humano
Extracto
La identificación de nuevas proteínas que potencialmente pueden contribuir a la carcinogénesis es una empresa necesaria. Aquí, se presenta la primera caracterización bioquímica de la novela de la caja F y WD40 que contiene proteínas, FBXW4. Hemos identificado que interactúan proteínas asociados y demostrado que FBXW4 es parte de un complejo de ubiquitina ligasa. Además, el locus Fbxw4 es un sitio común de inserción proviral en una variedad de modelos de cáncer murino mutagénesis de inserción retrovirales y Fbxw4 mRNA es altamente expresado en la involución de la glándula mamaria murina. Para comenzar a caracterizar la función bioquímica de Fbxw4, se utilizó el análisis proteómico para demostrar que interactúa con Fbxw4 Skp1 (SKP1), Cullin1 (CUL1), Anillo-box1 (RBX1) y todos los componentes de la COP9 signalosome. Todas estas interacciones dependen de un dominio de la caja F intacta de Fbxw4. Además, Fbxw4 es capaz de interactuar con las proteínas ubiquitinadas dentro de las células en una forma dependiente de la F-box. Finalmente, se demuestra que FBXW4 está mutado, perdió y bajo-expresado en una variedad de líneas celulares de cáncer humano y muestras de pacientes clínicos. Es importante destacar que, la expresión de FBXW4 se correlaciona con la supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas. Tomados en conjunto, sugerimos que FBXW4 puede ser una novela supresor de tumores que regula importantes procesos celulares
Visto:. Lockwood WW, Chandel SK, Stewart GL, Erdjument-Bromage H, Beverly LJ (2013) La novela La ubiquitina ligasa compleja, SCF
Fbxw4, interactúa con la COP9 signalosome en una forma dependiente de la F-Box, está mutado, perdido y Sub-Expresado en los cánceres humanos. PLoS ONE 8 (5): e63610. doi: 10.1371 /journal.pone.0063610
Editor: Deanna M. Koepp, Universidad de Minnesota, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Febrero, 2013; Aceptado: 5 Abril 2013; Publicado: May 2, 2013
Derechos de Autor © 2013 Lockwood et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH), Molecular Targets COBRE, 8P20GM103482-10 (a LJB), Wendy Fondo Will caso de cáncer, GB220413 (a LJB), premio del Programa de Investigación del cáncer Pediátrico Kosair (a LJB). Este trabajo también fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer Cancer Center de subsidio de apoyo P30 CA08748 a Microquímica y Core Laboratorio de Proteómica (HEB), Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Este trabajo también fue apoyado, en parte, por el NIH subvención CA94060 P01 y PO1 CA129243-01 (a Harold Varmus) y por el NIH intramural del NCI y los fondos (NHGRI a Harold Varmus). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción ligase complejos
ubiquitina catalizan la conjugación de ubiquitina a las proteínas sustrato [1]. La ubiquitinación de proteínas puede tener una variedad de efectos en la función de las proteínas con el mejor estudiado bien ser la regulación de la estabilidad de la proteína [2]. complejos de ubiquitina ligasa (también llamados E3 ubiquitina ligasas) interactuar con un E1 (ubiquitina enzima de activación), y un E2 (enzima de conjugación a ubiquitina) [1]. Las enzimas E1 y E2 son generalmente compartidos entre muchos ligasas E3 y el componente de E3 es el factor de especificidad que interactúa directamente con proteínas sustrato. Un tipo de E3 complejo ubiquitina ligasa, el complejo de ligasa SCF ubiquitina, contiene Skp1, Cullin1, anillo-box1 y uno cualquiera de los más de setenta F-caja que contiene las proteínas codificadas en los genomas de eucariotas superiores [3], [4]. El dominio F-box es responsable de interactuar directamente con Skp1, mientras que los otros dominios contenidos dentro de la proteína son responsables de la interacción con y llevar proteínas sustrato en la proximidad de la ubiquitina ligasa [5]. Es importante destacar que las proteínas que contienen múltiples F-box están bien caracterizados para jugar un papel directo en la génesis de los cánceres humanos [6], [7], [8], [9], [10]. Por ejemplo, las mutaciones que conducen a una pérdida de la función de FBXW7 o BTRCP conducen a la estabilización de sus proteínas sustrato afines, Notch, MYC y ciclina o beta catenina, respectivamente, todos los cuales son oncogenes conocidos [6], [9] , [11], [12], [13], [14], [15].
El signalosome COP9 es un complejo de tamaño mega-dalton que consiste en al menos ocho proteínas identificadas inicialmente mediante una pantalla genética en Arabidopsis [16], [17]. El complejo COP9 es conocido para regular una variedad de complejos de ubiquitina ligasa. El mecanismo exacto por el cual COP9 regula la función de los complejos de ubiquitina ligasa no se conoce completamente, pero se ha sugerido para regular la interacción entre las proteínas F-box y Skp1 mediante la regulación de la conjugación de la pequeña NEDD8 proteína para Cullin1 [18], [19 ]. El ciclo de neddylation /de-neddylation facilita la interacción sustrato-ligasa de ubiquitina y la posterior rotación del sustrato. Por lo tanto, la actividad de muchos de estos complejos ligasa de ubiquitina se ha demostrado que requieren la interacción con el signalosome COP9 para la función apropiada. Curiosamente, se sabe que múltiples componentes de la signalosome COP9 tener funciones COP9-independiente y se han demostrado para contribuir al cáncer [20], [21], [22].
El locus FBXW4 fue mapeado originalmente como el región en el cromosoma humano 10, que era el locus causal en el trastorno de las extremidades malformaciones mano dividida y el pie 3 (SHFM3) [23], [24], [25], [26]. SHFM3 es un defecto en el desarrollo de la cresta ectodérmica apical durante la formación de las extremidades que causa la aplasia de los dedos centrales que conducen a, en los casos más graves, sólo dos dígitos por las extremidades [27], [28]. Posteriormente, también se encontró que Fbxw4 fue también el locus responsable de un defecto en el desarrollo del ratón espontánea que se asemejaba a SHFM3 en los seres humanos [29]. Una serie de publicaciones que afirman que la alteración de FBXW4 es responsable de los defectos, seguido de publicaciones que sugieren que el locus que codifica aguas arriba Fgf8 puede ser el culpable [30], [31]. Hasta la fecha, no hay datos satisfactoria sin nubes el tema.
Independientemente de si FBXW4 contribuye causalmente con SHFM3, hasta la fecha ninguna función molecular o bioquímica se ha atribuido a FBXW4. Mediante la combinación de la minería de datos, estudios de expresión, la proteómica y la bioquímica hemos comenzado a ampliar nuestro conocimiento de FBXW4. Demostramos que Fbxw4 es parte de un complejo que contiene ubiquitina ligasa Skp1, Cullin1, Rbx1 y la signalosome COP9. Montaje de este complejo es dependiente del dominio F-caja de Fbxw4. Es importante destacar que, se muestra que FBXW4 locus es comúnmente elimina, bajo-expresó y somáticamente mutado en los cánceres humanos. Por otra parte la disminución de la expresión FBXW4 se correlaciona con una pobre supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas. Tomados en conjunto, que postula que FBXW4 puede ser un supresor de tumores poco apreciado en tumores malignos humanos, en virtud de su capacidad para regular la función de las vías de señalización críticos.
Materiales y Métodos
RT-PCR análisis de Fbxw4 expresión
QRT-PCR se realizó en el "ratón tejido normal panel de qPCR I 'del gato Origene.#MNRT101 (Rockville, MD, EE.UU.), utilizando SYBR Green de Applied Biosystmes (Foster City, CA, EE.UU.) con los oligos GAPDH proporcionadas y '3 mus Fbxw4 rt' 5 'GTCCTCATCATGCCCAGAGAAGAC-3' con '5' mus Fbxw4 atg 5 '-ATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATGC-3' o '5 mus Fbxw4 rt' 5 'GTCCTGTG GTTATGACACCTATG-3' y '3 mus Fbxw4 ninguna parada' 5 'TGGGTTCTGA AAGTCTAAGACGTG-3'.
construcciones de plásmidos
Fbxw4 y Fbxo46 construcciones fueron adquiridos de Origene (Rockville, MD, EE.UU.) y se utilizaron como plantillas de PCR. (. Fbxw4 gato#MMM1013-7512491; Fbxo46 gato#MMM98477851.). Fbxo46 se amplificó con los siguientes oligonucleótidos utilizando ADN polimerasa Vent (NEBL, Ipswich, MA, EE.UU.): mus Fbxo46 ATG RI, 5'-GCGCGAATTCACCATGGACAGGGGCAGCCTCCTGCCC-3 '; mus Fbxo46 sin parar SalI, 5'-GCGCGTCGACCCTCCCCTCTTCCCGGCCAGC-3 '. PCR fragmentos amplificados fueron clonados en TOPO kit de clonación romo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). a continuación, los de larga duración Fbxo46 se digirió con EcoRI y SalI y se clonó en el vector pBABE-FLAG, se digirió con EcoRI y XhoI, que contiene una etiqueta de epítopo 3 'BANDERA aguas abajo y en marco en el sitio XhoI, el epítopo FLAG es seguido por los codones de parada y un sitio SalI. Fbxo46 con una etiqueta FLAG 3 'en marco se digiere a continuación de pBABE con EcoRI y SalI y se clonó en el sitio EcoRI y XhoI de la MIGRX vector retroviral.
Fbxw4 se amplificó a partir del clon Origene con ADN Vent la polimerasa con los siguientes oligos: mus Fbxw4 atg RI, 5'-GCGCGAATTCACCATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATG-3 '; bandera mus Fbxw4 detener XhoI, 5'-GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG-3 '. PCR fragmentos amplificados fueron clonados en TOPO romo. Longitud total Fbxw4 que contiene una etiqueta en marco 3 'FLAG se recupera luego por digestión con EcoRI y XhoI. Este fragmento se clonó en los sitios EcoRI y XhoI del MIGRX
Fbxw4
-fbox se amplificó a partir de la longitud completa del clon Fbxw4 TOPO usando los siguientes oligos:. Fbxw4 bandera detener XhoI, 5'-GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG -3 ', mus Fbxw4 -fbox EcoRI, 5-GCGCGAATTCACCATGGCCCGGGCCTCGCTCAACACC-3'. El fragmento amplificado por PCR fue clonado en los sitios EcoRI y XhoI del MIGRX.
pRK5-HA-ubiquitina Addgene#17608 depositada por Ted Dawson [32].
Cultivo de células
293 células T fueron adquiridos de ATCC (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de SFB. transfecciones de ADN en células 293 T se realizaron utilizando PEI, en una proporción de 2,5 microgramos de PEI /microgramo de ADN. Todos los extractos de células se prepararon después de la cosecha roce de 293 células T usando tampón CHAPS de lisis (1% de detergente CHAPS, NaCl 150 mM, 50 mM Tris pH 7, EDTA 5 mM). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el reactivo de ensayo de proteína BCA de Thermo Scientific (Rockford, IL, EE.UU.) cat#23225. 30 g de proteína total fue utilizado para el procedimiento de transferencia Western estándar. detección quimioluminiscente se realizó utilizando SuperSignal WestFemto de Thermo Scientific (Rockford, IL, EE.UU.) según el protocolo del fabricante.
inmunoprecipitaciones
200 ug de proteína se incubó en 400 ul de tampón CHAPS totales y se incubó con 15 ul de matriz de afinidad indicado durante una hora a 4 grados Celsius. Después de la incubación, la matriz se lavó tres veces en tampón CHAPS y luego se añadió tampón de carga SDS directamente a la matriz lavada, hervido, y se carga directamente en los pocillos de un gel de PAGE. Se realizaron tratamientos con fármacos como se describe en el texto con 25 uM MG132.
Los anticuerpos
tubulina#B512, FLAG M2 perlas de agarosa conjugada, FLAG poli-clonal#F7425 (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.); matriz de afinidad de HA y HA#3F10 (Roche, Indianapolis, IN); La ubiquitina#3933 (Tecnologías de Señalización Celular, Beverly, MA, EE.UU.); SKP1 gato.#Ab10546 y el gato COPS2 /TRIP15.#Ab4537 (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.); COPS5 cat /Jab1.#Sc-9074 (biotecnología Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE.UU.).
inmunoprecipitación e identificación de proteínas por cromatografía líquida nano-pareja para Tandem espectrometría de masas (LC-MS /M)
10-150 placas mm de 293 t células fueron transfectadas transitoriamente utilizando Fugene6, según el protocolo del fabricante (Roche, Indianapolis, IN). 48 horas después de la transfección las células se recogieron por raspado en el frío. CHAPS lisados se prepararon y se cuantificaron como se describe anteriormente. 50 mg de lisado total de se incubaron con perlas de agarosa FLAG conjugado (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) durante la noche a 4 grados con suave balanceo. perlas de agarosa se añadieron a una columna y se lavaron con 10 veces el volumen de la columna por flujo de gravedad. Columna se tapó y 1 volumen de lecho de perlas de péptido FLAG (disuelto en PBS a una concentración de 5 mg /ml y después se diluyó 1:10 en tampón CHAPS) se añadió a la columna y se incubó durante 30 minutos a 4 grados. Se retiró la tapa y ~ 100 ul fracciones se recogieron como la elución fluía a través de la gravedad. 50% de cada fracción (~ 5 fracciones) fue transferencia Western con anticuerpo anti-FLAG. Típicamente, la primera fracción estaba desprovista de la proteína diana y, o bien la fracción de 2 o 3 tenían el grueso de la proteína diana. ~ 40% de la fracción que contiene la mayoría de la proteína purificada FLAG-tag se resolvió parcialmente mediante SDS-poliacrilamida electroforesis en gel; las mezclas se concentran en una sola de 3 mm de ancho "pila", por electroforesis a través de un SDS 'gel de apilamiento' hasta entrar en el "gel de separación ', seguido por una breve tinción con azul de Coomassie y la escisión de la banda de proteína apilados. Preparación de la muestra y la espectrometría de masas se realizó exactamente como se describe anteriormente [33].
Andamios (Proteoma Software Inc., Portland, OR), versión 3_6_1 se utilizó para validar aún más y cruzada tabular los basados en MS-MS /péptidos y proteínas identificaciones. Las proteínas y péptidos probabilidad se fijó en 95% con un requisito mínimo de un péptido.
Resultados
Fbxw4 es un sitio común de inserción proviral y se expresa de forma variable en los tejidos murinos normales
La identificación y caracterización de nuevos genes y productos genéticos ha dado lugar a una enorme cantidad de datos y conjuntos de datos disponibles públicamente. Nos preguntamos si la minería de estos conjuntos de datos disponibles podría producir observaciones hipótesis de generación rodean genes potencialmente interesantes. Una de estas bases de datos es la "base de datos de genes de cáncer de etiquetado retroviral ', que es un repositorio de proviral puntos de inserción de clones de diversos investigadores en busca de nuevos genes que pueden contribuir a la leucemia (y más recientemente estudios de mutagénesis de transposón mediada en hematopoyéticas y tumores sólidos). Los sitios comunes de integración proviral son loci que proporcionan una ventaja selectiva a las células por disregulating la expresión de genes celulares. Como apoyo, la mayoría de los sitios más comunes de inserción proviral son bona fide oncogenes o supresores tumorales. Nos preguntó esta base de datos y se encontró que el locus del gen Fbxw4 fue el único locus en el loci de inserción 30 más comúnmente identificada que no se ha sugerido que desempeñar un papel en el cáncer o ha caracterizado bioquímicamente. Ha habido, hasta la fecha, 13 sitios de inserción clonaron a partir de dentro del gen Fbxw4 codificada y las inserciones se han clonado tanto en avance y retroceso de orientación (Figura 1A). Estos datos pueden sugerir que la inserción proviral en el locus puede conducir a la pérdida de la función Fbxw4.
A. El examen de la UCSC genoma navegador (genome.ucsc.edu) y la base de datos retroviral Tagged Cancer Gene (http://variation.osu.edu/rtcgd/index.html) muestra que múltiples inserciones retrovirales han sido clonados desde dentro de la Fbxw4 transcrito lugar. Las flechas indican la direccionalidad de los provirus insertados. Los exones se indican en la parte inferior y la posición y la escala del cromosoma 19 murino se muestra en la parte superior. Nombres dados a las inserciones proviral clonados se indican a la izquierda. Los sitios de inserción que comienzan con 'mmt' fueron clonados a partir de virus de tumor mamario de ratón carcinomas mamarios inducidos. Los sitios de inserción que comienzan con 'Dkm', '248' y 'B5' fueron clonados a partir de leucemias virus de la leucemia murina cánceres hematopoyéticos acelerados. B. FBXW4 se expresa de forma variable en los tejidos murinos normales. Se utilizaron los oligonucleótidos específicos para murino Fbxw4 para llevar a cabo RT-PCR cuantitativa en el 'ratón normal cDNA array TissueScan'. Los valores se normalizaron a RT-PCR cuantitativa para GAPDH. C. Representación esquemática de la proteína Fbxw4. Los números representan los aminoácidos de la proteína. Dominios contenidos en Fbxw4 se indican.
El hecho de que Fbxw4 nunca se ha caracterizado nos llevó a examinar la expresión de este locus con más detalle. En primer lugar determinamos lo que el patrón de expresión de ARNm Fbxw4 está al otro lado tejidos murinos normales. Usando cDNA preparado a partir de diversos tejidos de ratón se observó un nivel sorprendente de expresión específicamente en la glándula mamaria involutiva (Figura 1B). Esto sugiere la posibilidad de que la expresión Fbxw4 se incrementa y puede contribuir durante un proceso de apoptosis.
Fbxw4 interactúa con los componentes de la ubiquitina ligasa E3 y la COP9 signalosome
Un algoritmo de proteínas motivo muestra que el Fbxw4 proteína contiene un dominio de F-box, un motivo que por lo general está implicado en la interacción con un complejo de ubiquitina ligasa E3 y cinco WD-40 motivos, que son saber módulos de interacción proteína-proteína (Figura 1C). A pesar del trabajo realizado genética en el locus Fbxw4, no ha habido estudios que examinan la función bioquímica de Fbxw4. Como primer intento de entender la posible función de Fbxw4 inmunoprecipitación se realizó en Fbxw4 bandera de etiquetado seguido de espectrometría de masas para identificar, de una manera imparcial, Fbxw4 que interactúan las proteínas (Figura 2A). Se realizaron dos controles para ayudar en la interpretación de los datos; inmunoprecipitación de lisados de células que expresan sólo la etiqueta de epítopo FLAG (cont.) o inmunoprecipitación de lisados de células que expresan un F-caja de la bandera de etiquetado "sólo" se realizaron contiene proteína (Fbxo46). Los datos de estos experimentos mostraron que Fbxw4, y no de control, componentes inmunoprecipitadas de una ubiquitina ligasa E3 (SKP1 y Cul1) y los componentes de la COP9 signalosome, mientras que tanto F-caja que contiene proteínas interactuado con SKP1. Curiosamente, un péptido correspondiente a RBX1 también fue identificado en la FLAG-inmunoprecipitación de lisados Fbxw4 que expresan y no de los otros lisados (no mostrados)
A. Tabla que representa el número único de péptidos identificados a partir de experimentos de espectrometría de masas de un representante siguientes inmunoprecipitación FLAG a partir de lisados de células de control que expresan FLAG solamente "contr.", O células que expresan FLAG-Fbxw4 o FLAG-Fbxo46. Columna de la izquierda indica el tamaño de la proteína de interacción, en kilo-daltons (kDa). Gene nombres de las proteínas que contienen los péptidos identificados se muestran en la columna de la derecha. Los componentes de un complejo ubiquitina ligasa E3 están sombreados en gris claro; componentes de la COP9 signalosome están sombreados en gris oscuro. B. Validación de datos de datos de espectrometría de masas por inmunoprecipitación seguida de Western blot. 293 T células fueron transfectadas con plásmidos que contienen FLAG- Fbxw4, FLAG-Fbxo46 o un vector vacío (V). 48 horas lisados celulares después de la transfección se prepararon y las inmunoprecipitaciones se realizaron con anticuerpos anti-FLAG mono-clonal (M2) (para inmunoprecipitar complejos Fbxw4- o Fbxo46-que interactúan). Se realizaron transferencias de Western para detectar Fbxw4 o Fbxo46 (rb BANDERA; anticuerpo policlonal BANDERA; panel superior), SKP1, COPS5, o COPS2. C. Expresión de Fbxw4 altera la migración de SKP1 endógeno mediante cromatografía de filtración en gel. 293 T células fueron transfectadas con un vector vacío (paneles de la izquierda) o una cplasmid que contiene FLAG-Fbxw4 (paneles de la derecha). 48 horas después de la transfección los lisados celulares se prepararon y se separaron en una columna de filtración en gel superpose6. Se realizaron transferencias Western en cada otra fracción para detectar Fbxw4 (paneles superiores) o SKP1 (paneles inferiores). En ausencia de Fbxw4 SKP1 eluye con un pico en la fracción 23, mientras que cuando se expresa Fbxw4 hay co-elución de Fbxw4 con picos en la fracción 15 y en el volumen vacío. se muestran los estándares de tamaño que eluyen de las fracciones dadas.
Para validar los datos de la espectrometría de masas se realizaron inmunoprecipitaciones seguida de transferencias de Western con anticuerpos específicos para las proteínas identificadas. Nuevos lisados se prepararon que expresa, bien FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxo46, o único control FLAG (Figura 2B). Los datos obtenidos demuestran que tanto Fbxw4 y Fbxo46 interactúan con SKP1, pero sólo Fbxw4 interactúa con los componentes de la COP9 signalosome.
Para fortalecer aún más el hallazgo de que Fbxw4 puede interactuar con SKP1 endógena se realizó la cromatografía de filtración en gel en lisados de células transfectadas con un vecotor vacío o un vector de expresión FLAG-Fbxw4 (Figura 2C). Las fracciones obtenidas de la cromatografía se sometieron a transferencia Western con anticuerpo anti-SKP1. Las células que no expresan exógeno Fbxw4 contienen SKP1 que eluye en una fracción correspondiente a menos de 67 kDa, mientras que la expresión de Fbxw4 conduce a co-elución de SKP1 con Fbxw4 en dos nuevos complejos de más de 200 kDa y un complejo que eluye en el vacío . La migración alterada de SKP1 en dos nuevas fracciones que co-eluyen con Fbxw4 apoya la búsqueda de la Fbxw4 interactúa con los componentes de un complejo de ligasa E3.
Fbxw4 interactúa con SKP1 y la COP9 signalosome en una forma dependiente de la caja unitaria
para comenzar a determinar la función bioquímica precisa de Fbxw4, queríamos saber qué interacciones dependían del dominio F-box. Con este fin, hemos diseñado un constructo FBXW4 que carece de los primeros 71 aminoácidos, denominado Fbxw4
-fbox (Figura 3A). Una vez más, inmunoprecipitación seguida por espectrometría de masas se llevó a cabo a partir de lisados celulares que expresan FLAG-Fbxw4, FLAG Fbxw4
-fbox, o la bandera única, para determinar qué proteínas interactúan con las proteínas respectivas. No hay péptidos correspondientes a los componentes de la ligasa o componentes de la signalosome COP9 ubiquitina E3 se identificaron con Fbxw4
-fbox, mientras que se encontraron una vez más estas proteínas para interactuar con Fbxw4 (Figura 3B). Para validar los datos de la espectrometría de masas se realizó inmunoprecipitaciones seguida por transferencias de Western con anticuerpos específicos para las proteínas que interactúan Fbxw4 identificados. Se prepararon lisados que expresa, bien FLAG-FBXW4, FLAG Fbxw4
-fbox, FLAG-Fbxo46, o FLAG único control. Los datos muestran que Fbxw4 y Fbxo46, pero no Fbxw4
-fbox interactúan con SKP1 (Figura 3C).
A. Esquemática de la Fbxw4
-fbox proteína. Los números representan los aminoácidos de la proteína. Dominios contenidos en Fbxw4
-fbox se indican. B. Tabla que representa el número único de péptidos identificados a partir de experimentos de espectrometría de masas de un representante siguientes inmunoprecipitación FLAG a partir de lisados de células de control que expresan FLAG solamente "contr.", O células que expresan FLAG Fbxw4 o FLAG Fbxw4
-fbox. Columna de la izquierda indica el tamaño de la proteína de interacción, en kilo-daltons (kDa). Gene nombres de las proteínas que contienen los péptidos identificados se muestran en la columna de la derecha. Los componentes de un complejo ubiquitina ligasa E3 están sombreados en gris claro; componentes de la COP9 signalosome están sombreados en gris oscuro. C. Validación de datos de datos de espectrometría de masas por inmunoprecipitación seguida de Western blot. 293 T células fueron transfectadas con plásmidos que contienen FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxw4
-fbox, FLAG-Fbxo46 o un vector vacío (V). 48 horas lisados celulares después de la transfección se prepararon y las inmunoprecipitaciones se realizaron con anticuerpos anti-FLAG mono-clonal (M2) (para inmunoprecipitar Fbxw4-, Fbxw4
-fbox-, o Fbxo46-interactúan complejos). Se realizaron transferencias de Western para detectar Fbxw4, Fbxw4
-fbox o Fbxo46 (rb BANDERA; anticuerpo policlonal BANDERA; panel superior). SKP1 o
FBXW4 interacciona con las proteínas celulares ubiquitinated
Hemos demostrado de manera concluyente que Fbxw4 interactúa con un complejo de ubiquitina ligasa E3 y la signalosome COP9. Hemos planteado que Fbxw4 podría interactuar con las proteínas dentro de la célula ubqiuitinated. Se sabe que para muchos sustratos de ubiquitina ligasas E3, la ubiquitinación de la proteína de sustrato conduce a la liberación rápida del complejo. Por lo tanto, la hipótesis de que la inhibición del proteasoma daría lugar a una acumulación de estas proteínas celulares ubiquitina ligasa por el complejo Fbxw4. Por lo tanto, la acumulación de proteínas ubiquitinated, a su vez, dar lugar a un enriquecimiento de las interacciones entre Fbxw4 y ubiquitinated sustratos. Las células fueron transfectadas con un vector vacío (V), HA-ubiquitina, o HA-ubiquitina y FLAG-Fbxw4. 36 horas las células después de la transfección se trataron con el inhibidor del proteasoma, MG132, durante seis horas. Se prepararon extractos celulares y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-HA seguido de Western blot para Fbxw4 (Figura 4A, panel superior). Se encontró un aumento en la cantidad de Fbxw4 para interactuar con proteínas ubiquitinated después del tratamiento MG132. Este Fbxw4 parecía ser el peso molecular normal, lo que sugiere un aumento de la asociación de FBXW4 con proteínas ubiquitinated y no un aumento en Fbxw4 ubiquitated. Por otra parte, el aumento de la cantidad de Fbxw4 que inmunoprecipitada con anti-HA antiobody no se debió a un aumento en la cantidad total de Fbxw4 ya que hubo una ligera disminución en la cantidad total de Fbxw4 después del tratamiento con MG132 (Figura 4A, panel inferior). Como apoyo adicional de esta noción, se produjo un aumento en los niveles totales de proteínas de ubiquitina y un aumento en la cantidad de proteínas ubiquitinadas que inmunoprecipitó con Fbxw4 siguiente inmunoprecipitación de Fbxw4 de los mismos lisados después del tratamiento MG132 (Figura 4A, los paneles medios).
A. Fbxw4 puede ser inmunoprecipitada por proteínas ubiquitinated y Fbxw4 puede inmunoprecipitar proteínas ubiquitinadas. 293 T células fueron transfectadas con el vector vacío (V), HA-ubiquitina, o HA-ubiquitina y FLAG-Fbxw4. 36 horas las células después de la transfección se trataron con MG132 (+) o se dejaron sin tratar (-) durante seis horas. Se prepararon lisados celulares y las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo ya sea con anticuerpos anti-HA (dos paneles superiores) o anticuerpos anti-FLAG mono-clonal (M2) (dos paneles inferiores). Se realizaron transferencias Western en ambos conjuntos de inmunoprecipitaciones con anticuerpos anti-FLAG y anti-HA. B. asociados FBXW4 con las proteínas celulares que se ubiquitinated forma endógena. 293 T células fueron transfectadas con plásmidos que contienen FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4
-fbox, FLAG-Fbxo46 o un vector vacío (V). 36 horas las células después de la transfección se trataron con MG132 (+) o se dejaron sin tratar (-) durante seis horas. Se prepararon lisados celulares y las inmunoprecipitaciones se realizaron con anticuerpos anti-FLAG mono-clonal (M2) (para inmunoprecipitar Fbxw4-, Fbxw4
-fbox-, o FBXO46-interactúan complejos). Se realizaron transferencias de Western para detectar Fbxw4, Fbxw4
-fbox o Fbxo46 (rb BANDERA; anticuerpo policlonal BANDERA; panel superior). La ubiquitina o
Queríamos saber si se obtendrían resultados similares buscando en ubiquitina endógena, en lugar de sobre-expresado HA-ubiquitina. Además, queríamos determinar si los resultados observados anteriormente dependían de un dominio de la caja F intacta. Con este fin, las células fueron transfectadas con FLAG-Fbxw4, FLAG Fbxw4
-fbox, FLAG-Fbxo46, o la bandera única de control de vectores (v). Las células se trataron con vehículo o MG132 durante seis horas y se prepararon lisados celulares. La inmunoprecipitación con anticuerpos anti-FLAG se realizaron y se realizaron transferencias de Western para detectar la ubiquitina endógena o proteínas marcado con FLAG. Hemos observado un aumento dramático en la cantidad de ubiquitina que asocia con Fbxw4. Este resultado no era simplemente debido a la sobre-expresión de Fbxw4 ya que ni Fbxw4
-fbox o Fbxo46, que se expresa a niveles más altos, demostró un aumento de la interacción con las proteínas de ubiquitina después de la inhibición inducida por MG132 del proteasoma. Estos datos indican que se requiere un dominio de F-caja intacta para la asociación de Fbxw4 con proteínas ubiquitinated y no todos F-caja que contiene las proteínas son capaces de ese aumento de interacciones dramáticos con proteínas celulares ubiquitinadas siguientes inhibición del proteasoma. Aunque la interacción entre Fbxw4 y ubiquitinated proteínas celulares depende de una intacta F-box de dominio es necesario más trabajo para determinar si estas proteínas son sustratos bona fide del complejo ubiquitina ligasa SCFFbxw4 o, simplemente, las proteínas que interactúan con el complejo a través de mecanismos alternativos.
FBXW4 está mutado, perdido y bajo-se expresa en los cánceres humanos
para comenzar a abordar la posibilidad de que FBXW4 es importante en el cáncer humano se examinó si el gen está mutado en los cánceres humanos. Mediante la consulta (el proyecto Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) y el catálogo de mutaciones somáticas en el Cáncer (cósmica), del Instituto Sanger) disponibles bases de datos públicas, se encontró que FBXW4 está mutado somáticamente en siete de ~470 tumores que han sido secuencia, hasta el momento (Figura 5A). Dos de las mutaciones son silenciosas y no dan lugar a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína, pero, curiosamente, las cuatro mutaciones sin sentido (R96, G106, R145 y R367) están conservadas evolutivamente todo el camino hacia abajo para algunas especies de Drosophila. De hecho, R96L, G106W y R367C se predijo para interrumpir la función de proteínas con una muy alta significación (p = & lt; 0,0003) utilizando el algoritmo ProPhylER. Además de estas mutaciones perjudiciales predichos, una mutación por cambio de marco, E245fs *, se observó en un paciente de carcinoma de mama que conduciría a la producción de una proteína FBXW4 que carece de los tres últimos WD-40 motivos (Figura 5A). El hallazgo de que las mutaciones somáticas que se encuentran en los cánceres humanos se predicen para interrumpir los aspectos críticos de la función FBXW4 refuerza la posibilidad de que FBXW4 regula importantes procesos homeostáticos.
A. FBXW4 está mutado somáticamente en los cánceres humanos. El proyecto Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) y el Catálogo de mutaciones somáticas en el Cáncer (cósmica), del Instituto Sanger se les preguntó por mutaciones somáticas en FBXW4. De ~470 tumores que fueron analizadas para la mutación en FBXW4, se observaron cinco mutaciones somáticas en los aminoácidos que se indican en el esquema. Curiosamente, los cuatro aminoácidos individuales que son blancos de mutaciones (R96, G106, R145 y R367) se conservan evolutivamente en Drosophila. R96L, G106W y R367C se prevé que interrumpir la función de proteínas (de significación p = & lt; 0,0003, utilizando el algoritmo ProPhylER) y los E245fs * mutación produce una proteína que carece de la última dos años y medio de WD-49 motivos. B. FBXW4 frecuencia se pierde en los cánceres humanos. La frecuencia de pérdida de número de copias de ADN /eliminación a través de 719 líneas celulares de cáncer humano que representan diversos tejidos de origen del Proyecto del Genoma del Cáncer Sanger Institutos se presentan junto con la frecuencia en los tipos de cáncer individuales con n ≥ 5. C. FBXW4 se underexpressed en el cáncer líneas celulares con la pérdida de número de copias. Los diagramas de caja que ilustran los niveles de expresión de ARNm de líneas celulares con pérdida /eliminación y los que no tienen pérdida /eliminación de todas las líneas celulares de cáncer de B. con perfiles de microarrays de expresión de genes correspondientes se presentan junto con la expresión de los cuatro tipos de cáncer individuales con la mayor frecuencia de /deleción (piel, mama, sistema nervioso central (SNC) y el cáncer de pulmón) pérdida. Los niveles de expresión se compararon entre los dos grupos utilizando la prueba de Mann-Whitney U-test y un p & lt; 0,01 fue considerado significativo. Bigotes representan los percentiles 10-90 con los puntos donde se presentan los valores atípicos. D. FBXW4 se pierde y bajo-expresados en los tumores de adenocarcinoma de pulmón clínicos de proyecto TCGA.