Extracto
Las alteraciones en la expresión tetraspanin CO-029 están asociados con la progresión y metástasis de cáncer en el sistema digestivo. Sin embargo, la forma en CO-029 promueve la metástasis del cáncer aún es poco conocido. Para determinar el mecanismo, que silenciados CO-029 expresión en células de cáncer de colon HT29 y encontramos que el knockdown CO-029 redujo significativamente célula capacidad migratoria. La migración celular disminuida fue acompañada por la regulación positiva de tanto dependiente de integrina adhesión célula-matriz en la adhesión célula-célula dependiente de calcio y laminina. Los niveles de superficie celular de integrina α3β1 unión de laminina y fibronectina α5β1-integrina se aumentaron, mientras que el nivel de CD44 se redujo a CO-029 silenciamiento. Estos cambios contribuyen a la adhesión célula-matriz alterada. Los resultados de adhesión célula-célula desregulados, al menos parcialmente, a partir de una mayor actividad de las cadherinas y la reducción del nivel de MelCAM. En conclusión, CO-029 funciona como un regulador de ambos adhesión célula-célula y célula-matriz. Durante la progresión del cáncer de colon, CO-029 promueve el movimiento de las células cancerosas mediante la desregulación adhesiones celulares
Visto:. Guo Q, Xia B, Zhang M, MM Richardson, Li M, Zhang JS, et al. (2012) Tetraspanin CO-029 inhibe el movimiento de la célula de cáncer colorrectal mediante la desregulación de la célula-matriz y las adherencias célula-célula. PLoS ONE 7 (6): e38464. doi: 10.1371 /journal.pone.0038464
Editor: Pan-Chyr Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 8 de Julio, 2011; Aceptado: May 6, 2012; Publicado: 5 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud CA096991. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal, uno de los cánceres más comunes, tiene una alta mortalidad [1]. Los pacientes con metástasis a órganos distantes como el hígado y los pulmones sufren muy mal pronóstico. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares de la progresión del cáncer colorrectal es fundamental para el desarrollo de nuevas estrategias para mejorar las tasas de pronóstico y la supervivencia de pacientes con cáncer colorrectal
.
tetraspaninas regulan una variedad de procesos fisiológicos y patológicos, y algunos son tetraspanins asociado con la progresión del cáncer y la metástasis [2] - [11]. tetraspanin humano CO-029 y su homólogo de rata, D6.1A, se informó inicialmente como un antígeno asociado a tumor expresado en gástrico, colorectal, y células de cáncer pancreático y ejercen progresión actividad promotora del tumor [12]. CO-029 expresión está regulada positivamente con frecuencia en el carcinoma hepatocelular [13]. El nivel de expresión de D6.1A se incrementa notablemente, con respecto a la de una línea parental diferenciada, en una línea celular de hepatoma de rata dediferenciado [14]. La expresión simultánea de integrina α6β4 y no metastásicas en D6.1A pancreático de rata línea celular de adenocarcinoma BSp73AS facilita la metástasis hepática de esta línea [15]. CO-029 también presenta un nivel de expresión mayor en las células de carcinoma de colon metastásico, en comparación con el nivel en células de cáncer de colon primarios [16]. Un posible mecanismo para la actividad de prometastatic CO-029 es su asociación con integrinas o tetraspanins, los cuales afectan la motilidad celular. D6.1A se asocia con integrinas α3β1, α6β1 y α6β4 después de la proteína quinasa C (PKC) de activación [15], [17]. En las líneas celulares de carcinoma pancreático y colorrectal metastásico, la activación de PKC aumenta la colocalización de CO-029 y tetraspanin CD151 con α6β4 integrina en las células tumorales, promueve la internalización de este complejo de integrina tetraspanin, disminuye la adhesión célula-matriz en laminina 332, y aumenta la migración celular [18]. Además, las células tumorales D6.1A-overexpressing liberan los exosomas que contienen D6.1A, y estos exosomas inducir la angiogénesis para facilitar la difusión del tumor [19]. Un estudio reciente mostró que la E-cadherina y p120-catenina antagonizan CO-029 migración promovida de células de cáncer de colon Isreco [20]. Estos estudios sugieren fuertemente un papel importante para CO-029 en la progresión y la metástasis de tumores en el sistema digestivo. Para determinar el mecanismo por el cual CO-029 promueve la progresión tumoral y la metástasis, que silenció a la expresión de CO-029 en células de adenocarcinoma de colon humano HT29. Mediante la combinación in vitro e in vivo, se encontró que la pérdida de CO-029 atenuó significativamente la motilidad celular y altera el equilibrio de las adherencias célula-célula y célula-matriz, que conduce a la disminución de potencial metastásico de las células tumorales.
Materiales y Métodos
cultivo de células, anticuerpos, proteínas de la matriz extracelular, y otros reactivos
HT29 se obtuvo la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano de la ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina.
Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron intergrin α1 mAb TS2 /7, intergrin α2 mAb IIE10, intergrin A3X8 mAb α3, intergrin α5 mAb BIIG2, intergin α6 mAb A6BB, intergrin β1 mAb TS2 /16, intergrin β4 mAb 439-9B (BD Pharmingen, San Diego, CA), CD9 mAbs C9BB [21] y Mab7, CD63 mAb 6H1 [22], CD81 mAb M38, M104 CD82 mAb, CD151 mAb 5C11 y TS151r [23], CO29 mAb NS1116 (amablemente proporcionado por el Dr. Dorothee Herlyn del Wistar Institute), e-cadherina mAB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), EpCAM mAb VU1D9 (Señalización celular, Danvers, MA), EWI2 mAb 5E8 (amablemente proporcionado por el Dr. T. Schweighoffer del Instituto Novartis de Investigación Biomédica), y MelCam mAb P1H12 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Un ratón de IgG2b fue utilizado como anticuerpo de control negativo (Sigma, Saint Louis, MO). Los segundos anticuerpos utilizados en este estudio fueron de cabra anti-ratón de anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante IgG (Sigma, Saint Louis, MO) y isotiocianato de fluoresceína conjugado de cabra anti-ratón o -rat anticuerpo IgG (Biosource International, Camarillo, CA) .
Las proteínas de la matriz extracelular se reconstituyeron membrana basal del ratón Matrigel (BD Biosciences, Mountain View, CA), laminina de ratón 111 (Invitrogen, San Diego, CA), y la fibronectina de plasma humano (Invitrogen, San Diego, CA ). Otros reactivos fueron de Sigma si no se especifica la fuente.
ARN de interferencia y Retrovirus Preparación y Transducción
El CO-029 pequeños ARN de horquilla (shRNA) (TGCTGTTGACAGTGAGCGATGAATGAAACTCTCTATGAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTCATAGAGAGTTTCATTCACTGCCTACTGCCTCGGA), que apunta a la secuencia TGAATGAAACTCTCTATGAA de CO-029 ARNm humano, y el control shRNA (RHS1703) se obtuvieron de OpenBiosystems (Huntsville, AL). Se obtuvo otra CO-029 shRNA que se dirige a una parte diferente de la secuencia de CO-029 (ARNm de OpenBiosystems Materials & amp; Métodos S1). El virus de la estomatitis vesicular (VSV) vectores de expresión de proteínas -G pVSV-G (amablemente por el Dr. C. proporcionar Stipp, Universidad de Iowa) y shRNA fueron transducidas en las células de empaquetamiento GP293 por Lipofectamine 2000 (Invitrogen, San Diego, CA). Después de 48 h, se cosechó el virus que contiene partículas sobrenadante del cultivo, y los restos celulares se eliminó haciendo pasar el sobrenadante a través de un /L filtro de jeringa de 0,45 mol. La cepa vírica purificada se incubó con células HT29 de transducción, y se seleccionaron las células HT29 transducidas con el control o CO-029 shRNA con puromicina. Las células resistentes a la puromicina en CO-029 shRNA transductante fueron ordenados por citometría de flujo para enriquecer la población de células silenciadas-CO-029.
Citometría de Flujo
Las células fueron separadas con un 0,5% de tripsina-EDTA , se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces, se bloquearon con 5% de suero de cabra en DMEM a 4 ° C durante 1 h, se incubaron con mAb primario, y después se tiñeron con FITC-conjugado de cabra anti-IgG de ratón a 4 ° C durante 1 h. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACScan (BD Biosciences).
inmunofluorescencia
Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 3% a temperatura ambiente (RT) durante 15 min, se permeabilizaron con 0,1% de Brij 98 a TA durante 2-5 min, se bloquearon con suero de cabra al 20% a 4 ° C durante 1 h, y se incubaron con mAb primarios a 4 ° C durante 1 h, seguido por tinción con un anticuerpo secundario a 4 ° C durante 1 h. Después de cada incubación de anticuerpos, las células se lavaron tres veces con PBS. Para el análisis de inmunofluorescencia, las células se examinaron con un microscopio de fluorescencia Axiophot (Carl Zeiss, Thornwood, NY), y las imágenes se capturaron usando una cámara digital Optronics.
inmunoprecipitación y Western Blot
inmunoprecipitaciones fueron llevado a cabo como se describe anteriormente [24]. Las células se lisaron con tampón de lisis Nonidet P-40 al 1% a 4 ° C durante 1 h. En algunos experimentos, la superficie celular se marcó con 0,5 mg /ml EzLink sulfo-NHS-LC biotina (Pierce) antes de la lisis celular. Después de retirar el material insoluble por centrifugación a 14.000 x g y dos carreras de pre-aclaramiento, los lisados se incubaron con la proteína absorbida-mAb primario A- y perlas de G-Sepharose (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a partir de 3 h a toda la noche a 4 DO. Los inmunoprecipitados se lavaron con tampón de lisis tres veces, disueltos en tampón de muestra Laemmli, se calentó a 95 ° C durante 5 min, se separó por SDS-PAGE, y después se transfirieron eléctricamente a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA). Las membranas se transfirieron secuencialmente con Ab primario y peroxidasa de rábano conjugada segundo Ab (Sigma) para los experimentos de inmunotransferencia o de rábano picante extravidina conjugada con peroxidasa (Sigma) para los experimentos de biotinilación, seguido por quimioluminiscencia (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA).
celular Ensayos de adhesión
ensayo de adhesión célula-matriz se realizó tal como se describe en nuestro estudio anterior [25]. Brevemente, placas de microcultivo de 96 pocillos (BD Bioscience) se recubrieron con laminina de ratón 111 o fibronectina a 4 ° C durante la noche y luego se bloquearon con albúmina de suero bovino inactivado por calor al 1% (Sigma) a 37 ° C durante 1 h. La laminina 332 se preparó mediante el cultivo de células RAC-11P en la confluencia en las placas de 96 pocillos durante 3 días como se describió anteriormente [26]. Las células se trataron con tripsina y se suspendieron en medio DMEM libre de suero a una densidad de 1 × 10
4 células /ml, y 0,1 ml de la suspensión celular a continuación, se añadió a cada pocillo. Después de la incubación durante 1 hora a 37 ° C, las células no unidas se eliminaron por lavado cuatro veces con PBS. se contaron visualmente las células unidas.
la adhesión célula-célula se examinó mediante el ensayo de agregación gota colgante como se describe anteriormente [27]. Las células se separaron con 0.5% tripsina-EDTA y se lavaron con PBS dos veces, a continuación, mostrada en la suspensión de una sola célula por tres pases suaves través de una aguja de calibre 27. La suspensión de una sola célula de 1 × 10
4 células en 30 l de solución se suspendió como una gota colgante de la tapa de una placa de cultivo de 24 pocillos y se dejaron agregar durante una noche a 37
oC en 5% de CO
2 con la humedad. DMEM completo se utilizó para la medición de la adherencia total de la célula-célula, mientras que DMEM libre de calcio era de adhesividad célula-célula independiente del calcio. Para ensayar la resistencia de adhesión célula-célula a la tensión mecánica, las células se sometieron a la fuerza de cizallamiento pasándolos a través de una punta de pipeta de 200 l 10 veces. adhesión célula-célula independiente de calcio también se midió bajo una tensión mecánica relativamente leve [28]. En pocas palabras, después de lavar con solución salina de Puck (mM KCl 5, NaCl 140 mM, NaHCO3 8, pH 7,4), la suspensión de una sola célula (1 × 10
5 células /ml) se incubó en 5% de CO
2 a 37 ° C durante la noche con agitación a 80 rpm en un agitador orbital. Las células fueron fotografiadas antes o después de la tensión mecánica. adhesividad célula-célula después de la tensión de cizallamiento se cuantificó como i) el porcentaje de células agregadas y /o ii) la zona cubierta por los agregados. Basándose en el recuento de células individuales, el porcentaje de células agregadas se calculó utilizando la fórmula% de agregación = [1- (número de células individuales /número de células totales)] x 100. El área de superficie cubierta por los agregados se midió mediante el uso de software ImageJ para representar el grado de agregación celular. agregado celular se define como un grupo de células que contiene cuatro o más células.
se realizó de Migración Celular Ensayos
Herida ensayo de curación como se describe en nuestro estudio anterior [29]. Brevemente, las células fueron sembradas en pocillos individuales de una placa de cultivo de 24 pocillos. Cuando las células alcanzaron la confluencia, una monocapa de células se trató primero con 10 mg /ml de mitomicina C durante 30 min para bloquear la mitosis y por lo tanto permitir el análisis de la migración celular en ausencia de proliferación celular. A continuación, la monocapa celular fue herido con una punta de pipeta estéril l, 200-. Los restos de células y medio se retira y se repone por 2 ml de medio fresco. Las células se fotografiaron por microscopía de contraste de fase cada 24 h después de la herida. Para evaluar "cierre de la herida", cinco áreas a lo largo de la herida fueron elegidos al azar para el cálculo de la anchura media para cada pozo. Fotos fueron tomadas en diferentes puntos de tiempo mediante un microscopio Olympus contraste de fase invertida
.
ensayo de migración de células Transwell se realizó como se describe en nuestro estudio anterior [30]. En pocas palabras, el tamaño de poro de 8 m, de 24 pocillos insertos Transwell (BD Bioscience, Bedford, MA) se recubrió previamente con 10 g /ml de laminina 111 o la fibronectina en la parte inferior de las piezas de inserción a 4 ° C durante la noche y se bloqueó con 0,1% albúmina de suero bovino inactivado por calor (BSA) a 37 ° C durante 1 h. Un total de 2 × 10
se añadió 4 células en DMEM libre de suero que contiene 0,1% de BSA inactivado por calor en un volumen de 300 l a la cámara superior, y 500 DMEM l que contiene 1% de FBS, se añadieron a la cámara inferior . Las células en los cultivos polarizados se incubaron durante 24 horas a 37 ° C. Las células restantes en la superficie superior de los insertos se eliminaron frotando con un hisopo de algodón, y las células que transmigrado través de los poros se fijaron y tiñeron con Diff-Quik Kit (Dade Behring, Inc., Newark, DE). La migración se cuantifica contando las células en la superficie inferior de la inserción.
Análisis estadísticos
Todos los experimentos se realizaron al menos cuatro veces. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se llevó a cabo por el estudiante de
t-test
, y
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
El silencio de CO. -029 expresión en células de cáncer de colon HT29
Para determinar las funciones mecánicas de tetraspanin CO-029 en la progresión tumoral, establecimos un transductante estable en células de adenocarcinoma de colon humano HT29 [31], en el que CO-029 era la expresión derribado por shRNA. Los efectos de silenciamiento de la expresión celular total y la superficie de células CO-029 de proteínas se evaluaron mediante el uso de transferencia de Western y citometría de flujo, respectivamente (Figura 1). En comparación con el transductante expresando control o nonsilencing (NS) shRNA, el transductante expresar CO-029 shRNA (KD) exhibió una reducción sustancial de CO-029 expresión en la superficie celular (Figura 1A), que van desde aproximadamente 60% a 90%, dependiendo del estado de confluencia de células en cada experimento individual, y una gran pérdida de celulares totales CO-029 proteínas (Figura 1B), típicamente aproximadamente 90%. El silencio resultante de CO-029 shRNA fue específica a CO-029 debido a que la expresión de muchas otras proteínas de superficie, especialmente otros miembros de la superfamilia tetraspanin, no se redujo (ver a continuación).
El CO-029 shRNA y nonsilencing shRNA se expresaron de forma estable en las células HT29. Análisis de citometría de (A) de flujo de CO-029 expresión en la superficie de células HT29 que fueron transfectadas con nonsilencing (NS) o construcciones CO-029 shRNA (KD). El control negativo fue mAb murino IgG, y CO-029 mAb era NS1116. La intensidad media de fluorescencia (MFI) de CO-029 en las células KD era 62% menor en comparación con la de las células NS. (B) Análisis de transferencia Western de CO-029 proteínas en células NS y KD HT29. KD células muestran un 90% de reducción de CO-029 proteínas. β-actina:.
control de carga
El silencio de CO-029 Expresión alterada migración de las células HT29
Se evaluó en primer lugar el efecto de silenciamiento CO-029 sobre la migración de las células cancerosas. Para comparar la capacidad migratoria de células de NS y KD transductantes, se realizó el ensayo de curación 1) herida para analizar la migración celular colectiva, es decir, de células de adhesión celular dependiente de la migración celular, y 2) ensayo de migración transwell analizar la migración de células de aislamiento, es decir, célula-célula la migración de células de adhesión-independiente. En los experimentos de cicatrización de heridas, la tasa de repoblación o el proceso de curación de la monocapa heridos se redujo notablemente en las células transductantes CO-029 KD, y dicha reducción duraron varios días (Figura 2A y la Figura S1A). La cicatrización de la herida reducida no fue el resultado de la proliferación celular más lenta de las células KD porque los experimentos se realizaron en presencia de mitomicina. El deterioro de la capacidad de las células KD en la migración celular también puede observarse en el ensayo de migración transwell. La migración celular a través del filtro de membrana de poros en proteínas de la matriz extracelular tales como laminina y fibronectina 111 se redujo significativamente en el silenciamiento de CO-029 expresión (Figura 2B y la Figura S1B). Estos resultados indican que el silencio de CO-029 atenúa la capacidad general de la migración celular y que se requiere la expresión de CO-029 para la migración celular fuerte o robusto.
(A) Herida ensayo de curación. En comparación con las células NS, cierre de la herida fue significativamente afectada en las células KD a las 72 h después de la creación de las heridas en monocapas de células confluentes. ensayo de migración (B) Transwell. Los KD células muestran la motilidad alterada en transwell experimentos de migración. Los datos se muestran como media ± SD, n = 4. *
P
. & Lt; 0,05
Además de la migración celular en la matriz de 2 dimensiones, la invasión celular es un importante parámetro para medir la motilidad celular a través de microambiente 3 dimensiones (3D) para las células cancerosas invasivas y metastásicas. invasividad celular se mide por la capacidad de las células HT29 transductantes para invadir a través de Matrigel, una matriz 3D similar a la membrana basal, o colágeno de tipo I gel, una matriz 3D similar al tejido conectivo. No encontramos ninguna invasión significativa de cualquiera de los grupos de células HT29-KD a través de cualquiera de estos entornos de matriz 3D (datos no presentados), lo que sugiere que las células HT29 no son invasivos, al menos en este ensayo de invasión y bajo la
in vitro
condición de prueba.
CO-029 Regulado célula-matriz y la adhesión célula-célula
tumor célula-matriz y célula-célula adherencias se consideran los eventos clave que regulan la cascada metastásica [ ,,,0],32] - [34]. Para evaluar el efecto de silenciamiento CO-029 en la adhesión célula-matriz, se analizaron y compararon la capacidad de adhesión célula-matriz de KD y NS transductores de laminina y fibronectina. Como se muestra en la Figura 3A, HT29-NS y -kd células muestran diferentes capacidades de adhesión. Los KD células exhiben una mayor adhesividad en las proteínas de la matriz extracelular laminina 111 y laminina 332, lo que sugiere que CO-029 restringe la adhesión celular en la membrana basal, que es el entorno de matriz enriquecida en lamininas. La adhesión de las células en la fibronectina, sin embargo, no mostró diferencias entre NS y células kD (Figura 3A). También se examinó la adhesión celular en hialuronano, un importante proteoglicano de medio extracelular y el ligando de CD44, debido a la expresión de CD44 disminuyó en la superficie de las células HT29-KD. Sin embargo, HT29 células parecían no adherirse a hialuronano, aunque un protocolo establecido fue seguido para este ensayo [35].
(A) la adhesión célula-matriz. La adhesión a la laminina 111, laminina 332, y fibronectina de HT29-NS y -kd células se ensayó después de incubación a 37
oC en 5% de CO
2 para 1 h. La adhesión de las células KD en laminina 111 y laminina 332 se incrementó significativamente en comparación con células NS (
P
= .042 en la laminina 111 y = .048 en la laminina 332). (B) la adhesión célula-célula total. la agregación celular se midió en el Ca
++ - que contiene medios de comunicación después de que se aplica una relativamente fuerte fuerza mecánica. (C) Ca
++ - la adhesión célula-célula independiente. la agregación celular se midió en el Ca
++ - medios libres después de que se aplican fuerzas mecánicas relativamente fuertes o suaves, respectivamente. La agregación de células NS y Kd después de la tensión de cizallamiento se cuantificaron como se describe en Materiales y Métodos.
Los valores P ¿Cuáles son 0,03 para las células agregadas en presencia de Ca
++, 0.001 para la zona de los agregados en presencia de Ca
++ y 0,0004 para el estrés leve en ausencia de Ca
++. Imágenes de agregados de células después del tratamiento de esfuerzo cortante se obtuvieron con un microscopio de contraste de fase. Todos los datos se proyectan como media ± SEM (n = 4). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01
Para evaluar el efecto del CO-029 silenciamiento de adhesión célula-célula , se realizó un ensayo de agregación celular. En primer lugar, se examinó la agregación de células en presencia de Ca
++ [28], lo que refleja la capacidad de adhesión total de célula-célula que incluye tanto la adherencia célula-célula cadherina-dependiente y -independiente. Silenciamiento de CO-029 dio como resultado un aumento de la capacidad para formar los agregados de células que son resistentes a la tensión mecánica relativamente fuerte, en comparación con células NS (Figura 3B). A continuación, se analizó la agregación de célula-célula en ausencia de Ca
++, que refleja la adherencia célula-célula cadherina-independiente como la mediada por proteínas IgSF. Ca
++ - la adhesión célula-célula independiente no mostró ninguna diferencia después se aplicó relativamente fuerte tensión mecánica, pero se downregulated en las células después de KD fuerza mecánica relativamente leve se aplicó (Figura 3B). En las células HT29, Ca
++ - adhesión célula-célula dependiente hace una importante contribución a la total adhesión célula-célula, basado en la comparación entre la magnitud de Ca
++ - agregados dependientes e independientes del fuerte después mecánica tratamiento de estrés (Figura 3B). Juntos, CO-029 confines total y Ca
++ -. Adhesión célula-célula dependiente
CO-029 Silenciar la superficie celular alterada perfil de expresión de moléculas de adhesión
Los cambios en la superficie expresión de tetraspanins, integrinas y proteínas de adhesión celular están implicados en la progresión tumoral y la metástasis [17], [36] - [42]. Para determinar el mecanismo por el cual CO-029 regula célula-célula y adherencias -matrix, medimos y comparamos los niveles de expresión de proteínas de adhesión celular en la superficie del HT29-NS y -kd células. Para las proteínas de adhesión célula-matriz, receptor de laminina y fibronectina integrina α3 del receptor de integrina α5 se upregulated después de silenciar CO-029. β1 integrinas, β4, α1, α2 y α6 se mantuvo sin cambios, mientras que los receptores CD44 hialuronano fue marcadamente regulado por disminución en la superficie celular (Figura 4A). Para determinar si CO-029 silenciamiento afecta a la activación de la integrina, medimos y comparamos los niveles de estado estacionario de las integrinas ß1 activos en HT29-NS y -kd células con citometría de flujo utilizando mAb β1 integrina GA89. La integrina β1 mAb GA89 sólo reconoce las integrinas beta 1 en estado activo [43]. Aunque el nivel de integrinas beta 1 activo fue significativamente mayor en la superficie celular de las células HT29-KD (Figura 4B izquierda histograma), que se mantuvo sin cambios después de ser calibrado con el nivel de integrinas totales beta 1 en la superficie celular (Figura 4B histograma a la derecha). Para las moléculas de adhesión célula-célula, el nivel de proteínas de E-cadherina no se alteró en la superficie celular (Figura 4C). También se examinaron otras moléculas de adhesión célula-célula relacionados con CO-029 y /o tetraspanins como EpCAM, MelCAM, y EWI2, que participan en Ca
++ - la adhesión célula-célula independiente y algunos de los cuales pertenecen a IgSF . Sólo MelCAM se downregulated notablemente en la superficie celular (Figura 4C). Tetraspanins CD9, CD63, CD81, CD82, CD151 y mostraron ninguna alteración significativa en la superficie celular tras la CO-029 silenciamiento (Figura 4D)
.
Los niveles de expresión de proteínas de adhesión célula-matriz (A), β1 activo integrinas (B), las proteínas de adhesión célula-célula (C), y tetraspanins (D) en la superficie de las células HT29-NS y transfectantes -KD se midieron mediante citometría de flujo. Los niveles relativos de estas proteínas en las células KD a las células NS se presentan como histogramas (media ± SD, n = 4~8). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01. En (B), después normalizado por los correspondientes niveles relativos de la integrina β1 en total, los niveles de integrina β1 activo con respecto a las células NS se presentan en el histograma a la derecha.
CO-029 y la formación de adhesión focal, de fibras de estrés y de unión adherente
a fin de evaluar el efecto de silenciamiento CO-029 sobre la adhesión celular, examinamos adhesión focal y de unión adherente de las células HT29 transfectantes mediante tinción i) vinculina, una marcador de adhesión focal, y ii) e-cadherina y β-catenina, los marcadores de la unión adherente, respectivamente. Se encontró que el CO-029 silenciamiento como resultado la formación reducida de adhesión focal, como se muestra en la Figura 5A. Mientras tanto, la formación de fibras de estrés cerca de la superficie basal de las células HT29-KD también se convirtió en menos robusto en comparación con el de las células HT29-NS (Figura 5A). Por el contrario, CO-029 silenciamiento no parece tener un efecto perjudicial sobre la formación de unión adherente, en base a E-cadherina y tinción β-catenina (Figura 5B). La malla cortical de actina a lo largo de la superficie lateral o de unión adherente exhibió ninguna diferencia marcada entre NS y células transfectantes KD (datos no mostrados)
.
HT29 transfectantes se sembraron en cubreobjetos de vidrio y se cultivaron en medio completo durante 2 días (para vinculina y F-actina tinción, a) o hasta confluencia (para e-cadherina y la tinción de β-catenina, B). las células se fijaron, permeabilizaron y se incubaron con anticuerpos monoclonales primarios a 4 ° C durante la noche, seguido de Alex Fluor 594 conjugado con tinción Ab secundario. F-actina se tiñó por Alex Fluor 594 faloidina conjugada. Las imágenes fueron capturadas con microscopía confocal. Bar = 20 micras.
El efecto de silenciamiento CO-029 sobre la formación de microdominios enriquecidos con Tetraspanin (TEM)
Desde CO-029 se asocia con tetraspanins como CD9 y CD151 y las integrinas de unión a laminina [11], se analizó el efecto de la CO-029 silenciamiento de la estabilidad de TEM. Las asociaciones de CD151 con la unión de laminina-integrinas α3β1, α6β1 y α6β4 permanecieron estables bajo una condición de lisis rigurosas, es decir, 1% de Triton X100 mediada por la lisis celular, mientras que las asociaciones de CD151 con otras tetraspaninas permanecieron estables bajo solamente una lisis relativamente suave condición, es decir, la lisis celular, mediada 97-Brij 1% [3]. CO-029 silenciamiento no afectó a los perfiles de inmunoprecipitación de CD151 bajo cualquiera de las condiciones de lisis (Figura 6A). Más integrinas de unión a laminina fueron co-precipitaron con CD151 con la condición de lisis NP40 1% a la CO-029 silenciamiento. Tanto CD151 y CD9 asociados con CO-029 con la condición de lisis 1% de Brij 97, según lo revelado por los perfiles de inmunoprecipitación CD151 y CD9, mientras que estas asociaciones fueron interrumpidas por debajo del 1% Triton X100 condición de lisis, como se esperaba. Bajo la condición de lisis 1% de Brij 97, CO-029 inmunoprecipitados también revelaron asociación CD9-CO-029 pero ninguna asociación debido a la menor biotinilación de CD151 y co-migración de CD151 con CO-029 (Figura 6A) CD151-CO-029.
células (a) La superficie con biotina HT29-NS y transfectantes -KD se lisaron con tampones detergentes indicados. Tetraspanins CD9, CD151, y CO-029 fueron inmunoprecipitadas de los lisados, separadas por SDS-PAGE, y se detectaron por un aumento de quimioluminiscencia. Los niveles de proteínas ß-actina en los lisados se analizaron mediante transferencia Western y sirvieron como control de entrada lisado. (B) Los niveles de expresión de la integrina α3β1 no unido CD151, CD151 totales, homoclustered CD9, y CD9 totales en la superficie de las células transfectantes -kd HT29-NS y se midieron por el mAb TS151r, 5C11, C9BB, y Mab7, respectivamente, utilizando citometría de flujo. Los niveles relativos de CD151 y CD9 sobre KD células a células NS se presentan como histogramas (media ± SD, n = 3~5).
Algunas de las proteínas CD151 en la superficie se unen celular integrina α3β1 en forma una interacción proteína-proteína directa [3]. Se analizó el nivel de proteínas integrinas α3β1-CD151 unido o "libre", que son reconocidos por mAb CD151 TS151r [23]. En la superficie de la célula, ni el nivel de la libre CD151 ni el nivel total CD151-normalizada de libre CD151 se cambió a CO-029 silenciamiento (Figura 6B). Del mismo modo, las proteínas CD9 en la superficie celular o bien se homoclustered o asociados con TEM [21]. Se encontró que ni el nivel de CD9 homoclustered ni el nivel total CD9-normalizada de CD9 homoclustered se cambió a CO-029 silenciamiento (Figura 6B). En conjunto, estas observaciones sugieren que el CO-029 no se requiere para la interacción de CD151 y CD9 con TEM.
Discusión
tetraspaninas regulan la progresión del tumor y la metástasis. Pero los mecanismos siguen siendo en gran parte desconocido. A nivel celular, tetraspanins modular la adhesión celular, la migración, la proliferación y fusión. La adhesividad y la motilidad de las células tumorales determinan parcialmente potencial metastásico del tumor. Por lo tanto, en el nivel celular, tetraspanins probablemente regulan la metástasis del tumor mediante la modulación de las capacidades de las células tumorales para adherirse y moverse. A nivel molecular, tetraspanins asociado con integrinas, proteínas IgSF, factores de crecimiento y sus receptores, proteasas y proteínas de señalización intracelulares para formar TEM [44] - [47]. Por lo tanto, en el nivel molecular, tetraspanins regulan la progresión del tumor y la metástasis probablemente mediante la alteración de las funciones de las proteínas asociadas [48] - [51].
La expresión de tetraspanin CO-029 es típicamente relacionadas con la mala prognosis de cánceres del aparato digestivo [12], [16], [18], [46], [52], [53], CO-029 es upregulated en la progresión del cáncer colorrectal, hígado, páncreas y esófago [11], [ ,,,0],46], [54], y el aumento de la expresión de CO-029 promueve el hígado o el pulmón metástasis de estos tipos de cáncer [17], [52], [53], [55]. la migración de células tumorales y la invasión son indispensables para la metástasis. El movimiento de las células tumorales está implicado en al menos dos fases en la cascada de metástasis [52]. La primera fase es que las células tumorales migran desde el tumor primario e invaden el sistema circulatorio; la segunda fase es que las células tumorales migran fuera de los vasos sanguíneos y en los tejidos diana. El movimiento de las células reducido a CO-029 silenciamiento indica que se requiere CO-029 para la migración eficiente y la invasión de células de cáncer colorrectal y sugiere que el CO-029 probable que promueve las dos etapas de la metástasis tumoral.
Aparece
CO-029 para promover el movimiento de células mediante la alteración de célula-matriz y las adherencias de célula. Está bien establecido que la adhesión -matrix célula-célula y determina directamente la motilidad celular. Por ejemplo, la pérdida o reducción de la expresión y /o actividad de E-cadherina en las células tumorales conduce a la expedición de las células tumorales de la masa tumoral primaria [56].