Extracto
En el presente estudio, se investigó el
in vitro
funciones antitumorales de una chalcona sintéticos derivados 4,3 ', 4', 5 'tetramethoxychalcone (TMOC) en el ovario Células cancerígenas. Se encontró que TMOC inhibe la formación y la proliferación de colonias de A2780 cisplatino línea celular sensible y la línea celular resistente A2780 /CDDP, así como la línea celular de cáncer de ovario SKOV3 de una manera tiempo y dependiente de la dosis. El tratamiento de células A2780 con TMOC resultó en G
0 /G detención del ciclo
1 célula a través de la baja regulación de la ciclina D1 y CDK4, y la sobre regulación de las proteínas p16, p21 y p27. Hemos demostrado que TMOC podría inducir apoptosis de las células a través de la supresión de Bcl-2 y Bcl-XL, pero el aumento de la expresión de Bax y la escisión de PARP-1. El tratamiento de TMOC también redujo la invasión y migración de células A2780. Finalmente, encontramos que TMOC inhibe la activación constitutiva de la ruta de señalización STAT3 e indujo la expresión de la PTEN supresor tumoral independientemente del estado de p53 en las líneas celulares. Estos datos sugieren que TMOC puede ser desarrollado como un agente quimioterapéutico potencial para tratar con eficacia ciertos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de ovario
Visto:. Qi Z, M Liu, Liu Y, Zhang M, G Yang (2014) Tetramethoxychalcone, una Derivado chalcona, suprime la proliferación, los bloques del ciclo celular progresión, e induce la apoptosis de las células del cáncer de ovario humano. PLoS ONE 9 (9): e106206. doi: 10.1371 /journal.pone.0106206
Editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionales de Investigación en Salud, Taiwán
Recibido: 16 de abril, 2014; Aceptado: 3 Agosto 2014; Publicado: 2 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Qi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se incluyen dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81071839 por M. Liu, y los números 91129721 y 81372797 de G. Yang. ), por la Fundación de China Postdoctoral Ciencia (núm 2013M531126) para M. Liu, por el Programa de Pujiang Shanghai (11PJ1402200) del Gobierno Municipal de Shanghai de China por G. Yang, y por el Fondo de Doctorado del Ministerio de Educación de China (20120071110079 ) para G. Yang. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la principal causa de muerte por tumores malignos ginecológicos en las mujeres. Debido a la falta de métodos sensibles y específicos para la detección temprana, casi el 60-70% de los pacientes con cáncer de ovario se diagnostican en estadios avanzados [1], [2]. A pesar de los avances en el tratamiento del cáncer de ovario, que involucra principalmente la cirugía citorreductora seguida de quimioterapia basada en platino, la tasa de supervivencia de pacientes con cáncer de ovario sigue siendo muy baja [3]. Los problemas clínicos, incluyendo resistencia adquirida a quimioterapias convencionales, así como la metástasis y la capacidad invasiva de la enfermedad han deteriorado gravemente el éxito del tratamiento [4], [5]. Por lo tanto, el desarrollo continuo de nuevos agentes terapéuticos para el cáncer de ovario, especialmente para las células resistentes a platino, sigue siendo urgente.
productos naturales y de varias plantas son siempre importantes en el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos [6], [7]. Por ejemplo, los derivados de chalcona (moléculas que contienen 1,3-difenil-2-3propen-1-ona grupos), una de las principales categorías de productos naturales con amplia distribución en las especias, té, cerveza, frutas y verduras, visualizar diversa interesante biológica actividades que incluyen antiinflamatorios, antimicrobianos, antioxidantes y propiedades contra el cáncer [8] - [10]. Específicamente, como una estructura imita de combretastatina A-4 (CA-4), 3 ', 4', se informó de 5'-trimetoxichalcona a exhibir propiedades antimitóticos causadas por la inhibición de la polimerización de la tubulina [11] - [14].
en nuestros esfuerzos para descubrir agentes citotóxicos contra las células de cáncer de ovario, una serie de CA-4 compuestos relacionados fueron sintetizados y evaluados por sus actividades anti-proliferativos en la línea celular de cáncer epitelial de ovario humano A2780
in vitro
(datos no mostrados). Entre estos compuestos, 4,3 ', 4', 5'-tetramethoxychalcone (TMOC, Fig. 1A) poseían la potencia inhibidora más alta contra las células A2780. Sin embargo, con posterioridad
in vitro
ensayos mostraron que TMOC no interrumpió la polimerización de tubulina (fig. 1B), lo que indica que el mecanismo de lucha contra el cáncer de TMOC aún queda por esclarecer.
Materiales y Métodos
Materiales
TMOC se sintetizó de acuerdo con el informe anterior y se determinó mediante espectros incluyendo
1 H-RMN,
13C-RMN, y el espectro de masas de alta resolución (HRMS) que fueron gran estuvo de acuerdo con la literatura [14], [15]. La pureza de TMOC fue de más de 98% que se analizó por HPLC.
RPMI-1640 y suero fetal bovino (FBS) se adquirieron de Thermo Scientific (South Logan, UT, EE.UU.). MTT, indide de propidio (PI), 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI), y el anticuerpo a ß-actina se adquirieron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.). violeta de genciana se adquirió de Solarbio (Pekín, China). El /PI kit de Anexina V-FICT detección de la apoptosis, cámaras de invasión, matrigel, y el anticuerpo de p21 se compraron de BD Biosciences (Franklin Lakes, Nueva York, EE.UU.). tampón de lisis celular y el kit de ensayo de proteína BCA fueron adquiridos de Beyotime (Shanghai, China). membrana de PVDF y los reactivos quimioluminiscentes eran de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.). Los anticuerpos contra la ciclina D1, CDK4, p16, p21, Bcl-xL, Bax, STAT3, p53, PTEN, c-myc eran de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos frente a fosfo-Src (Tyr416), Src, fosfo-STAT3 (Tyr705) y se escindió-PARP-1 fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología.
Cultivo de células y transfección
El ovario epitelial humana líneas celulares de cáncer A2780 y SKOV3 se adquirieron de ATCC. La línea de ovario resistente al cisplatino célula cancerosa A2780 /CDDP fue proporcionado amablemente por el Prof. Ling-Ya, Pan [16]. Inmortalizados pero pre-neoplásicas las células epiteliales de ovario humano T29 se derivan de líneas de células del epitelio superficial del ovario IOSE-29 como se describe anteriormente [17]. Las células se cultivaron de forma rutinaria con RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina en un incubador humidificado a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2. Para los estudios de transfección, las células fueron transfectadas transitoriamente con STAT3-CA (mutante activo constitutivo, A661C y N663C) [18], [19], STAT3-DN (mutante dominante negativo, Y705F) [20] o el vector de control utilizando Fugene HD ( Promega). Las construcciones de STAT3 fueron regalos de Hesham M. Amin (MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, EE.UU.).
in vitro
contra la proliferación de ensayo
La
vitro
actividad anti-proliferativa en de TMOC se midió por el reactivo MTT, como se describe en la literatura [21]. Brevemente, 5 × 10
3 células en 100 l de medio por pocillo en placas de 96 pocillos. Después se incubaron durante 24 h, las células se trataron con diferentes concentraciones de TMOC o DMSO (como control negativo) durante 24 h, 48 h o 72 h. Entonces, el medio con el compuesto o DMSO se reemplazó con 200 l de medio fresco que contiene 10% de MTT (5 mg /ml en PBS) en cada pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 4 h. Por último, el medio que contiene MTT-se desechó y se añadieron 150 l de DMSO por pocillo para disolver los cristales de formazán recién formados. Absorbancia de cada pocillo se determinó con un lector de microplacas (sinergia H4, Bio-Tek) a una longitud de onda de 590 nm. Las tasas de inhibición de la proliferación se calcularon con la siguiente ecuación:
ensayo de formación de colonias
5 × 10
2 células por pocillo fueron sembradas en placas de seis pocillos a una densidad celular única. 48 h más tarde, las células se trataron con diferentes concentraciones de TMOC o DMSO (como control negativo) durante 48 h. A continuación, el medio se reemplazó con medio fresco para permitir el crecimiento celular durante una semana. Las células se fijaron con alcohol metílico durante 15 min y se tiñeron con violeta de genciana de 30 min. Las colonias que constan de más de 50 células fueron contadas.
análisis del ciclo celular
estado del ciclo celular se detectó por citometría de flujo de acuerdo con un método publicado previamente [22], y se analizaron por multiciclo AV ( para windows, versión 320) de software. Brevemente, las células fueron tratadas primero con diversas concentraciones de TMOC o DMSO durante 24 h, y después se recogieron, se lavaron dos veces con 1 x PBS, y se resuspendieron en 200 l de 1 × PBS. Las células se fijaron en 4 ml de helado de etanol 75% a -20 ° C durante la noche y se tiñeron con 500 l PI (50 mg /ml, Sigma) que contiene 0,1% de RNasa (1 mg /ml, Sigma) durante 15 min en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente. Las células fueron luego analizadas por citometría de flujo (FC Cytomics 500 MPL, Beckman Coulter). Los resultados se indican como valores medios de tres determinaciones independientes.
apoptosis de la célula de análisis
Para detectar la apoptosis, las células se incubaron con las diferentes concentraciones de TMOC o DMSO (como control negativo) durante 24 h . Se recogieron las células, se lavaron dos veces con frío 1 × PBS, y se resuspendieron en 200 l de tampón de unión a la densidad de 1 × 10
5 células /ml. Las células fueron teñidas con 5 l de anexina-V y PI, durante 15 minutos en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente y se sometieron a análisis por citometría de flujo. La apoptosis temprana se evaluó en base al porcentaje de células con anexina V + /PI-, mientras que la apoptosis tardía fue la de las células con anexina V + /PI +. Los resultados se indican como valores medios de tres determinaciones independientes.
DAPI y tinción PI
cambios morfológicos integrales de membrana y nucleares de la apoptosis se determinó por tinción DAPI y PI, respectivamente, tal como se describe anteriormente [23 ], [24]. 3 × 10
5 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 48 h, seguido de tratamiento con diluyente o con concentraciones deseadas de TMOC para 24 h. Para la tinción DAPI, las células se lavaron con PBS tres veces, se fijaron con mentol, y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100, seguido por tinción con DAPI (1:2000 dilución, en 1x PBS) a 37 ° C durante 15 min en oscuro. Para la tinción PI, las células se lavaron por PBS tres veces y directamente tiñeron con PI a 37 ° C durante 15 min en la oscuridad. Después de la tinción, las células se lavaron con PBS para eliminar el colorante no unido (PI) y se observaron mediante microscopía de fluorescencia (Olympus). Fluorescente imágenes fueron grabadas usando una cámara CCD enfriado.
cicatrización de heridas ensayo
Para detectar la motilidad celular, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta 90% de confluencia. Una herida cero único fue creado en monocapa de células mediante el uso de una punta de micropipeta estéril. Posteriormente, se eliminó medio con los restos celulares, y se añadió medio libre de suero fresco (sin suplemento de FBS) que contiene diferentes concentraciones de TMOC o DMSO. Las células fueron incubadas a 37 ° C y se tomaron fotografías de cada monocapa heridos a los 0, 36 y 72 h.
Transwell ensayo de invasión
invasión celular se ensayó usando cámaras de pre-recubierto con Matrigel [ ,,,0],25]. Brevemente, 5 × 10
4 células en 300 l sin suero RPM-1640 se sembraron en la cámara superior. La cámara se colocó en una placa de 24 pocillos y los pocillos inferiores contenían medio RPM-1640 con FBS al 10% y diferentes concentraciones de TMOC o DMSO (como control negativo). Después de 24 h de incubación, las células de la superficie superior de la cámara fueron cuidadosamente tomaron muestras con un hisopo de algodón. Las células que migraron a través de la cámara se fijaron con metanol, se tiñeron con violeta de cristal y, posteriormente, contados a partir de 5 áreas diferentes de cada pocillo bajo microscopio invertido. se realizaron al menos tres experimentos independientes.
análisis de transferencia de Western
Las células se trataron con diferentes concentraciones de TMOC o DMSO (como control negativo) durante 24 h, y después se recogieron, se lavaron con frío 1 × PBS dos veces, se lisaron con tampón de lisis de células durante 30 min en hielo, y se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. La concentración de proteína total se determinó mediante kit de ensayo de proteína BCA. Cantidades iguales (30 g por carga) de las muestras de proteína se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE y se transfirieron a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas que después se bloquearon en leche desnatada al 10%, y se hicieron reaccionar con anticuerpos primarios. Después de la incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (HRP), las bandas de proteínas se desarrollaron con los reactivos de quimioluminiscencia.
El análisis estadístico
Los datos se calcularon utilizando Graph Pad Prism y se expresaron como media ± SE Los valores de IC
50 se ajustaron utilizando un modelo de regresión lineal con una dosis-respuesta sigmoidal. Las comparaciones entre los grupos de control y tratados se determinaron mediante emparejado
t
prueba o ANOVA de un factor seguido de pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los resultados se consideraron estadísticamente significativas a los
p
. & Lt; 0,05
Resultados
TMOC suprime el crecimiento celular
Se determinó en primer lugar los efectos antiproliferativos de TMOC en células humanas de carcinoma de ovario, incluyendo A2780 (p53 de tipo salvaje), A2780 /CDDP (sublínea resistente cisplatino de A2780, mutante p53) y SKOV3 (p53 null) células, así como las células T29 epiteliales de ovario preneoplásicas. Las células se trataron con varias concentraciones (que van desde 0,3125 hasta 40 mM) de TMOC durante 24, 48, y 72 horas. Como se muestra en la Fig. 2A, el tratamiento de células A2780 con TMOC dio lugar a una disminución correspondiente de la proliferación celular y la viabilidad de una manera dosis-y dependiente del tiempo. Se obtuvieron efectos similares sobre el tratamiento de A2780 /CDDP y células SKOV3 (Fig 2A). Por el contrario, la sensibilidad de las células T29 a TMOC era mucho bajo, ya que se detectó la concentración de TMOC eficaz en las células T29 en 40 micras de 72 h. El IC
50 valores se calculan y se enumeran en la Tabla 1. Por lo tanto, estos datos sugieren que TMOC tiene un efecto citotóxico sobre las células tumorales de ovario independientemente p53 estado, pero los procesos menos citotoxicidad en las células epiteliales de ovario preneoplásicas. Por otra parte, también a prueba las actividades anti-proliferativos de chalcona (1,3-difenil-2-propen-1-ona), que es el compuesto madre de TMOC (Tabla 1). En comparación con TMOC, chalcona exhibió efecto mucho más débil en la inhibición tanto de crecimiento de células neoplásicas y preneoplásicas, y presentó escasa solubilidad en agua, lo que puede indicar que los cuatro grupos metiloxi son esenciales para las actividades contra el cáncer y las propiedades físico-químicas.
(a) TMOC inhibe la proliferación celular en forma de la dosis y dependiente del tiempo. La viabilidad celular se determinó por ensayos de MTT. (B) Imágenes representativas de las colonias de células después del tratamiento con diversas concentraciones de TMOC para 24 h. tasa de formación (C) Colonia después del tratamiento con TMOC durante 24 h.
En los siguientes experimentos, se determinó el efecto de TMOC en la capacidad de formación de colonias de las líneas celulares de cáncer de ovario. ensayo de formación de colonias es un
vitro
ensayo de supervivencia de células en base a la capacidad de una sola célula a proliferar indefinidamente, reteniendo de ese modo su capacidad reproductiva para formar una colonia que consiste en al menos 50 células. ensayo de formación de colonias es el método de elección para determinar la muerte celular reproductiva después del tratamiento con agentes citotóxicos, y ahora ampliamente utilizado para determinar la citotoxicidad inducida por diversos agentes quimioterapéuticos [26]. En este estudio, como se muestra en la Fig. 2B, el tratamiento de A2780, A2780 /células CDDP, y SKOV3 con TMOC a concentraciones de 0,3125, 0,625, 1,25 y 2,5 M durante 48 horas de formación de colonias dependiente de la dosis inhibido, en comparación con el tratamiento con diluyente (DMSO). El número de colonias formadas por las células tratadas con TMOC o diluyente se resumen en la figura 2C, que confirmó el efecto inhibidos de TMOC en el crecimiento de células de cáncer de ovario.
TMOC induce G
0 /G
1 fase detención del ciclo celular
agentes antitumorales químicos pueden inhibir la proliferación celular a través de la inducción de la detención del ciclo celular. Por lo tanto, para entender cómo el crecimiento celular se inhibió en TMOC, la progresión del ciclo celular se analizó por cuantificación de contenido de ADN mediante citometría de flujo. Se han tratado las células A2780 con TMOC durante 24 horas y se analizó el contenido de ADN de yoduro de propidio (PI) tinción (Fig. 3A). Como se ilustra en la Fig. 3B, en comparación con células de control tratadas con el diluyente, cuando las células A2780 fueron tratados con altas concentraciones de TMOC a los 5, 10 y 20 M, el porcentaje de células en G
0 /G
1 fase se elevó de 42,3 % a 64,1%, y el porcentaje de células en S y G
fase 2 /M se redujo de forma concomitante. Debido a la progresión del ciclo celular está regulada por complejos ciclina /quinasa dependiente de ciclina (CDK), las expresiones incontroladas de las ciclinas y /o CDK pueden conducir a la desregulación del ciclo celular y tumorigénesis [27]. Por lo tanto, se examinó si TMOC afectada ciclinas o CDK expresiones. Como se muestra en la Fig. 3C, el tratamiento de las células con TMOC el regulado las expresiones de ciclina D1 y CDK4, pero hasta reguladas las expresiones de p16, p21
Cip1 y p27
Kip de una manera dependiente de la dosis. En conjunto, las expresiones alteradas de las ciclinas celulares y los inhibidores de CDK pueden estar asociados con la detención del ciclo celular causada por TMOC.
(A) la distribución del ciclo celular después del tratamiento con diferentes concentraciones de TMOC para 24 h. (B) Análisis cuantitativo de las células tratadas con TMOC. (C) La regulación de las proteínas asociadas del ciclo celular en las células A2780. Los experimentos se repitieron tres veces, y se muestra un experimento representativo. *
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p
. & Lt; 0,01 comparado con el control
TMOC induce la apoptosis celular
DAPI núcleos de tinción fue utilizado para visualizar la apoptosis inducida por TMOC. Como se muestra en la Fig. 4A, la apoptosis nuclear de las células A2780 tratados con TMOC se caracteriza por la cromatina condensada y fragmentada manchado con fuertes puntos fluorescentes azules, mientras que las células de control se tiñeron con azul uniforme [24]. Además, la apoptosis también se indica mediante la tinción con PI, un tinte nuclear deterioro de la membrana, como se muestra en la Fig. 4B. Estos resultados indicaron que TMOC podría inducir la apoptosis celular. A fin de determinar el número y la etapa de células apoptóticas, se aplicó Anexina-V /PI doble tinción para cuantificar el número de células apoptóticas tratadas con TMOC [22]. Como se ilustra en la Fig. 4C y 4D, las proporciones totales de células teñidas con anexina V + /PI
- (cuadrante inferior derecho que representa la apoptosis temprana) y Anexina V
+ /PI
+ (el cuadrante superior derecho en representación de la apoptosis tardía y células necrosis) se incrementaron de 1.2% a 35.5% después del tratamiento de las células A2780 con TMOC a 5, 10 y 20 M durante 24 h. Estos datos confirmaron además que TMOC podría inducir fuertemente la apoptosis celular de las células de cáncer de ovario en una forma dependiente de la dosis.
(A) DAPI núcleos tinción se utiliza para visualizar la apoptosis inducida por TMOC. Las flechas representan las células apoptóticas. Barra de escala = 10 micras. absorción (B) PI se analizó bajo un microscopio de fluorescencia. Barra de escala = 50 micras. (C) el flujo de Representante citometría de perfiles de apoptosis y (d) los resultados cuantitativos obtenidos usando Anexina V /PI tinción. (E) Las transferencias Western de las proteínas relacionadas con la apoptosis. El ensayo se repitió tres veces, y se muestra un resultado representativo. *
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A continuación, se investigó la vía de señalización implicados en la apoptosis inducida por TMOC. El análisis de transferencia Western. Hemos demostrado que (Fig. 4E), TMOC regulado hasta la expresión de la proteína pro-apoptótica Bax, pero redujo reguladas las expresiones de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-XL en una forma dependiente hace. Además, en comparación con las células de control, la exposición a TMOC induce la escisión de poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1), un marcador de células que experimentan apoptosis [28]. Estos resultados sugieren que TMOC podría inducir la apoptosis celular a través de estas proteínas.
TMOC suprime la migración celular y la invasión
diseminación metastásica, una de las características de las células del cáncer de ovario, es un factor importante a la baja tasa de supervivencia de los pacientes [29], mientras que los agentes anti-cáncer no sólo puede inhibir el crecimiento de células de cáncer, pero también pueden detener la metástasis de células. En este estudio, para determinar si TMOC suprime la invasión y la migración de células de cáncer de ovario, se realizó la curación y transwell ensayos de invasión de la herida. En ensayo de curación, después de una sola herida estaba rayado en monocapa de células A2780 herida, se cambió el medio con medio libre de suero que contiene TMOC o diluyente (como control) con el fin de evitar la influencia de la proliferación celular. Como se muestra en la Fig. 5A y 5B, la migración de las células se redujo significativamente por TMOC. La supresión de la migración no era debido a la apoptosis o la detención del crecimiento como la concentración de TMOC a 0,5 M o 1 M solamente indujo una baja toxicidad relativa en las células A2780. Los resultados obtenidos a partir del ensayo transwell, mostraron que TMOC inhibe la invasión y la migración de las células A2780 en una forma dependiente de la dosis (Fig. 5C y 5D).
(A) TMOC inhibe la migración celular. fotografías representativas de las células fueron tomadas a tiempo 0, 36 o 72 h. (B) Cuantificación de la cicatrización de heridas. Los experimentos se repitieron tres veces. (C) fotografías representativas de las células invasoras en transwell ensayos invasivos. Barra de escala = 20 micras. (C) Cuantificación de las células A2780 invasivos. Los experimentos se repitieron tres veces. *
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mediadas por TMOC Vías de señalización implicadas en los efectos anticancerígenos
transductor de señal y activador de la transcripción-3 (STAT3), un factor de transcripción oncogénica, a menudo es constitutivamente activa en células de cáncer humano [18]. Estudios recientes han demostrado que la activación de STAT3 desempeña un papel fundamental en la supervivencia, la hiper-proliferación, y la progresión metastásica de cáncer de ovario [30], [31]. Una vez activado, el STAT3 fosforilado puede regular por incremento la expresión de genes, tales como inhibidores de la apoptosis (Bcl-XL, Bcl-2), reguladores del ciclo celular (ciclina D1) y factores oncogénicos de transcripción (c-myc) en la tumorigénesis [32], [33]. Por lo tanto, hemos empleado western blot para probar si la supresión de la vía de señalización de STAT3 estuvo implicado en los efectos anticancerígenos mediadas por TMOC. De hecho, como se muestra en la Fig. 6A, con el aumento de la concentración de TMOC, la fosforilación de STAT3, así como la expresión de c-myc, un objetivo corriente abajo conocida de STAT3 [33], [34], se suprimió dependiente de la dosis en A2780, A2780 /CDDP y SKOV3 células, mientras que ningún efecto sobre los niveles de expresión de STAT3 total fue observado.
(a) tratamiento TMOC inhibieron la fosforilación de STAT3 y regulados hacia abajo el nivel de c-myc en una forma dependiente de la dosis. (B) y A2780 células /CDDP A2780 se transfectaron con STAT3 constitutivamente activa (S3-CA) plásmido, STAT3 dominante negativo (DN S3) plásmido o el control de vectores. (C) Introducción de S3-CA significativa bloqueó la actividad anti-proliferativa de TMOC. Por el contrario, la introducción de S3-DN sensibiliza las células cancerosas al tratamiento TMOC. (D) TMOC inhibió la fosforilación de la quinasa c-Src y regulado hasta el tumor surpressor PTEN en todas las tres líneas celulares, pero sólo hasta reguladas p53 en las células A2780. β-actina se utilizó como control de carga igual. Los experimentos se repitieron tres veces y se muestra un experimento representativo. *
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Para confirmar aún más el papel de STAT3 en la citotoxicidad inducida por TMOC, transfectadas las células A2780 y A2780 /CDDP con STAT3 constitutivamente activa (S3-CA) plásmido, STAT3 dominante negativo (S3-DN) plásmido o control de vectores, respectivamente, y luego se determinó el efecto antiproliferativo de TMOC en las células transfectadas. Como se muestra en la Fig. 6C, la introducción de S3-CA resecued significativamente el efecto antiproliferativo de TMOC. Por el contrario, la introducción de S3-DN sensibiliza las células cancerosas al tratamiento TMOC. En conjunto, estos datos sugieren que TMOC puede provocar su actividad anti-cáncer a través de la inhibición de la vía de señalización STAT3.
Varios estudios han demostrado que la activación constitutiva de STAT3 es a menudo trigged por la no receptor de tirosina quinasa c-Src y regulada negativamente por la supresores de tumores p53 y PTEN [35], [36]. De este modo, también examinamos si TMOC podría suprimir la activación de c-Src quinasa y modular la expresión de p53 y PTEN en las tres líneas celulares de cáncer de ovario. Como se muestra en la Fig. 6D, se encontró que TMOC dosis-dependiente inhibe la fosforilación de c-src quinasa, mientras que el nivel total de c-src se mantuvo sin cambios. Mientras tanto, TMOC hasta regulados los niveles de expresión de PTEN en todas las tres líneas celulares, pero sólo hasta reguladas p53 en células A2780.
Discusión
En un intento de desarrollar nuevos agentes quimioterapéuticos con menos efectos secundarios perjudiciales para tratar el cáncer, productos naturales y sus análogos sintéticos han recibido una gran atención [37]. Por ejemplo, muchos estudios han demostrado que varios compuestos de chalcona, ambos derivados de la naturaleza y las versiones sintéticas, citotóxica de exposiciones y actividades antitumorales [38]. En este estudio, nos propusimos estudiar la actividad anti-cáncer y el mecanismo subyacente de TMOC, un compuesto de chalcona sintética, en líneas celulares de cáncer de ovario. Demostramos que TMOC inhibió significativamente la formación y la proliferación de colonias de A2780, A2780 células /CDDP, y SKOV3 (Fig. 2), lo que sugiere que TMOC puede ser un agente quimioterapéutico eficaz contra tanto las células de cáncer de ovario sensibles y resistentes al cisplatino. Es importante el descubrimiento de que TMOC exhibió una menor toxicidad para pre-neoplásicas las células epiteliales de ovario humano que a las células neoplásicas bajo la misma concentración.
Hemos encontrado que TMOC inducida G 0 G 1 ciclo celular
/
detención a través de la baja regulación de la ciclina D1 y CDK4, y la sobre regulación de las proteínas p16, p21 y p27 (Fig. 3C). La ciclina D1 complejo /CDK4 es responsable de la progresión del ciclo celular a principios de G
1 fase y se sobreexpresa frecuentemente en varios carcinomas humanos incluyendo el cáncer de ovario [39] - [41]. La proteína p16 es un inhibidor específico de complejos CDK-ciclina D, la prevención de la fosforilación de Rb y el reingreso del ciclo celular en G
0 /G
1 fase [39]. p21 y p27, que pertenecen a la familia Cip /Kip, regulan negativamente la progresión del ciclo celular mediante la inhibición de CDK-ciclina complejos [42].
La apoptosis es normalmente un sistema equilibrado estrechamente regulada por anti-apoptótica y pro- efectores apoptóticos, incluyendo proteínas de la familia Bcl-2. Las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-XL promover la supervivencia celular mientras que la proteína pro-apoptótica Bax induce la muerte celular programada. La relación de Bax /Bcl-2 es esencial para la inducción de apoptosis y determina si las células se someterán a la apoptosis [43]. En el presente estudio, el tratamiento TMOC resultó en el aumento de Bax pero condujo a la disminución de Bcl-2 y Bcl-xL (Fig. 4E). El aumento de la relación de Bax /Bcl-2 0,07-1,90 puede ser responsable de la apoptosis concomitante debido a la interrupción de potencial de membrana mitocondrial y la inactivación de las proteínas celulares clave tales como PARP-1.
estudios de acumulación proporcionan una fuerte evidencia de que la activación de STAT3 se ha relacionado con una variedad de tumores incluyendo el mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, etc. [44]. Por lo tanto, la supresión de la vía de señalización STAT3 se ha convertido en una forma efectiva para el tratamiento del cáncer. En nuestra investigación actual, los resultados de las transferencias Western mostraron que la fosforilación de STAT3 y sus proteínas quinasas aguas arriba de tirosina c-Src (Fig. 6A y 6D) fue inhibida por TMOC, que también fue apoyada por la baja regulación de la transcripcionalmente regulados objetivos como la ciclina D1, Bcl-xL y c-myc [33]. Además, hemos identificado que podría TMOC hasta de regular la expresión de PTEN en todas las tres líneas celulares pero sólo hasta regulado la expresión de p53 en células A2780. Aunque, se informó p53 para regular negativamente la fosforilación y la actividad de unión al ADN de STAT3 facilitando el supresor de tumores PTEN [36], [45], nuestros datos revelaron que TMOC provocó la función anti-proliferación y se inhibe la fosforilación de STAT3 independientemente de p53 estado, lo que puede indicar que la actividad anticancerígena de TMOC es independiente de p53.
En conclusión, nos proporcionan una fuerte evidencia de que TMOC inhibe el crecimiento celular y la motilidad, e induce la detención del ciclo celular y la apoptosis de las células del cáncer de ovario humano a través reprimir la activación de STAT3 y c-Src. Sin embargo, estudios posteriores puede ser necesaria para validar la aplicación potencial de TMOC en el tratamiento del cáncer.