Extracto
Antecedentes
El cáncer principal del derivado de cáncer del cuello y cáncer de cuello (CCC) ocupa el cuarto líder de la muerte y la malignidad del cáncer en la población masculina en Taiwán. A pesar de los últimos avances terapéuticos, el pronóstico de los pacientes con CCC sigue siendo pésimo. Se necesitan urgentemente nuevas estrategias para mejorar la quimiosensibilización a los fármacos quimioterapéuticos convencionales y las respuestas clínicas de los pacientes con CCC. Los estudios han demostrado que la terapia fotodinámica mediada por el ácido 5-aminolevulínico tópico (ALA-PDT) se utiliza en el tratamiento de diversas premalignas y malignas humano con algunos resultados clínicos alentadores. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la ALA-PDT en el efecto terapéutico en HNC tumorigénesis y si ALA-PDT como quimiosensibilizador para el tratamiento HNC siguen sin estar claros. La acumulación de células madre del cáncer de soporte de datos (CSC) contribuye quimio-resistencia en HNC. Con base en los estudios anteriores, el objetivo del estudio es investigar el efecto del ALA-TFD en células madre cancerosas y la propiedad quimiosensibilización en HNC.
Metodología /Principal Encontrar
Los CCC marcador de la actividad de la ALDH1 HNC células con tratamiento ALA-TFD, evaluado por el ensayo de flujo Aldefluor análisis de citometría. Se presentaron auto-renovación secundaria formando Esfera-, la expresión de marcadores de troncalidad, y la invasividad de células madre cancerosas HNC-tratamiento con TFD-ALA. Hemos observado que el tratamiento de la ALA-PDT significativamente reducido regulado la actividad ALDH1 y la positividad de CD44 de las células madre cancerosas HNC-. Por otra parte, el ALA-TFD reduce la propiedad de auto-renovación y la expresión firmas stemness (Oct4 y Nanog) en la formación de esferas HNC-células madre cancerosas. ALA-PDT sensibilizado altamente tumorigénicas HNC-células madre cancerosas a quimioterapias convencionales. Por último, el efecto sinérgico de ALA-PDT y cisplatino tratamiento atenúa la invasividad /propiedad colongenicity en HNC-células madre cancerosas.
Conclusión /Importancia
Nuestros resultados proporcionan una visión de la perspectiva clínica de ALA-PDT como potencial tratamiento de quimioterapia adyuvante contra el cáncer de cabeza y cuello a través de la eliminación de la propiedad células madre cancerosas
Visto:. Yu CH, CC Yu (2014) terapia fotodinámica con ácido 5-aminolevulínico (ALA) Perjudicial tumor en marcha y quimio-resistencia en la propiedad cabeza y derivados-Neck Cancer células madre del cáncer. PLoS ONE 9 (1): e87129. doi: 10.1371 /journal.pone.0087129
Editor: Shree Ram Singh, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 6 de diciembre de 2013; Aceptado 22 de diciembre de 2013; Publicado: 24 Enero, 2014
Derechos de Autor © 2014 Yu, Yu. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio con el apoyo de una beca de investigación del Consejo Nacional de Ciencia (100-2632-B-040-001-MY3, 101-2.314-B-040-016, 102-2628-B-040 -001 -MY3) .Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de cabeza y cuello (CCC) es uno de los cánceres más comunes en el mundo y una de las causas de muerte relacionada con el cáncer debido a la recurrencia frecuente después de la resistencia a la quimioterapia [1]. A pesar de las mejoras en el diagnóstico y manejo de HNC, las tasas de supervivencia a largo plazo han mejorado sólo marginalmente en la última década [1]. Se necesitan urgentemente nuevos medicamentos o estrategias para mejorar la quimiosensibilización a los fármacos quimioterapéuticos convencionales y las respuestas clínicas de los pacientes con CCC [2].
Los estudios recientes han señalado resistencia al tratamiento con radioterapias /quimioterapias convencionales es uno de los principales criterios clínicos para la caracterización [2] Las células madre del cáncer (CSC) con auto-renovación y capacidad altamente tumorigenenic en los tumores malignos incluyendo HNC - [4] se han propuesto dos ALDH1 + intracelular y células CD44 + para exhibir propiedades CSC y se han utilizado como células madre cancerosas marcadores funcionales para la cabeza y células madre del cáncer derivados del cáncer del cuello (CCC-CSC) [5] - [7]. Sin embargo, es necesario buscar un método eficaz de orientación HNC-células madre cancerosas para mejorar HNC tumores malignos relacionados con la PI con urgencia [7].
La terapia fotodinámica (TFD) implica dos componentes individualmente no tóxicos, la luz y el fotosensibilizador [8]. La TFD es un tratamiento nuevo y es muy prometedora para muchos tumores sólidos [9]. Los estudios han demostrado que la mediada por ácido tópica 5-aminolevulínico PDT (ALA-PDT) se utiliza en el tratamiento de varias lesiones premalignas y malignas humano con algunos resultados alentadores clínicos [10] - [13]. PDT podría tener el potencial de inhibir la metástasis de HNC tratada de forma incompleta [14]. En un modelo de ratones Lewis de carcinoma de pulmón, ALA-PDT disminuyó la metástasis de las células cancerosas in vivo [15]. Además, ALA-PDT aumenta la capacidad de apoptosis de células de cáncer oral a través de NF-KB /JNK de señalización [16]. ALA-PDT también abrogó capacidad de migración de las células cancerosas orales de baja regulación de la FAK y ERK [17].
A partir de los estudios anteriores, el objetivo del estudio es investigar el efecto de la ALA-PDT el quimiosensibilización y la propiedad células madre cancerosas en HNC. En general, lo primero que demostró ALA-PDT reducir eficazmente la propiedad de CSC-similares, incluyendo la actividad ALDH1, la positividad de CD44, la auto-renovación, la invasión, y el aumento de la quimiosensibilidad en HNC. ALA-PDT sería una terapia potencial quimio-adyuvante y puede ser beneficioso para el tratamiento anti-células madre cancerosas en HNC.
Materiales y Métodos
Las células primarias cultivadas a partir de tejidos HNC
muestras de tejido de pacientes quirúrgicos HNC se recogieron después de obtener el consentimiento informado por escrito y este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional en Chung Shan hospital de la Universidad médica (CSMUH No: CS10249). Se establecieron células HNC primarios como se describe anteriormente [6], [18]. En resumen, después de la eliminación quirúrgica de los tejidos HNC, los tejidos se lavaron 3 veces en glucosa que contiene HBSS, a continuación, las muestras se cortaron con un espesor de 300 micras y los tejidos en rodajas se sumergieron en 0,1% (w /w) de colagenasa que contiene glucosa que contiene HBSS durante 15 minutos a 37 ° C y se sometió a rotación agitador agitación a 125 rpm. HNC cultivo primario se cultivaron en DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) con suero bovino fetal al 10%, suplementado con piruvato 1 mM de sodio, aminoácidos no esenciales, 2 mM L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 g /ml de estreptomicina bajo condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 95% de aire humidificado, 5% de CO
2).
Químicos
5-ALA se obtuvo de Sigma (St . Louis, MO, EE.UU.). Justo antes de su uso, 5-ALA se diluyó adicionalmente en medio de cultivo para apropiarse de las concentraciones finales.
HNC líneas celulares de cultivo y la terapia fotodinámica basada en 5-ALA
Para los estudios ALA-PDT, las células se incubaron con 5-ALA durante 3 horas, y luego se irradia con luz roja de 635 ± 5 nm a varias dosis.
El enriquecimiento de las células madre del cáncer HNC de formación de esferas (HNC-CSC)
Esferas de células HNC se aislaron en un medio que consiste en medio libre de suero DMEM /F12 (GIBCO), suplemento de N2 (GIBCO), 10 ng /ml de factor recombinante humano de crecimiento básico de fibroblastos (FGF básico), y 10 ng /de crecimiento epidérmico ml Factor (EGF) (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN). Las células se sembraron a una densidad de 10
4 células vivas /placas de 10 mm bajas de fijación, y el medio se cambió cada dos días hasta que se observó la formación de esferas tumor en aproximadamente 1 semana [2].
Aldefluor ensayo
Aldefluor kit de ensayo se compra a StemCell Technologies, Inc. (Vancouver, BC, Canadá) 1 × 10
5 células se suspendieron en 50 l de tampón de ensayo y se añaden a la concentración final Aldefluor de 1 M. Para el control inhibidor de ALDH1, DEAB se añadirá a la concentración final de 150 mM. Las células se incubaron a continuación a 37 ° C durante 45 min y se tiñeron con 7-AAD en hielo durante otros 5 min. Después de lavado con PBS, las células positivas de fluorescencia verde en las células vivas (7AAD-) se analizaron por citometría de flujo (FACSCalibur ™, BD Bioscience) por comparación de la intensidad de fluorescencia de la muestra tratada DEAB y estas células se pueden representar como células con alta actividad de ALDH (células ALDH +) [2].
SYBR inversa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
El ARN total de las células fue purificado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA , EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, el ARN total (1 g) de cada muestra se inversamente transcrito por Superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). A continuación, la amplificación se llevó a cabo en un volumen total de 20 l que contenía 0,5 mM de cada cebador, MgCl 4 mM
2, 2 l LightCycler ™ -FastStart ADN Maestro SYBR Green I (Roche Molecular Systems, Alameda, CA, EE.UU. ) y 2 l de 1:10 diluyeron cDNA. El
GAPDH
limpieza de genes se amplificó como patrón de referencia.
GAPDH
cebadores fueron diseñados:
GAPDH gratis (hacia delante): GGGCCAAAAGGGTCATCATC (. Nt 414-434, GenBank adhesión no BC059110.1),
GAPDH gratis (inversa): ATGACCTTGCCCACAGCCTT (nt 713-733). Las reacciones de PCR se prepararon por duplicado y se calienta a 95 ° C durante 10 minutos seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 10 segundos, hibridación a 55 ° C durante 5 segundos, y extensión a 72 ° C durante 20 segundos. Todas las reacciones de PCR se realizaron por triplicado. Las curvas de calibración (valores de umbral de ciclo frente a la concentración de plantilla) se prepararon para cada gen diana y para la referencia endógena (
GAPDH
) en cada muestra. Para confirmar la especificidad de la reacción PCR, los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agrose 1,2% [3]. Primer secuencias se enumeran en la Tabla 1, [3].
Western blot
La extracción de proteínas de las células y Western blot se realizó como se ha descrito. Las muestras (15 mu l) se hirvieron a 95 ° C durante 5 min y se separaron por 10% SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron húmedo a papel de nitrocelulosa Hybond-ECL (Amersham, Arlington Heights, IL, EE.UU.). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: conejo anti-humana Oct4, conejo anti-humana Nanog (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.); conejo anti-GAPDH (MdBio, Inc., Taipei, Taiwán); y el ratón anti-β-actina (Novus Productos Biológicos, Littleton, CO, EE.UU.). bandas de proteínas inmunorreactivas se detectaron por el sistema de detección ECL (Amersham Biosciences Co, Piscataway, NJ, EE.UU.).
in vitro
la invasión de células de ensayo
Para los ensayos de migración transwell , 2 × 10
5 células se sembraron en la cámara superior de un transwell (Corning, Acton, MA, EE.UU.) con una membrana porosa (tamaño de 8,0 micras de poro). Las células se colocaron en placas en medio con suero inferior (0.5% de FBS), y el medio suplementado con suero más alta (10% FBS) se utilizó como un quimioatrayente en la cámara inferior. Se incubaron las células durante 24 horas a 37 ° C y las células que no migran a través de los poros se eliminaron por un hisopo de algodón. Las células en la superficie inferior de la membrana se tiñeron con Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) para mostrar los núcleos; se detectó fluorescencia con un aumento de 100x con un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se contó el número de células fluorescentes en un total de cinco campos seleccionados al azar. En el análisis de la invasión de células in vitro se lo descrito previamente [19].
de colonias en agar suave de ensayo de formación de
Cada pocillo (35 mm) de una placa de cultivo de seis pocillos se revistió con 2 ml de agar inferior (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE.UU.) mezcla (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,6% (w /v) de agar). Después la capa inferior se solidificó, 2 ml de mezcla de agar-medio superior (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,3% (w /v) de agar) que contiene 2 × 10
se añadió 4 células, y los platos se incubaron a 37 ° C durante 4 semanas. Las placas se tiñeron con 0,005% violeta cristal a continuación, se contaron las colonias. El número de colonias totales con un m de diámetro ≥100 fue contado más de cinco campos por pocillo para un total de 15 campos en los experimentos por triplicado [3].
El análisis estadístico
Paquete Estadístico de Ciencias Sociales software (versión 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) fue utilizado para el análisis estadístico. Estudiante de
t
prueba se utilizó para determinar la significación estadística de las diferencias entre los grupos experimentales;
p
los valores inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. El nivel de significación estadística se fijó en 0,05 para todas las pruebas.
Resultados
La inhibición de la actividad en las células HNC ALDH1 bajo tratamiento ALA-TFD
ALDH1, una isoenzima citosólico que es responsable de la oxidación del retinol a ácido retinoico durante la primera diferenciación de células madre han tanto demostrado ser marcadores CSC en cáncer de cabeza y cuello [20], [21]. En primer lugar, se utilizó el sistema de ensayo de actividad de ALDH basado en células in vitro, que se ha demostrado como un marcador HNC-CSC, para examinar los efectos de ALA-PDT sobre la actividad ALDH1 en líneas de células HNC y células HNC cultivadas primarias por citometría de flujo se describe en materiales y métodos. Nuestros datos indicaron que el tratamiento ALA-TFD disminuye significativamente la actividad de las células ALDH1 HNC (Fig. 1).
(A) líneas de células HNC (SAS y Ca9-22) y células HNC primarios (HNC-1 y HNC- 2) se sembró como 1 × 10
6 células /pocillo en 6 pocillos de la placa y luego tratada previamente ALA 1 mM durante 3 horas seguido de la TFD con luz roja a una dosis de 4 único grupo de control sin tratamiento J /cm2 o ALA . células ALDH + se determinaron por el ensayo de Alderfluor y células viables (7-AAD negativo) se utilizaron para el análisis. células DEAB tratados fueron utilizados como control negativo. (B) Los resultados de la cuantificación se muestran en la gráfica de barras. Los experimentos se repitieron tres veces y se muestran resultados representativos. Los resultados se presentan como media ± SD *, p. & Lt; 0,05
ALA-PDT elimina de manera efectiva la capacidad de auto-renovación, la positividad de CD44, y las firmas stemness en HNC-células madre cancerosas
Anteriormente, examinamos la formación de esferas éxito durante pasajes de serie de la cultura, uno de los índices para la evaluación de la propiedad de auto-renovación persistente de células madre del cáncer, y puso de manifiesto que la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas toda HNC-[22]. Para investigar el efecto del ALA-TFD en el mantenimiento de auto-renovación HNC-células madre cancerosas, se evaluó la capacidad de formación de esferas secundaria con el tratamiento ALA-TFD en las células HNC. El tratamiento de células HNC con ALA-PDT interfirió con el tamaño de las esferas cuerpo y los números de HNC-células madre cancerosas (Fig. 2A). Citometría de flujo análisis de la expresión de CD44 indica que el tratamiento ALA-PDT redujo el porcentaje tanto de CD44 + células en HNC-CSC (Fig. 2B). A fin de determinar si la reducción en la eficiencia de formación de esferas tumor con tratamiento ALA-PDT se debió a una disminución de la expresión de marcadores de troncalidad, los genes stemness (Oct-4 y Nanog) de formación de esferas HNC-células madre cancerosas con el control y el tratamiento ALA-PDT se determinó por El análisis de transferencia Western. Los resultados confirmaron que el ALA-PDT tratados con células madre cancerosas HNC-redujo notablemente la transcripción de expresión (Fig. 2C) y el nivel de proteína (Fig. 2D) de los genes de troncalidad.
(A) Para el análisis de auto-renovación, sola suspensión de células se obtiene a partir de esferas primarias HNC-CSC por accutase capacidad de digestión y la formación de esfera secundaria se determinó con procedimiento de cultivo esfera primaria, excepto la densidad de célula de recubrimiento como 10000 células /ml. (B) La expresión de la positividad CD44 de control y tratados con PDT-ALA HNC-CSC se determinó por citometría de flujo análisis. Los datos que se muestran aquí son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05 vs. control. SAS o derivados de Ca9-22 HNC-células madre cancerosas tratadas con el control o ALA-PDT y se analizaron las transcripciones y el nivel de proteína de Octubre-4 y Nanog por tiempo real de RT-PCR (C) y el análisis de inmunotransferencia (D), respectivamente. *, P. & Lt; 0,05 frente a control
administración del tratamiento TFD-ALA mejora la eficacia de la quimioterapia en los CAC-HNC
Los CCC son relativamente resistentes a la quimioterapia [6]. Los resultados que el tratamiento con TFD-ALA regulen las propiedades CSC sugieren un papel para ALA-PDT como una terapia potencial quimioterapia adyuvante. Ensayos de viabilidad celular mostraron que el efecto citotóxico sobre HNC-CSC a cisplatino y fluorouracilo (5-FU) fue significativamente mayor con el tratamiento de combinación ALA-PDT (Fig. 3A). La citometría de flujo análisis de resistencia a múltiples fármacos (MDR) genes indicaron que la quimiorresistencia disminuido por tratamiento ALA-PDT podría atribuirse a la reducción de la expresión de ABCG2 (Fig. 3B). Estos datos sugieren que el tratamiento con TFD-ALA mejoró la resistencia a los medicamentos de HNC-células madre cancerosas a cisplatino y fluorouracilo (5-FU) tratamiento a través de ABCG2 baja regulación.
(A) HNC-células madre cancerosas con ALA-PDT o control tratamiento se sometieron a tratamiento con diferentes concentraciones de cisplatino o 5-FU. La viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT. (B) La citometría de flujo análisis del nivel de expresión del marcador de expresión ABCG2 resistente a los medicamentos en el HNC-células madre cancerosas como se indica.
La coadministración de tratamiento ALA-TFD y cisplatino abrogó la invasividad y clonogenicidad de HNC -CSCs
Dado que los CAC parecen jugar un papel importante en la promoción del tumor iniciar la actividad [3], hemos tratado de medir los efectos sinérgicos de ALA-PDT combinados con el tratamiento con cisplatino sobre la invasión /HNC-clonogenicidad de células madre cancerosas. suspensión de células individuales de los tratados con TFD-ALA-HNC células madre cancerosas fueron tratados con o sin tratamiento con cisplatino se utilizó para el análisis de su invasión /clonogenicidad
in vitro
como se describe en la sección Materiales y Métodos. El tratamiento con cisplatino solo no afectó a la capacidad de invasión en HNC-CSC (Fig. 4A), la combinación de ALA-PDT y tratamiento con cisplatino mejora la eficacia de estos tratamientos (Fig. 4A). Mientras tanto, el efecto sinérgico similar de tratamiento ALA-PDT y quimio-tratamiento también se observó en el ensayo de formación de colonias (Fig. 4B). El tratamiento combinado mostró un efecto sinérgico en la que se deroga la clonogenicidad en HNC-células madre cancerosas. Estos datos indican que la eficacia del tratamiento con quimioterapia de cisplatino en HNC-CSC se puede mejorar con el tratamiento ALA-PDT
.
(A) la capacidad de invasión y (B) formadoras de colonias capacidad en HNC-CSC se examinó después del tratamiento ya sea con ALA-PDT o la quimioterapia con cisplatino o ambos. *, P & lt; 0,05 ALA-PDT versus control; #, P & lt; 0,05 ALA-PDT + cisplatino vs ALA-PDT sola
Discusión
Los CCC son considerados como responsables de la iniciación, propagación y metástasis de tumores [23. ]. Es importante destacar que la existencia de células madre cancerosas podría explicar la reincidencia del cáncer, incluso después del tratamiento clínico, ya sea con radioterapia o quimioterapia en pacientes con cáncer [24]. Por lo tanto, la búsqueda de la nueva estrategia de tratamiento de orientación células madre cancerosas con suerte nos proporcionan nuevos enfoques terapéuticos. En el presente informe, en primer lugar, mostramos ALA-PDT proporciona un efecto terapéutico en HNC-células madre cancerosas mediante la inhibición de las propiedades de los CAC-como el cáncer de cabeza y cuello, tales como la firma stemness, capacidad de migración, y la quimio-resistencia. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio que demuestra el papel fundamental de una terapia basada en ALA-PDT en la orientación derivados de células HNC-CSC y como en el bloqueo del tumor HNC-células madre cancerosas mediada por iniciar la actividad.
transición epitelio-mesenquimal (EMT) es un proceso crítico para el desarrollo embrionario adecuado, y se vuelve a acoplar también en los adultos durante la tumorigénesis [25]. EMT es ampliamente aceptada como una de las propiedades CSC, [26] y la señalización Oct4 /Nanog se ha demostrado que participan en la regulación de la EMT y la metástasis [27]. células epiteliales de cáncer oral pueden adquirir rasgos mesenquimales que facilitan la migración y la invasión a través de proceso de EMT. [28] Se sabe que la EMT puede dar lugar a células con células madre y cáncer iniciar propiedades de células madre que han sido sometidos, por tanto, la EMT son más móviles y metástasis . [26]. Como hemos constatado que el efecto del ALA-TFD en la capacidad de invasión de las CSC-HNC, explorando si el ALA-PDT mediada por células madre cancerosas y capacidades de invasión en función de la vía de EMT serán investigados en el futuro.
La quimioterapia es la plataforma actual para el tratamiento de pacientes con metástasis HNC [29]; sin embargo, el efecto quimioterapéutico es limitado, y sus efectos secundarios interfiere en gran medida con la calidad de vida de los pacientes. CSC se caracterizan clínicamente por la resistencia a la quimioterapia [29]. La presencia de células madre cancerosas da como resultado la baja eficacia de las terapias contra el cáncer y el fracaso de la erradicación del tumor y, finalmente, conduce a la recurrencia del tumor y la metástasis [30]. El HNC-CSC eran altamente resistentes a la quimioterapia [18], y de la quimiorresistencia de estas células fue significativamente inhibido cuando fueron tratados con ALA-PDT. Es de destacar que el tratamiento con TFD-ALA por resultado una disminución en los niveles de proteína MDR células madre cancerosas derivadas de HNC después chemotreatment. Los mecanismos detallados de la red de regulación entre el tratamiento con ALA-TFD en los genes resistentes a los medicamentos requiere una mayor investigación.
En conclusión, el presente estudio demostró los efectos inhibitorios de la ALA-PDT en las propiedades madre-como la quimio-resistencia y en HNC . En particular, aquí una gran necesidad de desentrañar los mecanismos subyacentes de la vía mediada por ALA-TFD en HNC-células madre cancerosas y para evaluar más a fondo las posibilidades terapéuticas de tratamiento ALA-TFD clínicamente.