Extracto
La radioterapia (RT) sigue siendo una de las opciones más populares del tratamiento para el cáncer de próstata localizado (PAC). El propósito del estudio fue investigar la
in vitro
efecto de LBH589 solo y en combinación con RT en el crecimiento y la supervivencia de las líneas celulares de CaP y los posibles mecanismos de radiosensibilización de esta terapia de combinación. El efecto de LBH589 solo o en combinación con RT en dos líneas tapa de la celda (PC-3 y LNCaP) y una línea normal de próstata de células epiteliales (RWPE-1) se estudió mediante MTT y ensayos clonogénicos, análisis del ciclo celular, el Western Blot de la apoptosis proteínas de puntos relacionados con la PI y la verificación de la célula, y dobles marcadores de reparación del ADN capítulo romper (OSD). La tinción de inmunofluorescencia se utilizó para confirmar adicionalmente la expresión DSB en células de CaP tratados. Nuestros resultados indican que LBH589 inhibió la proliferación tanto de cabeza y las células epiteliales prostáticas normales en un tiempo-y-dependiente de la dosis; Dosis bajas de LBH589 (IC
20) en combinación con RT eficiencia de la destrucción celular mejorado en gran medida en las células de CaP; en comparación con la RT sola, el tratamiento de combinación con LBH589 y RT induce más apoptosis y dio lugar a un aumento constante de la población sub-G1 y abolición de G2 inducida por RT /M detención, aumentó y persistente OSD, una menor activación de extremos no homólogos unirse (NHEJ) /recombinación homóloga (HR) las vías de reparación y un panel de proteínas relacionadas con el ciclo celular. Estos resultados sugieren que LBH589 es un agente potencial para aumentar la radiosensibilidad de las células de CaP humanos. LBH589 utiliza ya sea solo, o en combinación con RT es una estrategia atractiva para el tratamiento de CaP humano
Visto:. Xiao W, Graham PH, Hao J, Chang L, Ni J, CA de alimentación, et al. (2013) Terapia de combinación con el Inhibidor de histona deacetilasa LBH589 y la radiación es un tratamiento eficaz para las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (8): e74253. doi: 10.1371 /journal.pone.0074253
Editor: Hari Koul, Universidad de Colorado, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Octubre, 2012; Aceptado: August 2, 2013; Publicado: 26 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Xiao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por una beca de Desarrollo Profesional del Consejo Nacional de Salud de Investigación médica (YL), Australia; Fondo de St George Hospital del Cáncer Research Trust (PHG), Sydney, Australia; y el Consejo de Becas de China (WWX), China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las opciones terapéuticas actuales para el casquillo localizado son la radioterapia (RT), la cirugía y la terapia endocrina. Aunque la radiación agresiva sí mejora el control bioquímico, mayores toxicidades rectales y urinarios también ocurrieron [1]. El fracaso local después de la RT sigue siendo 20% -35% de los pacientes con CaP intermedio y alto riesgo [2], lo que lleva a un aumento de la metástasis y la supervivencia inferior. Por lo tanto, la investigación de un enfoque novedoso combinación con un antagonista selectivo de radio-sensibilizador con RT para mejorar se necesita con urgencia CaP radiosensibilidad.
Los inhibidores de la histona deacetilasa (HDACI) son un grupo emergente de agentes que se dirige a la histona deacetilasa (HDAC) y radiosensibilizadores prometedores actualmente bajo investigación. Radiosensibilización por HDACi, tal como el ácido valproico [3] se ha demostrado en estudios preclínicos. HDACi es un potente inductor o regulador de comportamientos celulares, tales como los procesos de apoptosis, ciclo celular y la reparación del ADN. Se cree que ejercen sus efectos principalmente mediante la modificación de las estructuras de las histonas y la cromatina, por lo tanto modular la transcripción de genes [4]. Además, estos acetilasas y desacetilasas también pueden modular las funciones celulares independientes de la expresión génica actuando sobre las proteínas no histonas tales como p21 [5], p53 [6], Ku70 [6]. A través de actuar sobre una serie de proteínas histonas y no histonas, HDACi es capaz de mediar la apoptosis, ciclo celular, y los procesos de reparación del ADN de una manera bien orquestada.
LBH589 es un derivado del ácido hidroxámico y una novela pan- HDACi [7]. Qian et al. informó de que LBH589 sola redujo la angiogénesis y el crecimiento tumoral en un modelo animal de xenoinjerto PC-3 [8]. Un estudio de fase I se ha llevado a cabo mediante el tratamiento de cáncer de próstata (CRPC) pacientes resistentes a la castración usando LBH589 oral con o sin docetaxel, lo que demuestra resultados prometedores para la futura aplicación clínica [9]. Estos resultados apoyan la hipótesis de que LBH589 puede ser útil en combinación con RT para el tratamiento localizado de la PAC.
En este estudio, la hipótesis de que LBH589 podría matar a las células de CaP y el tratamiento de las células de CaP con LBH589 antes de RT aumentaría la sensibilidad de las células de CaP a RT.
Materiales y Métodos
Productos químicos y anticuerpos
LBH589 (panobinostat) se adquirió de Selleck Químicos (Selleck Químicos South Loop West, Houston, TX, ESTADOS UNIDOS). Otros productos químicos utilizados fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, Nueva Gales del Sur, Australia), a menos que se especifique lo contrario. Los anticuerpos primarios y secundarios utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Anticuerpo
Fuente
tipo
dilución
El tiempo de incubación
Temperatura aplicación de Windows
conejo anti-humano -3 caspasa (Pro) EpitomicsMAb1: 1000o /N4
° CWBRabbit EpitomicsMAb1 antihumano de la caspasa-3 (activa): 1000o /N4
° CWBRabbit anti-humano de la histona H3 (K9 acetil) AbcamPAb1: 500o /N4
° CWBRabbit anti-humano de la histona H4 (K8 acetil) AbcamPAb1: 500o /N4
° CWBRabbit p21AbcamPAb1 anti-humano: 1000o /N4
° CWBRabbit antihumano p-p53AbcamPAb1: 1000o /N4
° CWBMouse p53AbcamMAb1 anti-humano: 1000o /N4
° CWBRabbit-CDK1 fosfo (Tyr15) Cell anti-humano de Señalización TechnologyPAb1: 1000o /N4
° CWBRabbit Cdk1 AbcamPAb1 (cdc2) anti-humano: 10000o /N4
° CWBRabbit antihumano p-Chk-1AbcamPAb1: 1000o /N4
° CWBRabbit antihumano Chk-1AbcamPAb1: 1000o /N4
° CWBRabbit antihumano p-Chk-2AbcamPAb1: 500o /N4
° CWBRabbit antihumano Chk-2AbcamPAb1: 500o /N4
° CWBRabbit-Rb fosfo (Ser795) Cell anti-humano de Señalización TechnologyPAb1: 1000o /N4
° CWBRabbit anti-humano fosfo-Rb (Ser807 /811) Señalización celular TechnologyPAb1: 1000o /N4
° CWBMouse RbAbcamMAb1 anti-humano: 1000o /N4
° CWBMouse antihumano γH2AXAbcamMAb 1: 500 (SI) 1: 1000 (BM) o /N4
° CIF WBRabbit anti- Ku70EpitomicsPAb1 humana: 1000o /N4
° CWBRabbit Ku80EpitomicsPAb1 anti-humano: 1000o /N4
° CWBMouse antihumano BRCA1AbcamMAb1: 200 (SI) 1: 200 (BM) o /N4
° CBH, anti IFRabbit BRCA2AbcamPAb1 humana-: 200 (SI) 1: 1000 (BM) o /N4
° CBH, IFMouse RAD51AbcamPAb1 antihumana: 100 (I) 1: 1000 (BM) o /N4
° CBH, IFMouse contra GAPDHMilliporeMAb1 humana-: 500o /N4
° CWBMouse controlDakoIgG11 IgG1-negativos anti-humano: 1000o /N4
° CIFGoat anti-IgG de conejo-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500045 minroom temperatureWBGoat IgG anti-ratón-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500045 . minroom temperatureWBGoat anti-ratón Alexa Fluor ® 488 tinte ConjugateInvitrogenIgG1: 100045 minroom temperatureIFTable 1. Los anticuerpos utilizados para el Western Blot y la tinción de inmunofluorescencia
Notas: MAb: anticuerpo monoclonal; O /N: durante la noche; PAb: anticuerpo policlonal; WB: Western Blot; SI: inmunofluorescencia; HRP: peroxidas de rábano picante Descargar CSV CSV
Cultivo de células
Las líneas celulares LNCaP CaP PC-3 y sensibles a andrógenos andrógenos no responde, y la próstata humana RWPE-1 línea celular normal se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, EE.UU.). las células PC-3 y LNCaP fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con 10% (vol /vol) de suero calentado inactivado bovino fetal (FBS), 50 U /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina mientras que las células RWPE-1 se cultivaron en medio K-SFM complementado por 0,2 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante (regf) y /ml de extracto de pituitaria bovina 25 mg sin FBS. Todas las líneas celulares se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO
2.
MTT ensayo
Se evaluó la proliferación celular en cáncer de próstata y líneas de células de próstata normales después del tratamiento LBH589 usando el ensayo MTT después de un método publicado [10]. Brevemente, las células 2000 se sembraron en placas de 96 pocillos se incubaron en medios de cultivo durante 24 h. Las células se trataron luego con una gama de concentraciones de LBH589 (0 ~ 20 mmol /L) o el mismo volumen de control de DMSO en medio fresco durante otras 24, 48 y 72 h, respectivamente. La absorbancia (DO) se leyó a 560 nm en un lector de BIO-TEC de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Cada experimento fue repetido al menos tres veces. Los resultados se representan como la relación de OD de las células tratadas y de control. IC
20 (20% concentración inhibitoria) de LBH589 en 24 h se calculó y elegida para los siguientes experimentos.
formadoras de colonias ensayo
, LNCaP y células PC-3 RWPE-1 se utilizaron para ensayos de formación de colonias como se describe previamente con modificaciones menores [10]. Brevemente, 1,5 ~ 2 × 10
6 PC-3, las células LNCaP y RWPE-1 se trataron de 6 cm plato con LBH589 en el respectivo IC
20 concentraciones o mismo volumen de DMSO (control) durante 24 h y a continuación, se sembraron 200 ~ 2 × 10
5 células en placas de 6 cm. Después de 8 h de recuperación, las células LBH589 tratados y de control tratado con DMSO fueron expuestos a una única irradiación dosis (0-8 Gy) a temperatura ambiente usando un acelerador lineal (Elekta, Estocolmo, Suecia) a una tasa de dosis de 2,7 Gy /min con 6 MV de fotones (Centro de tratamiento del cáncer, del hospital St George, Sidney, Australia). Después de RT, todas las células se lavaron inmediatamente con medio libre de fármaco. Después de 14 días de incubación, las células se tiñeron con cristal violeta. Las colonias, que se definen como grupos de & gt; 50 células, se puntuaron de forma manual con la ayuda de un Olympus INT-2 microscopio invertido (Tokio, Japón). Los datos de las células RT sola o la combinación tratados (LBH589 y RT) se normalizaron frente a las células irradiadas (ONU puntuados como la capacidad de formación de colonias 100%).
Análisis de citometría de flujo para la distribución del ciclo celular
0,5 ~ 2 × 10
6 células PC-3 y LNCaP CaP se sembraron en placa de 10 cm durante 24 h, después se trataron con LBH589 en el respectivo IC
20 concentraciones o DMSO (control) durante otras 24 h antes de someterse a 2 Gy RT. En los puntos de tiempo específicos (pre-RT, 2, 6, 12, 24, 48 y 72 h después de 2 Gy), con tripsina las células adherentes y flotantes se combinaron y se fijaron en frío 70% (v /v) de etanol a 4 ° C. Histogramas de contenido de ADN se analizaron utilizando el software FlowJo (V.7.6.1, la estrella del árbol, Inc., Oregon, EE.UU.) para determinar la distribución del ciclo celular (G1 submarinos, G1, S y G2 /M).
proteínas tinción de inmunofluorescencia para γH2AX y reparación de la vía de recursos humanos
células PC-3 y LNCaP CaP fueron tratados con el mismo protocolo que se describe en el análisis del ciclo celular (véase más arriba). Después de recibir 2 Gy RT, las células tratadas con DSMO LBH589 tratados y se sometieron a tinción de inmunofluorescencia en puntos específicos de tiempo (pre-RT, 24 y 72 h después de 2 Gy). La preparación de células para la tinción de inmunofluorescencia se describe como anteriormente, con modificaciones [11,12]. Las células teñidas se examinaron usando un /FV500 Olympus escaneo láser confocal FV300 microscopio (Olympus, Tokio, Japón) y las imágenes fueron capturados. Para cada condición de tratamiento, γH2AX, BRCA1, BRCA2 y RAD51 focos se determinaron en al menos 50 células. El recuento de γH2AX, BRCA1, BRCA2 y RAD51 focos nucleares en estas células se llevó a cabo por dos observadores independientes (WWX y JLH).
Western Blot
células PC-3 y LNCaP cap de tratado con el mismo protocolo que se describe en el análisis del ciclo celular (véase más arriba). células LBH589 tratados y de control se sometieron a 2 Gy RT. Se recogieron tanto las células flotantes y adherentes en los puntos de tiempo específicos (pre-RT, 2, 6, 12, 24, 48 y 72 h después de 2 Gy) para la transferencia de Western como se describe anteriormente [13]. Las membranas se incubaron con diferentes anticuerpos primarios y peroxidasa de rábano picante (HRP) itrio anticuerpos secundarios en condiciones específicas (Tabla 1). sistema ImageQuant LAS4000 (GE cuidado de la Salud, EE.UU.) se utilizó para la grabación de imágenes.
El análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces (n = 3). Los resultados se presentan como media ± desviación estándar (SD). Para los experimentos de irradiación, fracciones de supervivencia se calcularon como sigue: SF = [media chapado eficiencia de la radiación (± LBH589) células tratadas dividido por la media chapado eficiencia del control (± LBH589)]% Supervivencia fracciones de células de combinación tratados fueron corregidos para la citotoxicidad de LBH589. RT curvas de supervivencia se ajustaron de acuerdo con el modelo lineal-cuadrática utilizando el software GraphPad Prism 4.0 (GraphPad, San Diego, CA):
Supervivencia = e
- (+ αD ßD
2) guía empresas
se calcularon los siguientes parámetros: valor de α, el valor de β, el valor de α /β, ID90, ID
50, y ID10 (RT dosis que produce una fracción de supervivencia de 10%, 50% y 90%, respectivamente) ; y SF2 (fracción de supervivencia a 2 Gy). El efecto radiosensibilizador de LBH589 estaba representada por el factor de aumento de la dosis (DEF), calculado como la ID
50 para las células RT tratados dividido por el ID
50 para las células tratadas con la combinación [14]. ANOVA de dos vías se utilizó para estudiar la influencia de la dosis de RT y LBH589 en los parámetros de los resultados (por ejemplo, la fracción de supervivencia, la distribución del ciclo celular, γH2AX focos número). Se utilizó una prueba t de dos muestras para comparar la media del porcentaje de submarinos G1, G1, S y G2 /M fase de las células y la media γH2AX, BRCA1, BRCA2, RAD51 focos número entre dos condiciones de tratamiento específicas. Las posibles diferencias significativas (
p Hotel & lt; 0,05) fueron evaluados utilizando el programa SPSS v 16.0 software (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.)
Resultados
El efecto de LBH589 solo. sobre la proliferación celular utilizando células de CaP y células epiteliales normales de la próstata
se encontró que el tiempo y el efecto de inhibición de la proliferación celular dependiente de la dosis tanto en las células de cabeza (PC-3 y LNCaP) y las células epiteliales normales de la próstata (RWPE-1) (Figura 1A). IC
20 Valor a las 24 h para PC-3, LNCaP y RWPE-1 fue de 10 mmol /L, 2,5 mmol /L y 15 mmol /L, respectivamente, lo que sugiere que dos líneas celulares de CaP son más sensibles a LBH589 de . la línea de células epiteliales normales de la próstata
las células (a) fueron tratados con una gama de concentraciones de LBH589 durante 24, 48 y 72 h; (B) Las células fueron tratadas con RT o combinación con RT y LBH589 para el análisis de la eficiencia de formación de colonias. fracciones de supervivencia se redujo significativamente en las células PC-3 y LNCaP tapa (
p
& lt; 0,01), pero no en las células normales REWP-1 (
p
& gt; 0,05); (C) las imágenes típicas se muestran para el crecimiento de colonias en RT y el tratamiento de combinación (LBH589 y RT) en cáncer de próstata y las células normales de la próstata. Todos los resultados fueron de tres experimentos independientes (N = 3). Puntos, significan; bares, Dakota del Sur.
El efecto del tratamiento de combinación en la formación de colonias usando PAC y las células normales de la próstata
El efecto de radiosensibilización LBH589 en PC-3 y LNCaP se indica mediante redujo significativamente la supervivencia fracciones (
p = 0,0075
para PC-3,
p = 0,0074
para LNCaP) y DEF en estas dos líneas celulares & gt; 1 (1,77 para PC-3 y 1,29 para LNCaP) ( Figura 1B-C). Radiosensibilidad no se incrementó significativamente en RWPE-1 por LBH589 pretratamiento con DEF de 1,18 (
p = 0,0823
) (Figura 1B-C). RT parámetros para la RT sola y el tratamiento de combinación en cada línea celular se resumen en la Tabla 2. SF2, ID90, ID
50 y ID10 se redujeron significativamente en todos los PC-3 y LNCaP mediante pretratamiento LBH589 (
p
. & lt; 0,05), pero ninguna de ellas ha cambiado de manera significativa para RWPE-1