Extracto
cuasinoides son un grupo de diterpenos encuentra en las plantas de la familia Simaroubáceas . También son los principales compuestos bioactivos que se encuentran en
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que se utiliza comúnmente como medicina tradicional en el sudeste de Asia para tratar varias dolencias incluyendo la disfunción sexual e infertilidad. Estos usos se atribuyen a su capacidad para mejorar el nivel de testosterona en los hombres. El consumo crónico de
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extractos longifolia
se ha informado a aumentar el nivel de testosterona en los hombres y modelo animal, pero se desconoce su efecto sobre el crecimiento de la próstata. Por lo tanto, el presente estudio investiga los efectos de una composición normalizada total de cuasinoides (SQ40) que contiene un 40% de los cuasinoides totales que se encuentran en
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en la línea celular de cáncer de próstata humano LNCaP. SQ40 inhibe el crecimiento de células LNCaP en IC
50 valor de 5,97 g /ml, mientras que la IC
50 en RWPE-1 en las células normales de la próstata humana fue 59,26 mg /ml. SQ40 también el crecimiento estimulado-5α-dihidrotestosterona inhibida en las células LNCaP dependiente de la dosis. El efecto inhibidor de SQ40 en el crecimiento independiente de anclaje de las células LNCaP también se demostró usando el ensayo de agar blando. SQ40 suprimió el crecimiento de células LNCaP a través de G
0 /G
1 fase de la detención que estuvo acompañada por la baja regulación de CDK4, CDK2, ciclina D1 y ciclina D3 y sobre regulación de p21
proteína Waf1 /Cip1 los niveles. SQ40 a concentraciones más elevadas o la duración de tratamiento más largo puede causar la detención G
2 M de crecimiento conduce a la muerte celular por apoptosis como se demuestra por la detección de poli (ADP-ribosa) polimerasa de escisión en las células LNCaP. Por otra parte, SQ40 también inhibió la translocación del receptor de andrógenos a núcleo que es importante para la transactivación de su gen diana, el antígeno específico de la próstata (PSA) y resultó en una reducción significativa de la secreción de PSA después del tratamiento. Además, la inyección intraperitoneal de 5 y 10 mg /kg de SQ40 también suprimió significativamente el crecimiento del tumor LNCaP en modelo de xenoinjerto de ratón. Los resultados del presente estudio sugieren que la composición del total estandarizada cuasinoides de
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promueve actividades contra el cáncer de próstata en células de cáncer de próstata humano LNCaP
Visto:. Tong KL, KL Chan, Abubakar S, bajo BS, Ma HQ, Wong PF (2015) La
in vitro
y
en Vivo
Actividades anti-cáncer de una composición normalizada cuasinoides de
Libidus
en células LNCaP de cáncer de próstata humano. PLoS ONE 10 (3): e0121752. doi: 10.1371 /journal.pone.0121752
Editor Académico: Keith R. Davis, la Universidad de Indiana, Estados Unidos |
Recibido: 15 de agosto de 2014; Aceptado: February 4, 2015; Publicado: 31 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Tong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue financiado por el Ministerio de Agricultura e Industria Agro-Based, Malasia, Investigación NKEA Grant Scheme (NRGS) -NH0711S001 y Universidad de Malasia /Ministerio de Educación Superior (UM /MoHE) de alto impacto Beca de Investigación (HIRG) E00002-20001. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
quasinoides son un grupo de diterpenoides encuentra en las plantas de la familia de Simaroubaceae que poseen bioactividades tales como anti-tumor [1,2], anti-tuberculosis [3], anti-malaria [4,5], anti-úlcera [6,7], de regulación del crecimiento de insectos [8], anti-VIH [9] y anti-inflamatoria [10,11]. Su actividad anti-cáncer se discutió ampliamente en las críticas anteriores [12,13]. Cuasinoides se informaron como los componentes principales que se encuentran en
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[14].
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pertenece a la familia de plantas Simaroubáceas y es conocido localmente como "Tongkat Ali" o "Pasak Bumi" en Malasia e Indonesia, "Ian-Don" en Tailandia y "Cay Ba Binh" en Vietnam [15] .
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es una hierba popular usada tradicionalmente para mejorar la libido masculina, la potencia sexual y la fertilidad. Debido a su propiedad única de testosterona mejora, los extractos crudos de esta planta es ahora ampliamente comercializados y utilizados para aumentar la virilidad masculina y la disfunción sexual correcta [14,15]. Varios estudios han demostrado que el consumo del extracto aumentó la producción de testosterona y contribuyó a la mejora de la calidad del esperma en los hombres con infertilidad idiopática y el nivel de testosterona de hipogonadismo de inicio tardío [16] y en el modelo animal de la osteoporosis con deficiencia de andrógenos [17]. El aumento de la producción de testosterona por
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se ha atribuido al aumento en el nivel de gonadotropina coriónica humana [18] y la inhibición de la actividad de la fosfodiesterasa y de la aromatasa conversión de testosterona a los estrógenos que posteriormente desencadena eje hipotálamo-hipofisario-gonadal para aumentar los niveles de testosterona [ ,,,0],19,20].
los andrógenos como la testosterona y 5α-dihidrotestosterona (DHT) son importantes para el desarrollo, la maduración y la función de la glándula prostática. Sin embargo, la desregulación de la vía del receptor de andrógenos (AR) se ha implicado en trastornos de la próstata benignas y malignas, tales como la hipertrofia prostática benigna (BPH) y el cáncer de próstata [21,22]. Desde elevación de testosterona se ha asociado con un aumento en el riesgo de carcinogénesis de próstata [23], es mitogénica en las células prostáticas [24-26] y se ha demostrado que es un promotor fuerte tumor en la próstata de roedores [27], se realizó el presente estudio para determinar si
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extracto promueve o inhibe el crecimiento de células de cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Experimento con ratones se realizó de acuerdo con el protocolo aprobado por la Facultad de Medicina de Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Malaya (Ética Número de Referencia: 06/07/2013 /PHAR /WPF). Todo el experimento se realizó en el AAALAC Internacional acreditado Unidad Experimental Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Malasia.
Preparación de una composición cuasinoides estandarizados de
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Un cuasinoides composición normalizada (SQ40) que contiene 40% de las totales en cuasinoides
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se preparó de acuerdo con el método de estudio de baja [28]. En pocas palabras, las raíces en polvo secadas al aire (15 kg) de la
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se extrajeron con 6 x 4 litros de metanol al 95% durante 6 días a 60 ° C. El extracto de metanol combinado después de la evaporación a sequedad a vacío parcial se obtiene un residuo de color marrón oscuro de 450 g (3% w /w), que fue el siguiente cromatografió en una pre-envasados Diaion HP 20 (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japón) columna de resina. La fracción quasinoide ricos elegido, SQ40 se derivó por elución con un gradiente de H
mezclas 2O-MeOH (1: 0 a 0: 1) en la disminución de la polaridad [20], y posteriormente se secó bajo vacío parcial a 45 g ( 10% w /w de extracto crudo). El análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) cuantifica los principales cuasinoides como 32.16% w /w en SQ40, que comprende 14,49 ± 0,26% de eurycomanone, 7,39 ± 0,17% epoxyeurycomanone, 0,72 ± 0,06% 13,21-dihydroeurycomanone y 9,54 ± 0,22% w /w eurycomanol [19]. Estos cuasinoides fueron aislados y purificados de sus estructuras (& gt; 95%) se identificaron y confirmaron siguiendo el protocolo descrito anteriormente [29-31]. La pureza de los compuestos se determinó con Empower 2 Software estación de trabajo (Waters, Milford, MA, EE.UU.) operada en un sistema Waters Delta Prep HPLC equipado con un detector de red de fotodiodos Waters 2996.
Preparación de suero tratado con carbón vegetal (CSS)
carbón-despojado suero (CSS) se preparó como se describe anteriormente para agotar los factores de crecimiento presentes en el suero [32]. Brevemente, se añadió 5 g de carbón vegetal revestido con dextrano (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 500 ml de suero bovino fetal (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se mezcló suavemente durante 1 hora. A continuación, el FBS se centrifugó a 2500 x g durante 10 minutos bajo condiciones de esterilidad. A continuación, se recogió el sobrenadante del suero y se sometió a un segundo ciclo de tratamiento con carbón vegetal revestido con dextrano. Finalmente, el suero se filtró a través de una membrana porosa 0,2 micras (naranja Scientific, Braine-l'Alleud, Bélgica) y se almacenó a -20 ° C para su uso posterior. La esterilidad de CSS se comprobó mediante la incubación de parte de los medios de comunicación en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 durante 14 días.
Cultivo de células
cáncer de próstata humano, LNCaP y PC- 3, las células normales de la próstata humana, RWPE-1 y células de hígado humano normal, las células WRL 68 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EE.UU.). células LNCaP se obtuvieron a partir de los ganglios linfáticos supraclaviculares del paciente cuyo cáncer de próstata se exhiben crecimiento independiente de andrógenos. células LNCaP se andrógeno sensible y expresan el antígeno prostático específico (PSA), fosfatasa ácida prostática y AR [33]. células LNCaP tienen un único punto de mutación de codón 868 (Thr a Ala) en dominio de unión de andrógenos de la AR y responden no sólo a los andrógenos, sino también para antiandrógenos, estrógenos y progestinas [34]. PC-3 células se derivan de la metástasis ósea de un paciente con adenocarcinoma de próstata de grado IV y no responde a los andrógenos, glucocorticoides, o epidérmicas o factores de crecimiento de fibroblastos [35]. células RWPE-1 fueron los adultos no neoplásico células epiteliales prostáticas humanas procedentes de la zona periférica de una próstata humano adulto normal histológicamente y se inmortalizan con el virus del papiloma humano 18 [36]. LNCaP y PC-3 células fueron cultivadas en Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640; Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) suplementado con 10% v /v FBS y 1% de penicilina-estreptomicina v /v (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.), mientras que RWPE -1 células se cultivaron en queratinocitos medio libre de suero (K-SFM; Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) suplementado con 0,5% v /v de penicilina-estreptomicina. WRL 68 células se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) suplementado con 10% v /v FBS y 1% v /v de penicilina-estreptomicina. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en el aire.
viabilidad de las células de ensayo
El efecto de SQ40 sobre la viabilidad de LNCaP, PC- 3, las células RWPE-1 y WRL 68 se determinó por 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazoliumbromide (MTT; Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) de ensayo. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad celular óptima de aproximadamente 1,5 x 10
4 células LNCaP /pocillo; 1.25 x 10
4 PC-3 células /pocillo; 1,5 x 10
4 células RWPE-1 /pocillo; 1.25 x 10 68 células
4 WRL /pocillo. Después de 24 horas, las células se trataron con concentraciones crecientes (2,5 a 100 mg /ml) de SQ40 durante 72 horas. Al final de la incubación, se realizó el ensayo de MTT como se describe anteriormente [37]. La viabilidad celular se calcula como porcentaje de la viabilidad celular en comparación con células de control del vehículo, asignados como 100% de viabilidad. Por último, la concentración inhibitoria media máxima (IC
50) se determinó usando la versión de software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).
dihidrotestosterona (DHT) de tratamiento
células LNCaP tratadas con 5α-androstan-17β-ol-3-ona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO DHT). Antes del tratamiento, las células LNCaP fueron cultivadas en RPMI suplementado con 5% CSS durante 48 horas para evitar la interferencia de los andrógenos y otros factores de crecimiento presentes en completa FBS. Aproximadamente 1,5 x 10
4 células LNCaP /pocillo fueron sembradas en placa de 96 pocillos y se trataron con concentraciones crecientes (20 a 140 nM) de DHT con o sin 3, 6 y 12 mg /ml de SQ40 durante 72 horas. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT.
Soft agar ensayo de formación de colonias
células LNCaP fueron pre-tratadas con SQ40 en su IC
50 valor durante 72 horas. Antes de la siembra en agar suave, suspensión de células individuales se obtuvo haciendo pasar las células a través de una aguja fina. Cinco mil SQ40-células tratadas y controlados con vehículo se mezclaron con medio de crecimiento que contiene 0,3% de agar y se sembró en la parte superior de una capa base que contiene agar al 0,5% en medio de crecimiento en 60 mm placas de Petri. Los cultivos se incubaron a 37 ° C en atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en aire durante otras 3 semanas. Los medios de comunicación se reponía cada 3 días con medio de cultivo fresco. En el punto final del experimento, únicas colonias más grandes de 0,5 mm fueron contados bajo el microscopio.
Análisis en tiempo real la proliferación celular
La cinética de crecimiento de las células LNCaP y RWPE-1 fueron examinados en tiempo real por el sistema en tiempo real de análisis de la (RTCA) (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) como se describe anteriormente [37]. La impedancia aumentará cuando las células adherentes se unen y se extendió a través de la superficie del sensor de un electrodo y disminuye cuando las células completan y separar. Brevemente, se añadieron 50 l de medio de cultivo completo a cada pocillo de la placa de E-16 y la lectura de fondo se registró. Una suspensión de células de 50 l en densidad celular de 3,0 x 10
4 células /pocillo se añadió entonces a cada pocillo de E-placa 16. Los cambios en la impedancia debido a la unión celular, la proliferación y la difusión se monitorizaron durante la noche. Cuando las células entraron en la fase de crecimiento logarítmico, las células se trataron con 2,5 a 80 mg /ml de SQ40. Las células tratadas con medio de crecimiento completo se hace referencia como control de vehículo, mientras que 5 micras células tratados con paclitaxel fueron referidos como control positivo. Las células fueron controlados a continuación durante otras 72 horas. Los valores de impedancia se expresaron como el Índice de Células (CI). Las curvas de crecimiento se normalizaron a la CI del último punto de tiempo medido antes de la adición de las drogas o el control del vehículo.
El azul tripán la exclusión de pruebas
p>
Análisis del ciclo celular
p>
Análisis de inmunotransferencia
La expresión de la proteína G
1 /S reguladores como la quinasa dependiente de ciclina (CDK), CDK4, CDK2, ciclina D1, ciclina D3, p21
Waf1 /Cip1 y p27
Kip1 y escindido con poli (ADP -ribose) polimerasa (PARP) se analizaron por inmunotransferencia. Se prepararon lisados celulares utilizando el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) sistema de tampón de lisis en presencia de una solución de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1%, solución de ortovanadato de sodio 1% y solución de cóctel inhibidor de proteasa 1%. La concentración de proteína de los lisados de células se determinaron por Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Walthan, MA). La misma cantidad de proteínas se sometieron a 12% docecyl sodio electroforesis en gel de sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) y luego se transfiere a membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (tamaño de poro 0,45 micras; Milipore, Bedford, MA). Las membranas fueron sondadas con anticuerpos primarios contra CDK4, CDK2, ciclina D1, ciclina D3, p21
Waf1 /Cip1, p27
Kip1 y escindido con PARP (Asp214) (D64E10) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA ). Este paso fue seguido de la incubación con los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rábano picante. Después de las etapas de lavado, las bandas de proteína se visualizaron colorimétricamente usando 3,3,5,5 tetramethylbenzine (TMB; Sigma Aldrich, Louis, MO) solución y cuantificaron utilizando un sistema de documentación de gel (BioRad, Richmond, California)
receptor de andrógenos (AR) y el antígeno prostático específico (PSA) ELISA
en pocas palabras células LNCaP fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 5% de CSS durante 48 horas. Las células se trataron a continuación con 3, 6 y 12 mg /ml de SQ40 con o sin 100 nM de DHT durante otras 72 horas. DHT se añadió para estimular la translocación AR. La fracción nuclear se obtuvo a partir del lisado celular utilizando el kit de extracción nuclear (Cayman Chemical, MI, EE.UU.) y el nivel de AR nuclear se midió utilizando receptores nucleares Sandwich AR ELISA (Active Motif, Carlsbad, EE.UU.). nivel de AR se normalizó al nivel total de proteínas nucleares. En el mismo experimento, se recogió el medio de crecimiento del control de vehículo y las células tratadas y el nivel de PSA secretado se cuantificó mediante ELISA de antígeno prostático específico Kit humano (Abcam, MA, EE.UU.). Los valores de PSA se normalizaron frente al número total de células.
En vivo
LNCaP estudio de xenoinjerto
ratones inmunodeficientes Hombre NCR 5 semanas de edad, 20-25 gramos se adquirieron de InVivos Pte. Ltd. (Singapur) y alojados en jaulas ventiladas individualmente bajo condiciones específicas libres de patógenos y se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a 24 ° C. Los animales se les proporcionó comida estéril y agua ad libitium. Los ratones se anestesiaron antes de la inyección de células LNCaP (2 x 10
6) con 50% de Matrigel (0,1 ml; Becton Dickinson, Jersey, EE.UU.) en el flanco derecho de la vía subcutánea ratón desnudo. El tratamiento se inició cuando los tumores eran palpables. los ratones portadores del tumor se asignaron aleatoriamente a 4 grupos. Cada grupo constaba de 6 animales. Estos grupos de ratones se les dio inyecciones intraperitoneales de solución de vehículo (solución salina), 5 mg /kg de paclitaxel (control positivo), 5 y 10 mg /kg tres veces a la semana SQ40 durante 6 semanas. El tamaño del tumor fue palpado y la longitud y anchura se midió con un calibrador. El volumen del tumor se calculó usando la fórmula, 0,5 x longitud x anchura
2. El volumen y peso del tumor de cada ratón se midió una vez a la semana durante un período de 6 semanas. Los ratones se sacrificaron una vez que los nódulos tumorales alcanzaron 1,5 cm de diámetro.
El análisis estadístico
Todos los ensayos se realizaron en al menos tres experimentos separados. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni utilizando el software GraphPad Prism (versión 5.0). La significación estadística se expresa como *,
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01; ***,
p Hotel & lt; 0,001 frente al control del vehículo y
#,
p Hotel & lt; 0,05;
##
p Hotel & lt; 0,01;
###,
p
. & Lt; 0,001 frente a 100 células estimuladas DHT nM
Resultados
SQ40 es citotóxica selectiva a las células de cáncer de próstata LNCaP y DHT inhibido estimulada por el crecimiento de las células LNCaP
in vitro
actividad de citotoxicidad de SQ40 fue examinado en la próstata humana normal, las células RWPE-1, el hígado humano normal, las células WRL 68, cáncer de próstata humano, PC- 3 y LNCaP células. Las concentraciones que causaron la mitad efecto inhibidor máxima (IC
50) en 68 células RWPE-1 y WRL fueron 59,26 ug /mL y 27,69 mg /ml, respectivamente (Fig. 1, negro y línea azul). SQ40 inhibió el crecimiento celular LNCaP en IC
50 de 5,97 g /ml en una manera dependiente de la dosis (Fig. 1, línea roja). El IC valores
50 de la composición quasinoides en RWPE-1 y las células WRL-68 fueron más altos en comparación con la de las células LNCaP, lo que sugiere que SQ40 fue más selectivo para las células cancerosas LNCaP que las células normales. Por otro lado, SQ40 inhibe 50% del crecimiento celular en las células PC-3 a una concentración más alta que (87,94 mg /ml; Fig. 1, línea verde) la de las células LNCaP que sugieren que la fracción quasinoide ricos afectó a las células LNCaP, pero no.
RWPE-1 células normales de la próstata (negro), WRL 68 células normales del hígado (azul), se trataron las células de cáncer de próstata PC-3 LNCaP (rojo) y PC-3 células de cáncer de próstata (verde) con concentraciones crecientes (2,5 a 100 mg /ml) de SQ40 durante 72 horas y la viabilidad celular se midió usando ensayo de reducción de MTT. Los datos se expresan como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. IC
50 valores de SQ40 sobre RWPE-1, WRL 68, LNCaP y células en el tratamiento de 72 horas fueron de 3 PC-59.26 g /ml, 27,69 mg /ml, 5,97 mg /ml y 87.94 g /ml, respectivamente.
El efecto citotóxico de SQ40 se evaluó adicionalmente en células de cáncer de próstata LNCaP estimulado por andrógenos. células LNCaP se les permitió primero a crecer en medio de crecimiento que suplementado con 5% de CSS y se añadió DHT para estimular la proliferación celular. En presencia de concentraciones crecientes de DHT, se estimularon las células LNCaP a crecer de forma exponencial. Co-tratamiento con 3, 6 y 12 mg /ml SQ40 inhibió el crecimiento celular LNCaP en más de un 50% en comparación con las células estimuladas con DHT solo (Fig. 2).
células LNCaP se trataron con concentraciones crecientes de DHT con o sin 3, 6 y 12 mg /ml de SQ40 durante 72 horas en RPMI 1640 suplementado con 5% de CSS y la viabilidad celular se midió usando el ensayo de reducción de MTT. Porcentaje de células viables se calculó con relación a las células de control del vehículo sin tratamiento DHT. Los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos independientes.
SQ40 suprimió el crecimiento independiente de anclaje de células LNCaP
El efecto de SQ40 en células LNCaP de crecimiento independiente de anclaje se investigó el uso ensayo de agar blando. Las células LNCaP fueron pre-tratadas con SQ40 en su IC
50 valor durante 3 días antes de la siembra en el medio de agar blando en un número de células de igualdad con las células de control del vehículo. El tamaño de los quasinoides colonias de células tratadas con la composición se redujo notablemente en comparación con las colonias de células de control del vehículo (Fig. 3A y 3B). Además, la eficiencia de formación de colonias de células LNCaP tratadas con SQ40 se redujo significativamente en comparación con el control del vehículo (Fig 3C;.
p
& lt; 0,05). Este hallazgo sugiere que SQ40 inhibió el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de próstata LNCaP.
células LNCaP fueron pre-tratadas con SQ40 o control del vehículo durante 72 horas y luego se sembraron en los medios de agar blando por otras 3 semanas. se muestran colonias representativos de (A) control del vehículo y las células LNCaP tratadas con SQ40 (B). (C) Las representaciones gráficas de agar blando eficiencia de formación de colonias. Los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos independientes para las células de control de vehículos y seis experimentos independientes para las células tratadas con SQ40. * Indica
p
. & Lt; 0,05 frente a control del vehículo
SQ40 inhibe el crecimiento de células LNCaP a baja concentración, pero la muerte celular inducida en una concentración elevada
Cinética de crecimiento de LNCaP y se monitorizaron las células RWPE-1 en tiempo real utilizando un sistema de medición de detección de células basados en impedancia. Se observó que los valores de CI normalizados para las células LNCaP tratadas con SQ40 mostraron una disminución constante después de 6 horas de tratamiento con la composición quasinoides. Después de 72 horas de tratamiento, se observó que las células LNCaP tratadas con concentraciones más bajas (2,5 a 10 g /ml) de SQ40 solamente obtuvieron casi la mitad de los valores de CI normalizadas de las células de control de vehículo y esto sugiere que SQ40 a bajas concentraciones ejerce citostático efecto sobre las células LNCaP. Sin embargo, SQ40 a concentraciones más altas (20 a 80 mg /ml) dio como resultado valores de CI normalizados muy bajos similares a la del control positivo, 5 mM células tratados con paclitaxel (Fig. 4A).
La cinética de crecimiento de (A) LNCaP y (B) RWPE-1 en las células se examinaron en tiempo real utilizando RTCA. Los valores de impedancia se registraron en tiempo real y se expresaron como el Índice de Células (CI). Las células tratadas con medio de crecimiento solo fueron referidos como control de vehículo, mientras que 5 micras células tratados con paclitaxel fueron referidos como control positivo. células LNCaP tratadas con SQ40 (C) se tiñeron con soluciones de azul de tripano al 0,4% en una proporción de 1: 1 después de 72 y 96 horas de tratamiento, respectivamente. Las células tratadas con medio de crecimiento solo fueron referidos como control de vehículo, mientras que 1 micra células tratados con paclitaxel fueron referidos como control positivo. Los datos se expresaron como medias ± SEM de tres experimentos independientes. ** Indica
p
& lt; 0,01 frente a 72 horas tratada control del vehículo.
## indica
p Hotel & lt; 0,01;
###,
p
. & Lt; 0,001 frente al control tratado con vehículo de 96 horas
En contraste, las células normales de la próstata RWPE-1 tratados con & lt; 20 mg /ml de SQ40 mostró valores de CI normalizados que eran similares a los de las células de control del vehículo que sugieren que SQ40 a estas dosis no indujo efecto citotóxico sobre las células normales de la próstata. Sin embargo, no se observó citotoxicidad en células RWPE-1 a concentraciones muy altas de la composición quasinoides (40 y 80 mg /ml; Fig. 4B). En todos los estudios posteriores, 3, 6, y 12 mg /ml de SQ40 fueron utilizados para tratar las células LNCaP. Para demostrar que los efectos moleculares posteriores de SQ40 a estas dosis no fueron aportados por el alto porcentaje de células muertas, se realizó la tinción con azul de tripano exclusión para determinar el porcentaje de células viables en los cultivos. Después de 72 horas de tratamiento, el porcentaje de células muertas eran ~ células LNCaP tratadas con SQ40 /mL 20% y 35% en 12 y 20 mg en comparación con el control no tratado. Una duración de tratamiento prolongado de 96 horas aumentó el porcentaje de células muertas a ~ 30% y ~ 60% en 12 y 20 mg de células LNCaP tratadas con SQ40 /ml, respectivamente (Fig 4C;.
p
& lt; 0,001 ).
SQ40 inducida G
0 /G
1 fase de la detención en las células LNCaP
se realizó
análisis del ciclo celular para investigar el efecto inhibidor de SQ40 en la progresión del ciclo celular de las células LNCaP Células. células LNCaP a 70-80% de confluencia se trataron con 3, 6 y 12 mg /ml de la composición quasinoides durante 24, 48 y 72 horas. Como se muestra en la Fig. 5, SQ40 detenidos de manera significativa las células LNCaP en G
0 /G
1 fase de una manera dosis-y tiempo-dependiente. A 24 horas de tratamiento, las células LNCaP mostraron mayor G
0 población de células en fase /G1 al 80,22% (
p Hotel & lt; 0,01) en 3 mg /ml cuasinoides células tratadas con la composición y el 85,45% (
p
& lt; 0,001) en 6 mg /ml quasinoides células tratadas con la composición en comparación con las células de control del vehículo (65,22%; Fig. 5A). La población de células de 6 mg /ml cuasinoides células LNCaP tratadas con la composición de G
0 /G
1 fase aumentó de manera significativa al 96,15% (
p Hotel & lt; 0,001) y 93,67% (
p
. & lt; 0,001) después del tratamiento de 48 y 72 horas, respectivamente (Fig 5A). El aumento en el porcentaje de población de células en G
0 /G
1 fase fue acompañado por una disminución en el porcentaje de población de células en fase S (3,11%;
p
& lt; 0,01) y G
2 /M fase (3,21%) en las células LNCaP después del tratamiento de 72 horas (Fig. 5D). Estos cambios significativos sugieren que SQ40 inhibió el crecimiento de células LNCaP por la detención de las células en G
0 /G
1 fase.
células LNCaP se trataron con medio de crecimiento (control vehículo), 3, 6 y 12 mg /ml de SQ40. la distribución de células en (A) T
0 /G
1, (B) S y (C) G
2 /M fase a las 24, 48 y 72 horas de tratamiento fueron analizados por el flujo FACSCanto II y citometría evaluados utilizando software de análisis de ciclo celular ModFit. Los datos se expresaron como medias ± SEM de tres experimentos independientes. * Indica
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01; ***,
p Hotel & lt; 0,001 frente al control del vehículo. (D) Expresión de proteínas de PARP escindida en las células LNCaP por tratamiento SQ40 durante 72 y 96 horas. β-actina sirvió como control de carga.
Por otro lado, las células LNCaP tratadas con 12 mg /ml de SQ40 mostraron un aumento significativo en G
2 /M fase después de 72 horas de tratamiento. El G
población de células 2 /M fase en las células LNCaP 12 g /tratados con SQ40 ml era 9,58%, 8,94% y 10,23% (
p
& lt; 0,01) después de 24, 48, y tratamientos de 72 horas, respectivamente, mientras que los de las células de control de vehículos eran 10,55%, 7,95% y 4,58% después de 24, 48, y el tratamiento de 72 horas, respectivamente (Fig. 5C). Además, escindido con PARP, se detectó un marcador de apoptosis cuando la duración del tratamiento con 12 mg /ml de SQ40 se extendió a 96 horas. Por otra parte, escindido con PARP también se detectó significativamente a las 72 horas cuando la concentración de SQ40 se aumentó a 20 mg /ml (Fig. 5D). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que SQ40 induce muerte celular después de G
2 /M detención.
SQ40 inhibió el crecimiento de células LNCaP por proteínas CDK4, CDK2 y ciclina D1-regulación hacia abajo y hasta la regulación de p21
WAF1 /Kip1 expresión de la proteína nivel
el análisis por inmunotransferencia se realizó para investigar los efectos de SQ40 sobre el ciclo celular expresión de la proteína reguladora. El nivel de expresión de G
1 /S proteína reguladora incluyendo CDK4, CDK2, ciclina D1 y ciclina D3 fueron reguladas en las células LNCaP cuando son estimuladas a proliferar con DHT, un metabolito de la testosterona (Fig. 6). La presencia de SQ40 en 100 células LNCaP DHT estimulada nM reducido regulado los niveles de expresión de proteínas de CDK4, CDK2, ciclina D1 y ciclina D3 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 6). Además, SQ40 aumentó el nivel de expresión de la proteína de ciclo celular p21 inhibidor
Waf1 /Kip1 en presencia de 100 nM de DHT, sin embargo, la composición de quasinoides no afectó el nivel de expresión de p27
Kip1 después de 72 horas de tratamiento en las células LNCaP. Estos resultados apoyan además la citometría de flujo hallazgos que SQ40 detenido células en G
0 /G
1 fase.
células LNCaP fueron primero cultivaron en medio de crecimiento suplementado con 5% CSS durante 48 horas y luego se trató con 3, 6 y 12 mg /ml de SQ40 con la presencia de 100 nM de DHT durante 72 horas. La inmunotransferencia se realizó en extractos de proteínas para detectar CDK4, CDK2, ciclina D1, ciclina D3, p21
Waf1 /Cip1 y p27
Kip1. β-actina sirvió como control de carga.
SQ40 suprimió el nivel de proteína de AR y la disminución de la producción de PSA en células LNCaP
El efecto de SQ40 sobre la proteína de AR LNCaP se investigó siguiente. AR extracto nuclear en 100 nM de DHT células estimuladas con LNCaP se incrementaron en un 25% en comparación con las células no estimuladas (Fig. 7A). tratamiento SQ40 a las 3 y 6 mg /ml solo disminuyó el nivel AR nuclear basal en un 25%, así, en comparación con las células no estimuladas (Fig 7A;.
p
& gt; 0,05). Por lo tanto, el tratamiento de combinación de DHT y la composición quasinoides a las 3 y 6 mg /ml no afectaron significativamente el nivel AR nuclear en comparación con las células no estimuladas (Fig 7A;.
p
& gt; 0,05).