Extracto
A pesar de gemcitabina es muy activa en varios tipos de cáncer, intrínseca y adquirida resistencia a los medicamentos sigue siendo un reto importante . La sobreexpresión de Bcl-2 se ha asociado con la resistencia a gemcitabina. El objetivo de este estudio es determinar si el gosipol puede superar la resistencia gemcitabina en líneas celulares con alto nivel de Bcl-2 expresión en la terapia de combinación de fármacos. Nuestro estudio demostró que en 10 líneas celulares derivadas de diferentes tipos de cáncer, se observó alta expresión de línea de base Bcl-2 en líneas celulares que eran resistentes a la gemcitabina (GEM-R). Además, se observó un efecto sinérgico de la terapia de combinación en las líneas celulares resistentes a gemcitabina (GEM-R) con alta expresión de Bcl-2, pero no en una línea celular sensible a gemcitabina (GEM-S) independientemente de Bcl-2 expresión. tratamiento Gossypol dio lugar a la disminución de genes anti-apoptóticos tales como Bcl-2 y Bcl-XL y una regulación al alza del gen de pro-apoptóticos, Noxa. Además, la adición de gosipol a la gemcitabina resultó en expresiones inferiores de genes anti-apoptóticos en comparación con la gemcitabina sola. perfiles de expresión génica en líneas celulares de GEM GEM-S-R y sugieren que los genes anti-apoptóticos como pAkt y PI3KR2 pueden desempeñar un papel importante en la resistencia a la gemcitabina, mientras que pro-apoptóticas Bcl-2 genes relacionados (Bad, caspasa-6 y Calpain- 1) puede regular la interacción sinérgica en terapia de combinación
Visto:. Wong año fiscal, Liem N, Xie C, Yan FL, Wong WC, Wang L, et al. (2012) Terapia de combinación con gosipol revela sinergismo contra la resistencia a gemcitabina en las células cancerosas con alta BCL-2 Expresión. PLoS ONE 7 (12): e50786. doi: 10.1371 /journal.pone.0050786
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Julio, 2012; Aceptado: 24 Octubre 2012; Publicado: 4 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Wong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de subvención NMRC /TCR /001-nuh /2007 del Consejo Nacional de Investigación médica, Singapur. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la gemcitabina (2 ', 2'-difluorodesoxicitidina, dFdC) es un análogo de nucleósido de pirimidina de la desoxicitidina usado comúnmente en mama [1], no pequeñas de pulmón de células [2], de páncreas [3] y el cáncer de ovario [ ,,,0],4]. Gemcitabina entra en la célula a través de transportador de nucleósidos específica y se somete a phospharylation intracelular para convertir en metabolitos activos de drogas. Una vez dentro de la célula, gemcitabina es fosforilada por quinasas de desoxicitidina que luego incorporan en el ADN para inhibir la síntesis y la proliferación celular, mientras que la promoción de la apoptosis en las células cancerosas [5]. La sobreexpresión de genes anti-apoptóticos, tales como la familia Bcl-2 juega un papel crítico en la que confiere resistencia a terapias contra el cáncer convencionales [6], [7], [8]. Por ejemplo,
Yu et al
demostraron una correlación inversa entre Bcl-2 y la expresión de la quimiosensibilidad a varios fármacos, incluyendo la adriamicina y 5-fluorouracilo en células de cáncer de mama. [9].
In vitro
líneas de células cultivadas derivadas de tumores de HCC primarias que expresan altos niveles de la anti-apoptótica de Bcl-2 y Bcl-XL también se encontraron para ser resistentes a paclitaxel [10]. Sobre regulación de la familia Bcl-2 ha sido implicado en la resistencia intrínseca gemcitabina en el cáncer de páncreas y de pulmón [11], [12]. células de cáncer pancreático que adquirieron resistencia a los medicamentos a la gemcitabina después continuamente expuesta a la gemcitabina tenían sobre regulación de los genes anti-apoptóticos tales como Bcl-XL y MCL-1 [13]. Estos hallazgos sugieren que el elevado nivel de la familia Bcl-2 puede jugar un papel importante en el desarrollo de la resistencia a gemcitabina durante la quimioterapia.
El gosipol es un compuesto polifenólico aislado de la planta de algodón (
Gossypium Malvaceae
). Inicialmente utilizado como un agente de control de la fertilidad masculina, recientemente se ha descubierto que tiene propiedades anti-tumorgenic en una variedad de tipos de cáncer [14]. existe gosipol en dos formas enantiómeras, (+) y - existe, y de origen natural gosipol como una mezcla racémica de (+) y () (-) enantiómeros. El enantiómero (-) de gosipol se ha encontrado que poseen efecto citotóxico más potente que el enantiómero (+) o gosipol racémico. El gosipol es un mimético de BH3 que inhibe la función de anti-apoptóticas Bcl-2 de proteínas a través de interacciones con los bolsillos BH3-de unión de Bcl-2 y las proteínas Bcl-XL [15]. Varios estudios in vitro han informado de que el gosipol podría inhibir el crecimiento celular en un amplio espectro de cánceres como el de colon [16], de próstata [17], de pulmón [18] y los tumores de mama [19]. En las células de cáncer de próstata PC-3, gosipol la apoptosis inducida por la inhibición de la heterodimerización de Bcl-2 /Bcl-xl complejo [17]. La inducción de la apoptosis a través de gosipol también se observó por la baja regulación de proteínas de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas en el TC-29 de cáncer de colon y la leucemia linfocítica crónica [16], [20]. Además, el gosipol tiene la capacidad para superar la resistencia a fármacos a otros fármacos quimioterapéuticos convencionales. El gosipol ha demostrado inducir eficazmente la muerte celular en células de leucemia quimiorresistentes líneas que sobreexpresan Bcl-2 y Bcl-xl [21]. Se ha informado de que el gosipol induce la apoptosis podría con una alta eficiencia en líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello resistentes al cisplatino que expresan altos niveles de Bcl-XL. [22]. Cengiz E et al. apoptosis observada de que el tratamiento combinado de gosipol y docetaxel podría sinérgicamente inducida en PC-3 línea celular de cáncer de próstata [23]. Estos estudios sugieren que la combinación de gosipol con otras drogas puede mejorar la eficiencia de la inducción de la apoptosis en la terapia del cáncer.
Los objetivos de este estudio fueron: (1) correlacionar la expresión de la proteína Bcl-2 con la resistencia a gemcitabina (GEM R) en las secreciones gástricas, las líneas celulares nasofaríngeo y cáncer de mama, (2) evaluar la combinación de gemcitabina y gosipol en líneas celulares de cáncer de GEM-R con alto nivel de Bcl-2 y la expresión (3) determinar los mecanismos implicados en la reversión de la resistencia a gemcitabina por gosipol.
Materiales y Métodos
líneas celulares y reactivos
líneas celulares de cáncer nasofaríngeo CNE1, CNE2, HONE1 se derivan de tumores indiferenciados APN de china, mientras que era de una HK1 bien diferenciado APN de china [24], [25]; líneas celulares de cáncer de mama SKBR3, T47D, MCF-7 y de células de cáncer gástrico líneas AGS, snu1 se adquirieron de ATCC, EE.UU.; mientras YCC16 se obtuvo de DUKE NUS, Singapur, Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 y se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco; Grand Island, NY) que contiene 10% inactivado por calor fetal de suero bovino (Gibco; Grand Island, NY) y 1% de penicilina /estreptomicina (Gibco; Grand Island, NY). Mycoplasma estado de las células se puso a prueba rutinariamente usando el kit de detección de Mycoplasma MycoAlert ™ (Lonza, ME, EE.UU.). estado de Mycoplasma de todas las líneas celulares llevados a cabo en este estudio fueron negativos. El gosipol (Sigma-Aldrich; St Louis, MO) y gemcitabina (Sigma-Aldrich; St Louis, MO) se disolvieron en DMSO a una concentración de 10 mM y se almacenaron a -20 ° C. AT-101 fue proporcionada por Ascenta Terapéutica y preparado como madre 10 mM con DMSO. Los anticuerpos primarios consistentes en anti-caspasa-6, anti-Bcl-xl, anti-Bad, anti-Bak, anti-Bax, anti-pAKT, anti-PIK3R2, anti-calpaína-1 y anti-actina se adquirieron de Cell Signaling tecnología (Cell Signaling, MA, EE.UU.). Primary anti-Noxa se adquirió de Calbiochem (Merck; Alemania); y anti-Bcl-2 y anti-MCL-1 se adquirió de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios (IgG anti-conejo, el HRP-Linked y anti-IgG de ratón, HRP-Linked) fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Cell Signaling, MA, EE.UU.)
viabilidad celular y Ensayos de proliferación de
.
Para evaluar la quimiosensibilidad de las células tumorales, la viabilidad celular se midió por MTS (colorimétrico CellTiter 96 AQ
Una solución ueous Ensayo de proliferación celular) (Promega, WI, EE.UU.). suspensión de células se cultivaron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos a una concentración de 2 × 10
3 células /por pocillo y se incubaron durante la noche. Los tratamientos farmacológicos se llevaron a cabo como sigue: gosipol (0,1 M -100 M), gemcitabina (0,001 M-100 M) o una combinación de ambos fármacos en concentraciones varía. Cada fármaco se ensayó por triplicado. Las placas se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 para 72 h. Los pocillos de microtitulación que contienen células tumorales sin tratamientos con fármacos se utilizaron como controles, y se utilizaron los pocillos que contenían solamente medio completo como controles en blanco para la reducción de colorante no específica. Las células se incubaron durante 72 h antes de la adición de solución de MTS (1 mg /ml por pocillo) y la absorbancia se leyó a 490 nm usando un lector de microplacas espectrofotométrico (Bio-Rad; CA, EE.UU.). El porcentaje de viabilidad celular a diferentes concentraciones de fármaco se calculó como el porcentaje de inhibición de (media de absorbancia de los pocillos tratados /absorbancia media de los pocillos de control) x 100%. IC
50 fue calculada por GraphPad Prism versión 4.0 (GraphPad Software, Inc; CA, EE.UU.).
Combinación de Análisis Index
La interacción entre gemcitabina y gosipol se analizó con el software Calcusyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido) como se informó anteriormente [26]. Brevemente, se utilizó la relación de concentración constante de gemcitabina y gosipol en 0,25X, 0.5x, 1x, 2x, 4x y para evaluar la sinergia de tratamiento de combinación. Los valores de IC se calcularon de acuerdo con los niveles de inhibición del crecimiento (fracción afectada) por cada agente individual y la combinación de gemcitabina con gosipol. índice de combinación se calculó para ilustrar sinergismo (CI & lt; 0,9), el antagonismo (CI & gt; 1,1). y de forma aditiva (IC = 0,9-1,1)
Estadísticas de Análisis Ensayo MTS
Los incrementos de dosis eran log-transformado, lo que permite una separación igual horizontal de puntos de datos en la curva de respuesta a la dosis. spline se trazó a partir del análisis spline /LOWESS ajuste por GraphPad Prism v4.0 y la concentración dio lugar a la muerte celular 50% se determinó a partir de la curva generada. IC
50 se calcula el valor obtenido ANTILOG. Todos los datos se presentan como media ± error estándar (SE) de al menos dos experimentos independientes.
Western Blot y análisis de proteínas
Las células tratadas con fármaco se lavaron con PBS helado y se resuspendieron en lisis tampón (CelLytic; Sigma-Aldrich; St Louis, MO) en presencia de un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche; Mannheim, Alemania). Los lisados se sometieron a sonicación, se incubaron en hielo durante 20 min y se centrifugó a 14.000 rpm durante 20 min a 4 ° C. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo de Bradford (Bio-Rad, CA, EE.UU.). 20 g de proteína de las muestras se separaron por electroforesis en un 12% SDS-PAGE y electrotransferred a una membrana de PVDF (Immun-Blot PVDF; Bio-Rad, CA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente en leche seca no grasa al 5% (Bio-Rad; CA, EE.UU.) y posteriormente se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Los respectivos anticuerpos primarios fueron utilizados de la siguiente manera: anti-Bcl-XL (Señalización Celular, MA, EE.UU.) a una dilución 1:1000, anti-Bad (Cell Signaling, MA, EE.UU.) a 1; 1000 dilución, anti-Bak (Cell señalización; MA, EE.UU.) 1:1000 dilución, anti-Bax (Cell Signaling, MA, EE.UU.) 1:3000 dilución, anti-caspasa-6 (Cell Signaling, MA, EE.UU.) 1:1000 dilución, anti-P1K3R2 (Cell señalización; MA, EE.UU.) 1:1000 dilución, anti-pAKT (Cell Signaling, MA, EE.UU.) a una dilución 1:1000, anti-calpaína-1 (señalización celular, MA, EE.UU.) a una dilución 1:1000, anti-actina (control de carga; Cell Signaling, MA, EE.UU.) a una dilución 1:3000, anti-Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) 1:3000 dilución, y anti-MCL-1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU. ) a una dilución 1:3000, y anti-Noxa (Calbiochem, Merck; Alemania) 1:1000 dilución. Después de tres lavados con Tween 20 en PBS, las membranas se incubaron durante 1 hr a temperatura ambiente con correspondiente peroxidasa de rábano picante anti-conejo y anti-ratón de anticuerpos secundarios conjugados. Las membranas se lavaron cuatro veces con PBS /Tween 20, y las señales se visualizaron por ECL reactivo (Sistema AmershamTM ECL Plus Western Blotting de detección; GE Healthcare; Buckinghamshire, UK), seguido de exposición a película de quimioluminiscencia (Amersham HyperfilmTM ECL; GE Healthcare ; Buckinghamshire, Reino Unido). Los análisis de inmunotransferencia se repitieron al menos dos veces para cada proteína probado.
despliegue de expresiones genéticas
Todo el genoma de perfiles de expresión de 2 líneas celulares de cáncer (CNE2 y snu1) se llevaron a cabo utilizando el HumanHT-12 todo el genoma de la expresión génica ensayo de hibridación directa v4 (Illumina, San Diego, EE.UU.). El ARN total de las células tratadas con el fármaco se extrajo usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN se cuantificaron usando un espectrofotómetro ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.) y se evaluaron para la degradación mediante el BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, USA) antes del análisis de genes array expresión. El ARN total (500 ng) se convirtió en cDNA, seguido de un
in vitro
transcripción de cRNA marcado con biotina síntesis usando el Kit IIumina® TotalPrep de amplificación del ARN (Illumina, San Diego, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. CRNA marcado, se resuspendieron con reactivos de hibridación y se hibridó a la HumanHT-12 v4 BeadChips durante 18 horas en el horno de hibridación C 58 °. Los BeadChips se lavaron, se bloquearon y se tiñeron para prepararse para la exploración. La intensidad de fluorescencia en cada sonda se escanea utilizando el lector de BeadArray Illumina. Tres experimentos independientes se realizaron para cada muestra.
Selección estadístico de post-tratamiento de los genes expresados diferencialmente
diferencialmente que expresan genes entre los grupos de tratamiento de drogas (gemcitabina y combinación de gemcitabina y gosipol) en los dos líneas celulares (CNE2 y snu1 respectivamente) determinar a partir de la metodología discutida en Wong et.al [27]. Para cada gen, el ANOVA de una vía se aplicó por primera vez para la prueba de las diferencias entre las medias de los dos grupos de tratamiento en un nivel de significación de 0,05. Si se rechaza la hipótesis nula, la prueba post hoc de Dunnett se realizó para determinadas las diferencias entre las dos comparaciones en la tasa de error de la familia sabia de 0,05. Las comparaciones son (i) control (sin tratamiento) versus tratamiento gemcitabina y (ii) control versus tratamiento de combinación. Un gen se expresa de forma diferente marcada (hacia arriba o hacia abajo-regulado) si al menos 1 comparación es detectado por el procedimiento post hoc. Las listas de genes diferenciales de cada línea celular se superponen y se asignan a KEGG vías como se ha descrito previamente en la base de datos DAVID [28]. se estableció valor de aceleración de 0,1 para determinar la importancia de los genes de enriquecimiento plazo en el sistema de anotación DAVID. Se seleccionó una lista de genes de 14065 y 11342 genes expresados diferencialmente de ambas líneas celulares para su posterior evaluación.
Resultados
La sensibilidad de líneas celulares de cáncer a la gemcitabina en relación con Bcl-2 Expresión
cuatro líneas celulares de cáncer nasofaríngeo (NPC) se trataron con diversas concentraciones de gemcitabina (0,001 a 100 M) para evaluar la quimiosensibilidad de gemcitabina. Hubo una amplia gama de IC
se encontró 50 de la sensibilidad mediante el cual gemcitabina CNE2 se encontró que era resistente a la gemcitabina, con IC
50 más de 100 mu M (Figura 1A) y HK1 ser el más sensible a la gemcitabina. Para investigar si la resistencia a gemcitabina está relacionada con una alta expresión de Bcl-2, hemos examinado la expresión basal de Bcl-2 en todas las líneas celulares de la APN. Se observó que la línea celular que tenía una alta expresión de Bcl-2 (CNE2, Figura 1B) era resistente a la gemcitabina. La asociación entre la resistencia a gemcitabina y Bcl-2 expresión se examinó adicionalmente en 3 líneas celulares de cáncer de mama y 3 celular de cáncer gástrico consistente, MCF-7 línea celular de cáncer de mama y línea celular de cáncer gástrico YCC16 que tenía alta expresión de Bcl-2 fueron resistentes a la gemcitabina (Figura 2 y 3). Con la excepción de snu1, bajo nivel o no expresión de Bcl-2 fueron encontrados en las líneas celulares que eran sensibles a la gemcitabina.
(A) IC
50 de gemcitabina a líneas celulares de cáncer de la nasofaringe. La media de IC
50 ± error estándar (EE) de al menos dos experimentos independientes se realizaron por triplicado. Las células se trataron con gemcitabina durante 72 horas y la proliferación celular se evaluó usando el ensayo de MTS. (B) inmunotransferencia de Bcl-2 y la expresión basal en líneas celulares de cáncer nasofaríngeo.
(A) IC
50 de gemcitabina a las líneas celulares de cáncer de mama. La media de IC
50 ± error estándar (EE) de al menos dos experimentos independientes se realizaron por triplicado. Las células se trataron con gemcitabina durante 72 horas y la proliferación celular se evaluó usando el ensayo de MTS. (B) inmunotransferencia de Bcl-2 expresión de línea de base en las líneas celulares de cáncer de mama.
(A) IC
50 de gemcitabina a las líneas celulares de cáncer gástrico. La media de IC
50 de ± error estándar (EE) de al menos dos experimentos independientes se realizaron por triplicado. Las células se trataron con gemcitabina durante 72 horas y la proliferación celular se evaluó usando el ensayo de MTS. (B) inmunotransferencia de Bcl-2 y la expresión basal en líneas celulares de cáncer gástrico.
Similar respuesta a los fármacos para el cáncer líneas celulares entre gosipol y AT101
Tres líneas celulares de cáncer gástrico (AGS, YCC16 y snu1) fueron tratados con gosipol y AT101 para determinar su IC
50, respectivamente. Como se esperaba, (-) - gosipol era más potente que el gosipol racémico pero había generalmente menos de diferencias de 10 veces en IC
50 entre ambos fármacos en líneas celulares gástricas. Todos los posteriores estudios in vitro se llevaron a cabo utilizando el gosipol racémico (Tabla 1) ya que había poca diferencia en la citotoxicidad celular usando cualquiera de los medicamentos. se encontró Gossypol tener actividad moderada en todas las líneas celulares de diez (Figura 4). A diferencia de gemcitabina, no hay una clara asociación entre el nivel de expresión de Bcl-2 en las líneas celulares a la IC
50 de la droga.
nasofaríngeo (n = 4), mama (n = 3) y gástrica (n = 3) líneas celulares de cáncer se ensayaron para determinar su sensibilidad a gosipol. La media de IC
50 de ± error estándar (EE) de al menos dos experimentos independientes se realizaron por triplicado. Las células fueron tratadas con gosipol para hr y 72 células de proliferación se evaluó usando el ensayo de MTS.
sinérgica Interacción de droga entre el gosipol y Gemcitabina Gemcitabina en resistencia (GEM-R) Línea celular con alta Bcl-2 Expresión
Para determinar la posible interacción sinergismo entre el gosipol y gemcitabina, el tratamiento de combinación de fármacos se llevaron a cabo en todas las líneas celulares de cáncer 10. Con la excepción de snu1, se observó sinergismo en las líneas celulares que tenían alta expresión Bcl-2, pero no en líneas celulares que expresaban bajo Bcl-2 (Tabla 2, Figura S1). En conjunto, estas observaciones sugieren que existe una tendencia según la cual las líneas celulares resistentes a gemcitabina que expresaban alto nivel de Bcl-2 son sinérgicos con los tratamientos con fármacos combinados con gemcitabina y gosipol.
reversión de la resistencia gemcitabina por gosipol se asociado con Sobre regulación de Noxa y la baja regulación de Bcl-2 y Bcl-XL
Para investigar los mecanismos moleculares subyacentes de la interacción sinérgica entre el gosipol y gemcitabina, se examinaron los cambios pro-apoptóticos y anti proteínas apoptóticas Bcl-2 en líneas celulares de expresión GEM-R altas (YCC16, CNE2 y MCF7). Como se muestra en la Figura 5, las proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 y /o Bcl-XL) fueron hasta reguladas en todas las líneas que sobreexpresan Bcl-2 de células GEM-R después del tratamiento con gemcitabina. En contraste, el tratamiento con gosipol llevó a la baja regulación de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 y /o Bcl-XL) y sobre regulación de la proteína pro-apoptótica, (Noxa y MCL-1
s) ( Figura 5). Una disminución global de la expresión de Bcl-2 también se observó en todas las líneas celulares GEM-R tratadas con gosipol o tratamiento farmacológico combinado. Sin embargo, la baja regulación de Bcl-XL también se observó en las células MCF-7 cuando las células fueron tratadas con gosipol o tratamiento farmacológico combinado. Se observó un aumento en la escisión de pro-apoptótica MCL-1
S expresión en todas las líneas celulares que sobreexpresan Bcl-2 GEM-R después del tratamiento farmacológico combinado. Sin embargo las expresiones de Bax y Bak mantuvo sin cambios después del tratamiento de drogas. En conjunto, estas observaciones sugieren que la inversión gosipol de la resistencia a gemcitabina implica la baja regulación de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 y /o Bcl-XL) y sobre regulación de las proteínas pro-apoptóticas (Noxa y MCL-1
S).
Las inmunotransferencias de expresión de proteínas de apoptosis en líneas celulares resistentes a gemcitabina (GEM-R) cuando son tratados con la combinación de gemcitabina y gosipol durante 48 horas. Los resultados mostrados son representativos de dos experimentos independientes.
Cambios significativos en ruta apoptótica contribuido a las disparidades de respuesta a la gemcitabina y gosipol
Todo el genoma de perfiles de expresión se llevó a cabo en snu1 (GEM S) y CNE2 (GEM-R) para evaluar mecanismos alternativos para sus diferencias en la respuesta a los fármacos a la gemcitabina sola y gemcitabina /combinación de gosipol (Figura 6). Un total de 2702 genes son expresados diferencialmente en muestras pre y post-tratamiento y fue asignada a 61 procesos biológicos enriquecidos utilizando KEGG vía de análisis. Los procesos biológicos más importantes regulados por estos genes incluyen spliceosome, ciclo celular, metabolismo de las pirimidinas, la señalización de p53 y las vías de apoptosis (ver información de apoyo; Tabla S1). El tratamiento con gemcitabina predominantemente llevó a la sobre regulación de estos genes de respuesta al tratamiento en CNE2 (GEM-R), pero una baja regulación en snu1 (GEM-S) (Figura 6), lo que sugiere que la sobre regulación de estos genes participación en p53 y las vías de apoptosis pueden contribuir a la resistencia a la gemcitabina. Además, casi la mitad de estos genes de respuesta al tratamiento se redujeron regulado en CNE2 (GEM-R) después del tratamiento con gosipol y gemcitabina con cambios mínimos observados en snu1 (GEM-S).
Mapa de calor de 2.702 significativa diferencialmente los genes expresados en gemcitabina resistentes, GEM-R y gemcitabina sensibles, GEM-S tratados con gemcitabina sola (Gem) o en combinación con gosipol (Gem + GOS) con relación a las líneas celulares de control no tratados emparejados. Los niveles de expresión de cada gen son más altos y más bajos que el control se representa en rojo y verde, respectivamente.
Disminución anti y pro-apoptóticos expresiones de genes en el GEM-R y GEM-S Líneas Celulares cuando gosipol se combinó con el tratamiento con gemcitabina
a fin de evaluar los genes que pueden ser responsables de la sensibilidad gemcitabina y sinergismo con el tratamiento combinado con gemcitabina y gosipol, que decidió centrarse únicamente en los genes relacionados con la apoptosis en la vía KEGG que estaban diferencialmente modulada después del tratamiento de la gemcitabina sola y después de la terapia combinada. Se identificaron 65 genes (31 anti-apoptosis y 34 pro-apoptosis) en la ruta apoptótica que son regulados de manera significativa en CNE2 (GEM-R), y 49 genes (23 anti-apoptosis y 26 pro-apoptosis) que son regulados de manera significativa en snu1 (GEM-S) (ver información de apoyo; Tabla S2).
En CNE2 (GEM-R), encontramos que la mayoría de los genes anti-apoptóticos fueron significativamente hasta reguladas cuando las células se trataron con gemcitabina (Figura 7A). Por el contrario, la mayoría de estos genes anti-apoptóticos se redujeron regulado cuando snu1 (GEM-S) fue tratado con gemcitabina sola (Figura 7B). Se observó también que las expresiones de genes de la mayoría de estos genes anti-apoptóticos se redujo significativamente cuando se añadió gosipol a la gemcitabina en CNE2 (GEM-R) (Figura 7A). Del mismo modo los genes anti-apoptóticos que fueron regulados a la baja en snu1 (GEM-S) después del tratamiento con gemcitabina, también fueron encontrados para ser regulados a la baja futher cuando las células fueron tratadas con terapia de combinación (Figura 7B). Sin embargo, también hubo más genes anti-apoptoptic, inicialmente hasta reguladas por gemcitabina pero fueron regulados a la baja en CNE2 (GEM-R) (11 genes) después de la combinación de gosipol y gemcitabina, en comparación con snu1 (4 genes) (Figura 7A y B ).
El registro relativa
2 veces el cambio de grupo de genes anti-apoptóticos (a-B) y el grupo de genes pro-apoptóticos (C-D), tratados con gemcitabina sola (Gem) y en combinación con gosipol (Gem + GOS). Sólo los genes que son expresados diferencialmente de manera significativa desde el control de grupo no tratado se representan en el gráfico. Todos los valores en el eje y se compararon con los controles no tratados de las líneas celulares respectivas. Los valores por encima de cero genes indicados que fueron regulados hasta en su expresión. Los valores inferiores a cero indican que los genes se redujeron reguladas en su expresión y los valores en cero indican ningún cambio en la expresión génica. El registro
2 niveles de genes asociados se normalizaron a la muestra sin tratar.
Similar tendencia a la disminución de los genes pro-apoptóticos expresiones se observó en ambas líneas celulares tratadas con terapia de combinación de fármacos en comparación con líneas celulares tratados con gemcitabina sola (Figura 7C y D). Sin embargo, a pesar de la disminución en la expresión de genes pro-apoptóticos, había más genes pro-apoptóticos en CNE2 (GEM-R) (15/29 genes) que se mantuvo hasta reguladas después del tratamiento combinado (Figura 7C), en comparación con snu1 (GEM -S) (4/12 genes) en el mismo tratamiento (Figura 7D). Cabe señalar que sólo la expresión de los genes de NFKBIA se encontró que era up-reglated en snu1 (GEM-S) después de la terapia de combinación en comparación con su expresión génica durante el tratamiento con gemcitabina (Figura 7D).
Validación de gene Cluster anti-apoptótica en GEM-R y gene Cluster Pro-apoptótica en GEM-S
Para validar el grupo de genes anti- y pro-apoptóticos en CNE2 (GEM-R) y snu1 (GEM-S líneas celulares) que se muestran en la Figura 7, se investigó 5 genes seleccionados en la vía de la apoptosis KEGG que puede tener un papel importante en la apoptosis en respuesta a la gemcitabina y el tratamiento de gosipol (Figura 8). Similar al ensayo de la expresión génica, anti-apoptótica PIK3R2 y expresión de proteínas pAKT se encontró que eran hasta reguladas cuando CNE2 línea celular (GEM-R) se trató con gemcitabina, con una reducción en el nivel de proteína observada sólo en pAKT cuando las células se trataron con el tratamiento de combinación (Figura 9). Gemcitabina snu1 tratado (GEM-S) línea celular mostró cambios mínimos en la expresión de la proteína PIK3R2 y pAKT en comparación con las células no tratadas, pero el tratamiento de combinación con snu1 (GEM-S) línea celular resultó en una reducción significativa de la expresión de la proteína PIK3R2 y pAKT (Figura 9 ).
Hemos observado que hubo un pequeño aumento en la expresión de proteínas de los genes pro-apoptóticos, malo, y CASP6 capn1 después del tratamiento con gemcitabina en tanto CNE2 (GEM-R) y snu1 (GEM S) línea celular (Figura 9). Se encontraron BAD, CASP6 y capn1 ser regulados a la baja durante el tratamiento combinado en la línea celular GEM-S, pero no la línea celular GEM-R (Figura 9). Estas observaciones concurre con los hallazgos en la Figura 5, y sugieren que alternativas de Bcl-2 vías que participan AKT, PI3K, BAD, CASP6 y capn1 pueden ayudar a explicar la respuesta diferencial a la gemcitabina y las interacciones sinérgicas en el tratamiento de combinación de gemcitabina y gosipol.
inmunotransferencia de anti-apoptóticos (pAKT y PI3KR2) y pro-apoptótica (BAD, CASP6 y capn1) genes en la línea celular GEM-R y líneas celulares GEM-S. Las células se trataron con gemcitabina y combinación con gosipol durante 48 horas. Los resultados mostrados son representativos de dos experimentos independientes.
Discusión
Alta expresión de Bcl-2 se ha correlacionado con mal pronóstico clínico en pacientes con cáncer [29], así como la resistencia a la convencional fármacos quimioterapéuticos [30]. Han et al informaron de que la sobreexpresión de Bcl-2 se ha demostrado que se asocia significativamente con la disminución de la sensibilidad al tratamiento gemcitabina, y que su expresión se podría utilizar como un factor predictor de la eficacia del tratamiento con gemcitabina en pacientes con cáncer [12]. En estudios in vitro también ha puesto de manifiesto una correlación directa con un alto contenido celular de Bcl-2 y la resistencia a la gemcitabina en líneas celulares de carcinoma de páncreas [11]. Sin embargo, no hubo conflicto verbal de constatación de ninguna correlación entre Bcl-2 y gemcitabina sensibilidad en el páncreas, próstata, pulmón y cáncer de mama [31].
En nuestro estudio, encontramos que la nasofaringe, mama y las líneas celulares de cáncer gástrico resistentes a gemcitabina tenían una mayor expresión de Bcl-2, y el tratamiento con gemcitabina dio lugar a una regulación de anti-apoptótica Bcl-2 o Bcl-XL. Estas observaciones sugirieron que el nivel de expresión del gen de anti-apoptótica de Bcl-2 y Bcl-XL fue importante en la resistencia gemcitabina. En apoyo de esta conclusión, Schniewind et al encontró una correlación inversa significativa entre la expresión de Bcl-XL y la apoptosis inducida por gemcitabina [32], y que el aumento de la expresión de Bcl-XL inhibe la apoptosis celular a fármacos quimioterapéuticos [33].
Varios informes han demostrado la eficacia de gosipol en la orientación de las células de cáncer con alto nivel de Bcl-2 y sus miembros de la familia, mediante el aumento de la apoptosis celular cuando se usa como un solo agente [19] o en combinación con gemcitabina [34]. Macoska et al mostraron interacción sinérgica en líneas celulares de cáncer de vejiga tratados con gosipol en combinación con gemcitabina o carboplatino, lo que resulta en un aumento de la apoptosis a través de la disminución de expresión de pro-supervivencia expresión Bcl-xl y MCL-1 y el aumento de genes pro-apoptóticos [34]. Sin embargo, uno debe tener en cuenta que no todas las líneas celulares con sobreexpresión de Bcl-2 pueden beneficiarse de la combinación de gosipol con gemcitabina. En nuestro estudio, se observó potencial efecto antagonista de gossylpol y gemcitabina en snu1, una línea celular que tenía alto nivel de Bcl-2, pero fue sensible a la gemcitabina, lo que sugiere una vía alternativa de Bcl-2 en respuesta gemcitabina [35], [36] .
Hemos observado que las líneas celulares GEM-R con alta Bcl-2 tenían hasta reguladas pro-apoptótica Noxa y las reguladas Bcl-2 o Bcl-XL expresión cuando son tratados con cualquiera de gosipol o en combinación con gemcitabina (Figura 5). Se ha sugerido que los objetivos de gosipol Bcl-XL mediante la inhibición de la actividad anti-apoptótica, que son consecuencia directa de la sobre regulación de pro-apoptótica Noxa y Puma expresión [37]. La activación de Noxa también podría conducir a BH3 localización motivo dependiente a la mitocondria y la interacción con miembros de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas, lo que resulta en la activación de la apoptosis [38]. Por otra parte, los estudios han demostrado que hasta reguladas genes pro-apoptóticos, así disminución de la expresión de los genes anti-apoptóticos fueron capaces de aumentar la apoptosis inducida por gosipol en varios tipos de células del cáncer [39], [40]. También demostramos que MCL-1
S se incrementó en una línea celular GEM-R tratadas con gosipol o el tratamiento combinado (Figura 5). Esta observación puede ser apoyado por Meng et al.