor OVCAR-3 para evaluar la
actividad antitumoral in vivo de FBA-TPQ. El compuesto se administró 5 días a la semana i.p. a una dosis de 1 mg /kg o 10 mg /kg. Los efectos terapéuticos se evaluaron examinando el crecimiento del tumor. Como se muestra en la Fig. 4C, FBA-TPQ exhibe significativa (p & lt; 0.01) inhibición del tumor de una manera dependiente de la dosis. Los efectos inhibidores del crecimiento tumoral significativa empezaron a ser evidentes en el noveno día de tratamiento (p & lt; 0,05). Después de 18 días de tratamiento, FBA-TPQ resultó en 20,5% de inhibición del crecimiento del tumor (en comparación con el grupo de control) a la dosis más baja 1 mg /kg, y la inhibición del crecimiento tumoral 69,4% en la mayor 10 mg /kg de dosis (Fig. 4C , p & lt; 0,01). Por otra parte, aunque los ratones que recibieron la dosis de 10 mg /kg experimentaron una ligera pérdida de peso corporal, no hubo diferencias significativas en la pérdida de peso corporal (p & gt; 0,05) entre los tres grupos, lo que indica que FBA-TPQ puede tener un perfil de seguridad aceptable (Fig. 4D)
.
Para validar el
in vitro
hallazgos sobre el mecanismo de acción de FBA-TPQ, se evaluó además la
in vivo
nivel de expresión de la proteínas examinadas en las células cultivadas (Fig. 4E). De acuerdo con la
, los patrones de expresión de proteínas en el tejido tumoral de xenoinjertos tratados eran esencialmente in vitro
datos el mismo que las observaciones celulares (ver Fig. 3C y la Fig. 4E), lo que confirma que los efectos anti-tumorales de FBA-TPQ están, al menos parcialmente mediada por la inducción de estrés ROS mitocondrial y el colapso posterior, que conducen a alteraciones en las cascadas celulares que están implicados en la apoptosis, la proliferación celular y la progresión del ciclo celular.
Discusión
el presente estudio es el primero en investigar sistemáticamente la novela makaluvamine sintético análogo de FBA-TPQ
in vitro Opiniones y en
in vivo
efectos antitumorales en células de cáncer de ovario. Hemos demostrado que FBA-TPQ ejerce sus actividades contra el cáncer en las células A2780 y OVCAR-3 por la inhibición del crecimiento y la proliferación celular. Además los estudios de utilización de la línea celular OVCAR-3 más sensibles reveló que podría inducir la apoptosis celular y la detención del ciclo celular. Tales resultados funcionales se logran a través de una cascada de reacciones dentro de estas vías, incluyendo la inducción de estrés celular ROS, activación de la muerte de los receptores y el colapso mitocondrial, y la posterior regulación de p53-MDM2 y PI3K-Akt vías asociadas.
En nuestros estudios anteriores, que mostraron que la FBA-TPQ es el análogo makaluvamine más potente con respecto a la inducción de daño en el ADN, la apoptosis, la detención del ciclo celular y la inhibición de la proliferación de células de cáncer de mama [6]. Sin embargo, no se han dilucidado los posibles mecanismos subyacentes para estas actividades anti-tumorales y la eventual aplicación del compuesto para otros tipos de cáncer. El objetivo del presente estudio fue determinar si la FBA-TPQ podría representar un candidato prometedor para el futuro desarrollo de medicamentos contra el cáncer, y para dilucidar su mecanismo (s) de la acción.
Al principio habíamos observado que FBA- TPQ ejerce de citotoxicidad y proliferación celular efectos significativos de inhibición hacia A2780 y células OVCAR-3. La evaluación posterior reveló un efecto dependiente de la dosis de FBA-TPQ en OVCAR-3 células apoptosis, y la progresión del ciclo celular (la detención del ciclo G2 /M de células de fase). Estas observaciones fueron apoyadas además por perfiles de expresión de proteínas relacionadas en OVCAR-3 células por medio de Western Blot. En un intento de explorar el mecanismo (s) de acción que subyace a las actividades biológicas observadas de FBA-TPQ, encontramos que FBA-TPQ puede inducir estrés ROS celular y el colapso mitocondrial posterior, proporcionando una posible explicación para la cascada de activación de la
in vitro
efectos contra el cáncer, incluyendo la apoptosis. A continuación, se evaluó el
in vivo
actividad de FBA-TPQ en el modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario OVCAR-3, y mostró que FBA-TPQ nuevo puede ejercer la actividad tumoricida potente, con una inhibición del crecimiento tumoral hasta el 69,4% en la 10 mg /kg dosis. Sistemáticamente (ambos
in vitro
y
in vivo
) evaluamos su mecanismo subyacente (s) de las acciones, y nuestro
in vivo
estudios confirmaron que la FBA-TPQ ejerce su efectos antitumorales potentes principalmente al afectar la proliferación celular, la inducción de la apoptosis celular y la detención del ciclo celular.
La división de PARP y la procaspasa-3 son los indicadores bien documentados de la apoptosis [18], [19]. Los miembros de la familia Bcl-2, tales como Bcl-2 y Bax, son conocidos reguladores críticos responsables de la supervivencia celular /apoptosis [20] - [22]. Hemos demostrado una disociación dependiente de la dosis de PARP y procaspasa-3, así como una disminución dependiente de la dosis en la relación de Bcl-2 /Bax en las células tratadas-TPQ FBA y tumores, proporcionando pruebas de que FBA-TPQ induce apoptosis. En base a los datos anteriores que muestran que FBA-TPQ puede actuar como un agente que daña el ADN, se evaluó el nivel de ROS en células OVCAR-3 después de FBA-TPQ incubación, como la oxidación (junto con la metilación, la despurinización y desaminación) causada por el estrés ROS puede contribuir al daño de ADN [23]. De hecho, se observó un aumento dependiente de la dosis en el nivel de ROS celular, así como una disipación dependiente de la dosis del potencial de membrana mitocondrial. Dado que la pérdida de potencial de membrana mitocondrial se considera un evento temprano en la apoptosis [18], [24], se puede concluir que la FBA-TPQ desencadena la apoptosis observada en células OVCAR-3 mediante la inducción de un nivel elevado de ROS celular, dando lugar a la posterior colapso mitocondrial de membrana [23], [24].
las células utilizan los punto de control para garantizar la correcta ejecución del ciclo celular con el fin de proteger a las células en división de daño en el ADN potencialmente fatal [25], [26]. Las células pueden ser detenidos en la fase G2 /M con el fin de someterse a la reparación del ADN o la muerte celular por apoptosis [26], [27]. Para investigar más los efectos de FBA-TPQ sobre la detención del ciclo celular como consecuencia de su inducción de daño en el ADN, se evaluó su modulación de la expresión de las proteínas clave implicadas en G2 /señalización M, y observó una disminución dependiente de la dosis en la expresión de Cdc25C y CDK1 /ciclina B1, cuya activación son clave para G2 /M progresión [26], [28], [29]. Esto confirma que la FBA-TPQ promueve G2 /M detención de células OVCAR-3 después del daño inducido por ROS.
La activación de p53 es un importante mecanismo de acción para muchos agentes que dañan el ADN [6]. Se observó un aumento dependiente de la dosis en la expresión de p53 mutante en células OVCAR-3, lo cual es consistente con nuestro informe anterior que las células responden a los daños FBA-TPQ independientemente de su estado de p53 [6]. También se observó la baja regulación de MDM2 y una disminución concomitante en E2F1, y una mayor expresión de Rb, p21 y p27 [30], [31], lo que indica que la activación del bucle de realimentación p53-MDM2 es probable responsable de la FBA- aumento en la detención del ciclo celular y la apoptosis y la disminución en el crecimiento y la proliferación celular en células A2780 y OVCAR-3 inducida por tratamiento TPQ. La vía de señalización de Akt juega un papel crítico en la regulación de la supervivencia celular [32], [33]. La activación de Akt por PI3K (fosfoinositido-3-OH-quinasa) quinasa puede regular factores de transcripción que son responsables de las proteínas pro y anti-apoptóticas, así como factores de crecimiento para la supervivencia en respuesta a estímulos extracelulares o daños [32]. Akt fosforilada (p-Akt) se divulga para ser capaz de impedir la apoptosis y el crecimiento supresión dependiente de p53 por MDM2 fosforilación [34]. Nuestros datos mostraron una disminución dependiente de la dosis en p-Akt (y t-Akt) y su activador aguas arriba PI3K (subunidad catalítica) y un aumento de Fas (receptor de muerte), lo que sugiere que el estímulo FBA-TPQ -suppresses la PI3K-Akt (p-Akt) vía y fosforila MDM2 para regular la expresión de factores de crecimiento (E2F1, Rb, p21 y p27, etc.) o apoptosis (PARP, Bcl-2, Bax y la caspasa-3, etc.) y el ciclo celular relacionada (Cdc25C, CDK1 y ciclina B1, etc.), las proteínas, lo que resulta en efectos anticancerígenos sostenidos del compuesto
Teniendo en cuenta la alta tasa de mortalidad de cáncer de ovario [1] - [4]., es la necesidad de explorar nuevos agentes que pueden actuar a través de nuevos mecanismos de acción para mejorar el tratamiento del cáncer de ovario. El presente estudio sugiere que el análogo makaluvamine más eficaz, FBA-TPQ, puede ser una novela y el agente contra el cáncer de ovario prometedor, en que preferentemente y de forma potente puede inhibir de ovario OVCAR-3 de células de cáncer (pero no de células OSE no tumorigénicos) crecimiento. De acuerdo con nuestro
in vitro
y
in vivo
datos, creemos que el FBA-TPQ puede inhibir el crecimiento de carcinoma de ovario mediante la activación mediada la relacionada Fas /ROS-asociado, y PI3K-Akt /aumento en la apoptosis celular y la detención del ciclo celular y la disminución en la proliferación celular (Fig. 5) relacionada con p53-MDM2. Estos resultados fueron confirmados en el nivel de proteína en
e in vitro
in vivo
, y fueron consistentes con nuestro análisis de datos de microarrays (véase el texto S1, Fig. S1, cuadros S1, S2, S3 ), que FBA-TPQ ejerce su actividad principalmente a través de su inducción de ROS y el daño del ADN, la regulación de la "vía en el cáncer", "p53 vía de señalización" y "sistema de señalización fosfatidilinositol '(por ejemplo, PI3K-Akt), así como su negativa regulación de CDK (por ejemplo, CDK1 y la Cdc25C relacionada y CyclinB1).
En conclusión, nuestro estudio demostró que el FBA-TPQ puede ejercer citotoxicidad y proliferación celular potentes efectos de inhibición hacia A2780 y células OVCAR-3. A excepción de la inducción de la apoptosis, también puede inducir la detención del ciclo celular e inhibir el crecimiento OVCAR-3 tumores de xenoinjertos 'a través del receptor-iniciado ROS /muerte, y mediada por PI3K-Akt /p53-MDM2 relacionados con la proliferación celular y la apoptosis y el ciclo celular vías de progresión-asociado (ilustrados en la Fig. 5). Sin embargo, el mecanismo exacto (s) del compuesto, y si se ejerce los mismos efectos en otros tipos de tumores aún no se han dilucidado bien. En el futuro, el presente estudio, junto con nuestros hallazgos informados anteriores [6], sin duda mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de acción de analógico makaluvamine y también proporcionará una base para su desarrollo clínico futuro de FBA-TPQ como una novela contra agente: cáncer.
Materiales y Métodos
compuestos químicos y Reactivos
Todos los productos químicos eran de grado analítico. FBA-TPQ fue una especie de regalo del profesor Sadanandan Velu (UAB, Birmingham, AL, EE.UU.). El yoduro de propidio (P4170) fue comprado a Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, EE.UU.). El colorante JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3, 3 'tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine yoduro) (T-3186), el reactivo de TRIZOL y CM-H
2DCFDA [5- (y-6) -chloromethyl-2 ', 7 pies éster acetil diacetato dichlorodihydrofluorescein] (C6827) se adquirieron de Invitrogen Molecular Probes-Co (ciudad, estado, EE.UU.). El CellTiter 96® AQ
ueous One Solution (G3580) Ensayo de proliferación celular (ensayo MTS) Kit se adquirió de Promega Co., Ltd. (Madison, WI). El kit de ensayo de proteínas DC (500-0113) se obtuvo de Bio-Rad (Hercules, CA, EE.UU.), y el sistema ECL plus se adquirió de Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, Reino Unido). Todos los suministros de cultivo celular se obtuvieron de Invitrogen-Gibco Co. (ciudad, estado, EE.UU.). El anticuerpo Anti-MDM2 humano se obtuvo de Calbiochem® de EMD Chemicals Inc. (Darmstadt, Alemania), el anticuerpo de la caspasa-3 (8G10) se adquirió de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EE.UU.), y el anti -humana β-actina (AC-74) de anticuerpos se obtuvo de Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). p53 anti-humano (SC-98), Fas (SC-8009), PI3K110a (SC-7189), PI3K85a (SC-423), AKT (SC-8312), p-AKT (SC-7985-R), PARP (H-250, SC-7150), Bax (SC-493), Bcl-2 (SC-509), Rb (SC-50), p21 (SC-817), p27 (SC-528), E2F1 (SC -193), CDK1 (SC-8395), ciclina B1 (SC-595), y Cdc25C () anticuerpos sc-13138, junto con todos los anticuerpos secundarios (anti-ratón, anti-cabra y anti-inmunoglobulina G de conejo) fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EE.UU.).
Líneas celulares y cultivo celular
A2780 células de carcinoma de ovario humano y OVCAR-3 y IOSE144 de ovario humano (no inmortalizadas las células epiteliales de ovario superficie tumorigénicas) que se obtuvieron originalmente de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) fueron regalos de Dr. Jing colmillo (Instituto de Ciencias de la Nutrición, Shanghai, china). Todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina /estreptomicina de acuerdo con las instrucciones del ATCC. FBA-TPQ se disolvió en DMSO y después se diluyó en medio de cultivo celular (& lt; 0,1%, concentración final de incubación).
viabilidad celular Ensayo
El crecimiento celular y la viabilidad se determinaron mediante el ensayo de MTS usando el CellTiter 96® AQ
Una solución ueous celular kit de ensayo de proliferación (G3580, Promega). En resumen, 4 × 10
3 células (por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron durante 48 h con FBA-TPQ (disuelto en DMSO & lt; 0,1%, concentración final) a concentraciones de serie (0 , 100, 500, 750, 1000, 1500 y 2500 nM), o se trataron durante diversos tiempos (0, 24, 48 y 72 h) con FBA-TPQ a concentraciones de 0, 500, 750 y 1000 nm. Después del tratamiento 24~72 hrs, se añadieron 20 l de solución de MTS a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 2~4 horas adicionales a 37 ° C, después de lo cual la absorbancia a 490 nm se registró usando un SpectraMax
190 lector de microplacas (Molecular Devices, EE.UU.) para calcular los porcentajes de supervivencia celular.
Detección de apoptosis
apoptosis de las células se detectó por medio de un kit V-FITC Anexina comprado de BioVision, Inc [6], [17]. Brevemente, 1 × 10
6 Las células se sembraron en placas de 6 cm y se trata con el compuesto de ensayo (FBA-TPQ) a 0,5, 1,5 y 2,5 M durante 24 h antes del análisis. Se recogieron las células adherentes flotantes y tratadas con tripsina y se prepararon para la detección de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se analizaron con un flujo FACSAria ™ citómetro (Becton Dickinson, EE.UU.) después de la incubación en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min. Las células positivas para principios de la apoptosis (anexina V-FITC solamente manchado, ver Q
4 en la figura 2A) y para finales de la apoptosis (anexina V-FITC y PI manchado, ver Q
2 en la Figura 2A) se combinaron.
Análisis de ciclo celular
yoduro de propidio (PI) tinción se realizó para determinar los efectos de la FBA-TPQ sobre el ciclo celular [6]. En breve, 6 × 10
5 células que fueron sembradas en placas de 6 cm fueron expuestos a FBA-TPQ (a 0, 0,5, 1,5 y 2,5 M) y se incubaron durante 12 horas antes del análisis. Las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS y se fijaron en 1 ml de etanol al 70% (700 l 100% de etanol añadido a 300 l de PBS) a 4 ° C durante la noche, seguido de centrifugación (3000 rpm, 5 min), la incubación con RNasa (100 g /ml) y la tinción con yoduro de propidio (50 mg /ml) durante 15 minutos en la oscuridad. El contenido de ADN fue analizado por un laboratorio de la célula Quanta ™ SC citómetro de flujo (Beckman Coulter, EE.UU.).
Medición de especies reactivas del oxígeno (ROS) guía
La producción de ROS se midió usando 5- (y-6) -chloromethyl-2 ', 7'- éster diacetato de acetil dichlorodihydrofluorescein (CM-H2DCFDA). Brevemente, las células (~ 7 × 10
5) se sembraron en placas de 6 cm y se expusieron a FBA-TPQ durante 4 horas a concentraciones en serie (0, 1,0, 2,0 y 3,0 M), después de lo cual se recogieron las células y se lavó con PBS una vez, después se incubaron con 5 mM CM-H2DCFDA (en DMSO) durante 30 min a 37 ° C en medio RPMI 1640 libre de rojo fenol.