Extracto

El antiapoptótica miembro de la familia Bcl-2 MCL-1 es una proteína de plagas (que contiene secuencias enriquecidas en prolina, ácido glutámico, serina, y treonina) y está sujeto a la degradación rápida a través de múltiples vías. Deterioro de la degradación que conduce al mantenimiento de MCL-1 de expresión es un importante determinante de resistencia a fármacos en cáncer. La fosforilación en Thr 163 en la región PEST, estimulado por el ácido acético 12-O-tetradecanoilforbol (TPA) la activación inducida de la quinasa extracelular regulada por señal (ERK), se asocia con MCL-1 estabilización en células de linfoma de Burkitt BL41-3. Esto contrasta con la observación de que la fosforilación de Thr 163 en fibroblastos normales ceba la glucógeno sintasa quinasa (GSK3) la fosforilación inducida en Ser 159, produciendo un phosphodegron que se dirige a MCL-1 para la degradación. En los presentes estudios de seguimiento en las células BL41-3, se encontró que la degradación de Mcl-1 de ser independiente de la vía mediada por GSK3, proporcionando una paralela a los hallazgos emergentes que muestran que la degradación de Mcl-1 a ​​través de esta vía se pierde en muchos tipos diferentes de cáncer. Los hallazgos en células CHO transfectadas-MCL-1 corroboraron los de las células BL41-3 en que la GSK3 phosphodegron orientados no jugó un papel importante en la degradación del MCL-1, y una mutación T163E phosphomimetic dieron lugar a marcadas MCL-1 de estabilización. TPA-tratada BL41-3 células, además de exhibir Thr 163 fosforilación y MCL-1 estabilización, exhibió un aumento ~ 10 veces en la resistencia a múltiples agentes quimioterapéuticos, incluyendo Ara-C, etopósido, vinblastina, o cisplatino. En estas células de cáncer en el que MCL-1 degradación no depende de la /vía phosphodegron-dirigida, la activación de ERK GSK3 y Thr 163 fosforilación están asociados con pronunciado MCL-1 de estabilización y resistencia a los medicamentos - efectos que pueden ser suprimida por la inhibición de la activación de ERK .

Visto: Nifoussi SK, Vrana JA, Domina AM, De Biasio A, J Gui, Gregorio MA, et al. (2012) La fosforilación de Thr 163 Causas MCL-1 Estabilización cuando la degradación es independiente de la Adyacente Phosphodegron GSK3-dirigida, Promoción de la Resistencia a las Drogas en cáncer. PLoS ONE 7 (10): e47060. doi: 10.1371 /journal.pone.0047060

Editor: Justin L. Mott de la Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 25 Junio, 2012; Aceptado: 7 Septiembre 2012; Publicado: 9 Octubre 2012

Copyright: © Nifoussi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue financiado por los Institutos nacionales de Salud (R01 CA 057.359 a la RWC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el aumento de expresión de MCL-1, estimulada por factores de crecimiento y otras señales ambientales, promueve la viabilidad y permite la amplificación y la función de los tipos de células y linajes que necesita el organismo [1] - [4]. MCL-1 regulación a la baja, a su vez, frena estos procesos e induce la muerte de células dañadas, no funcionales, senescentes [1], [5] - [7]. El mantenimiento de elevados MCL-1 de expresión se asocia con la resistencia a los medicamentos y de mal pronóstico en una variedad de tipos de cáncer [8] - [15]. Los agentes que inducen MCL-1 rotación, e inhibidores diseñados para dirigir la proteína, pueden promover la muerte de las células tumorales [16] - [20].

MCL-1 fue identificado sobre la base de aumento de la transcripción en ML-1 mieloblástica humana células de leucemia inducidas a diferenciarse a la exposición a TPA [21], [22]. MCL-1 también está regulada después de la traducción (fig. 1A), como se observa en la línea celular de linfoma de Burkitt BL41-3 endógena en el que MCL-1 se amplifica y se sobreexpresa [1], [23], [24]. MCL-1 es una proteína PEST y es normalmente sujetos a una rápida rotación. Sin embargo, la exposición de las células a TPA BL41-3 resulta en la activación de la ERK quinasa de proteína activada por mitógeno (MAP), junto con un aumento de ERK-dependiente en MCL-1 fosforilación en Thr 163 y marcadamente redujo la degradación de la proteína MCL-1 [25], [26].

los sitios de fosforilación en Thr 163 y Ser 159 en la proteína MCL-1 humano se esquematizan. Thr 163 está sujeto a la fosforilación por MAP quinasas, como se ve en la activación de ERK inducida por TPA en células BL41-3. Ser 159 está sujeto a la fosforilación por GSK3. MCL-1 es una proteína PLAGAS sujetos a una rápida rotación, la vida media de la decadencia de ser ~ 3 horas en BL41-3 células (punteado de menor frente a una mayor densidad indica una mala PEST y secuencias potenciales de plagas; PESTFIND). Sin embargo, MCL-1 exhibe notables de estabilización después de la activación de ERK inducida por TPA y Thr 163 fosforilación en estas células. MCL-1 también está sujeto a otra modificación postraduccional que implica el truncamiento de la extrema N-terminal ([28] indica con una punta de flecha). Esto resulta en un poco espaciados doblete 42/40 kd, donde la banda 40 kd inferior carece de aproximadamente 16 residuos de aminoácidos y es la banda más abundante presente en BL41-3 células. El doblete se visualiza mejor en las grandes geles de electroforesis formato (Fig. S1B) pero a veces se puede detectar en geles estándar (Fig. 1C). Como Thr 163 fosforilación no impide el truncamiento N-terminal, MCL-1 estabilización en la presencia de esta fosforilación se ve como decaimiento lento de la banda de 40 kd. B: células BL41-3 se dejaron sin tratar o se expone a TPA (5 nM) durante los tiempos indicados, y monitoreados para la expresión de Thr 163 fosforilada MCL-1 (MCL-1 pT163), el total de MCL-1, ERK fosforilada (Perk ), y GAPDH (ChemiDoc). Todas las muestras se llevaron a cabo al mismo tiempo y se sometieron a la misma exposición autorradiográfica, donde la línea vertical negro en esta y en las figuras subsiguientes indica que los carriles se han reorganizado para facilitar la comparación. Thr 163 fosforilación también fue inducida por concentraciones más bajas de TPA (por ejemplo, 1 nM; Fig. S1C), y fue inhibida por U0126 (Fig S1D.). m C: células BL41-3 se dejaron sin tratar o expuestos a TPA (1 nM). Algunas células fueron inmediatamente expuestos a CHX para supervisar MCL-1 descomposición de proteínas en el Día 0. Se incubaron células adicionales TPA-tratado durante 24 horas (Día 1 después de TPA Addition) y luego expuestos a CHX, donde una parte de estas células se retiró con TPA en este momento. La muestra de células sin tratar (Tiempo 0) es idéntico para cada par de transferencias de Western. La mancha en la parte inferior confirmó que pERK se redujo a 24 horas

MCL-1 también está sujeto a la fosforilación por GSK3 [20], [27] - [34].. De hecho, la fosforilación inducida por MAP quinasa en Thr 163 proporciona un sitio de cebado para la fosforilación inducida por GSK3 en Ser 159, como se ha demostrado en fibroblastos de ratón normales expuestos a la radiación ultravioleta (UV) de la irradiación [27]. En este sistema, la fosforilación en el sitio de fosforilación de la quinasa MAP (Thr 163) se lleva a cabo por la quinasa c-Jun N-terminal (JNK); subsiguiente fosforilación en el sitio de fosforilación de GSK3 (Ser 159) da como resultado la producción de un phosphodegron que se dirige a MCL-1 para la degradación por ubiquitina ligasas E3 que contienen proteínas F-box [28], [32] - [34]. MCL-1 también puede ser degradado por una variedad de otras vías, tales como a través de la BH3-que contiene E3 MULE ubiquitina ligasa (también llamado Arf-BP /Lasu1 /Huwe1 [35], [36]), la promoción de complejos anafase [37 ], y los mecanismos de ubiquitina-independiente [38].

emergentes resultados indican que una reducción de MCL-1 degradación a través de la vía de GSK3 inducida por arriba contribuye a la resistencia a fármacos en el cáncer. Por ejemplo, la inactivación de GSK3 en muestras de pacientes con cáncer de mama se asocia con abundante MCL-1 de expresión y un peor pronóstico [20], [32]. Del mismo modo, la reducción de MCL-1 degradación a través de la vía de GSK3 /phosphodegron orientada ha sido implicado en la leucemia linfocítica crónica [13], [39], [40]. Una variedad de cánceres resistentes a los fármacos exhiben la inactivación de la proteína F-box Fbw7, que se encuentra aguas abajo de los acontecimientos de fosforilación, tales como las inducidas por GSK3 [33], [34]. En otros casos, las células cancerosas presentan una mayor expresión de un deubiquitinase [41]
.
Debido a la importancia de MCL-1 en el cáncer, se estudió adicionalmente la estabilización de Mcl-1 que se produce tras la activación de ERK inducida por TPA en BL41-3 células. Nuestro propósito era entender mejor el hallazgo de que la fosforilación de Thr 163 está asociado con MCL-1 estabilización en estas y otras células del cáncer [42], pero los números primos MCL-1 para la degradación de GSK3 /phosphodegron orientada en fibroblastos normales [27]. A pesar de que la fosforilación en sitios adicionales podrían estar involucrados (por ejemplo, Thr 92 [20]), esto no parece ser el caso en BL41-3 células [25]. Los resultados de nuestros estudios mostraron que la vía mediada por GSK3 no juega un papel importante en MCL-1 degradación en BL41-3 células. Esto contrasta con lo que se observa en los fibroblastos normales, pero es paralela a los hallazgos emergentes que muestran que MCL-1 degradación a través de esta vía se ve afectada a menudo en el cáncer. La asociación de Thr 163 fosforilación con MCL-1 de estabilización en esta situación se ha recapitulado en células CHO transfectadas, donde la degradación del MCL-1 no se vio afectada por una mutación T163A no phosphorylatable pero fue casi completamente bloqueado por una mutación T163E phosphomimetic. Junto con la activación de ERK, Thr 163 fosforilación, y MCL-1 estabilización, TPA-tratada BL41-3 células expuestas marcadamente mayor resistencia a la apoptosis de la inducción a la exposición a fármacos quimioterapéuticos. Sin embargo, la sensibilidad de drogas fue parcialmente restaurada por un inhibidor de la activación de ERK. En contraste con las células normales, donde Thr 163 fosforilación puede promover GSK3 /Ser 159 phosphodegron orientada MCL-1 degradación y la muerte, en células de cáncer en el que MCL-1 no se degrada a través de esta vía, la activación de ERK y Thr 163 fosforilación se asocia con una reducción MCL-1 y la degradación de la resistencia a fármacos sorprendente. La inhibición de la activación de ERK /Thr 163 fosforilación representa un enfoque prometedor para la promoción de MCL-1 degradación y sensibilidad a los fármacos en estas células cancerosas.

Métodos

Líneas de células y tratamientos

BL41 -3 células se derivaron como una sublínea de células de linfoma de Burkitt BL41 como se describe [23], y se mantuvieron en RPMI 1640 que contenía 7,5% de FBS. Los derivados 5A-HSmyc CHO de células [43], [44] se mantuvieron en medio alphaMEM que contiene 5% de FBS. El AKR-2B línea de fibroblastos de embriones de ratón era de M. J. Getz (Fundación Mayo, Rochester, MN) [45], y se cultivó en medio 5A de McCoy que contenía FBS al 5%. TPA era de Alexis Biochemicals, LiCl, cicloheximida, LY294002, etopósido, vinblastina, cis-diaminodicloroplatino (II) (cisplatino), wortmanina, y arabinósido de citosina (Ara-C) eran de Sigma, U0126 era de EMD Chemicals, y NaCl de Fisher científica.

MCL-1 Calcula y transfección

MCL-1 de expresión construcciones estaban en el vector pcDNA 3.1 [25] que contiene un marcador de resistencia a neo. El WT-MCL-1, MCL-1-T163A, y MCL-1-T162A construcciones se han descrito, y MCL-1-T163E y MCL-1-S159A se prepararon utilizando los mismos métodos [25], con las siguientes cebadores . Para MCL-1-T163E (cebador superior) 5'-GGTCACTACCCTCGGAGCCGCCGCCAGCAG-3 'y (cebador inferior) 5'-CTGCTGGCGGCGGCTCCGAGGGTAGTGACC-3', y por MCL-1-S159A (cebador superior) 5'-CGGACGGGGCACTACCCTCGACGCCGCCGC-3 'y ( imprimación inferior) 5'-GCGGCGGCGTCGAGGGTAGTGCCCCGTCCG-3 '. La transfección se llevó a cabo con Effectene (Qiagen) o Lipofectectamine 2000 (Invitrogen), utilizando células sembradas el día anterior.

Análisis Western

condiciones de transferencia de Western que detectan la proteína MCL-1 humano tienen han descrito [25], [43], donde no se observa reactividad cruzada con la proteína de hámster chino. Se utilizaron geles de electroforesis de tamaño estándar, excepto lo indicado en los que se utilizan grandes geles formato que separan el doblete MCL-1. Para el seguimiento de MCL-1 caries en las células CHO, las células se volvieron a sembrar a un medio fresco en el día después de la transfección y se expusieron a CHX (20-25 microgramos /ml) 24 horas más tarde [30]. Para BL41-3 células se utilizó una concentración de 2,5 microgramos /ml CHX [25]. Un sistema de ChemiDoc Imagen Molecular (BioRad) se hizo disponible y se usa para algunos experimentos, lo que permitió la estimación de los cambios en MCL-1 de expresión. Estos cambios se calcularon como una disminución de MCL-1 expresión relativa a paralelo células control sin tratar. Mientras que un anticuerpo dirigido contra útil MCL-1 phosphoThr 163 no está disponible comercialmente, una pequeña cantidad del anticuerpo descrito anteriormente estaba disponible [46].

Pulso /Chase
35S-Met Etiquetado

métodos descritos anteriormente [24] - [26]. En resumen, un día después de la siembra, las células se lavaron 3 veces y se incubaron con en medio RPMI exento de metionina que contiene 5% de FBS dializado y tampón HEPES 25 mM. Las células se marcaron con pulsos tran-
35S-Met para 2 horas y, a continuación perseguido con medio alphaMEM que contiene 5% de FBS y un adicional de 15 mg /ml de L-metionina. Después de la recolección y lavado dos veces con PBS en hielo, el sedimento se lisaron mediante el paso a través de una jeringa en tampón de lisis [tampón de lavado (KCl mM 142.5, mM MgCl 5
2, EGTA 1 mM en 20 mM Tris-Cl, pH 7,4 ) que contiene 0,2% Nonidet P-40 y Sigma proteasa y fosfatasa inhibidor de cócteles]. El sedimento se incubó durante la noche en el frío con antiMcl-1 anticuerpo (Santa Cruz S-19) conjugado con Dynabeads (Dynal, Noruega), se lavó dos veces con tampón de lisis, una vez con tampón de lavado, y se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. El gel se fijó en ácido acético al 10%:. 30% de metanol, empapado en NAAMP 100 Amplify (Amersham Biosciences, UK), se secó, y se expuso a película de rayos X y una pantalla de PhosphorImager, siendo este último analizaron utilizando el software ImageQuant

citometría de Flujo

la citometría de flujo se llevó a cabo utilizando un antiMcl-1 anticuerpo conjugado con FITC con el Caltag Fix & amp;. kit Perm (10.000 células se ensayaron para cada muestra)

muerte celular Los ensayos

Las células apoptóticas como se definió originalmente morfológicamente fue evaluado utilizando Giemsa de Wright cytospin preparativos manchado (Shandon) de diapositivas [17], [47], [48]. la escisión de PARP se analizó por análisis de Western blot utilizando el anticuerpo total de PARP (Señalización Celular), y el escaneo quimioluminiscente de las membranas utilizando el sistema ChemiDoc. Banda intensidades se cuantificaron utilizando el programa de Fiji (NIH ImageJ).

Análisis estadístico

La vida media de descomposición de Mcl-1 proteínas codificadas (ensayada utilizando el sistema de ChemiDoc) se estimó por no -linear de regresión usando Prism 5 (GraphPad Software). Otros análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SigmaStat.

Resultados

Activación de ERK, fosforilación de Thr 163, y la estabilización de la proteína endógena MCL-1 ocurren temprano después de la exposición de células BL41-3 a TPA y son downregulated Posteriormente
células
BL41-3 exhiben abundante expresión constitutiva de endógeno MCL-1 (~ 5 veces mayor que las células ML-1 estimuladas con TPA [23]), y han demostrado ser muy útiles para los estudios de su regulación postraduccional. Resultados de la activación de ERK inducida por TPA en poco más al aumento de MCL-1 de expresión en estas células (Fig. S1 A, B), al contrario que en ML-1 y otras células [17], [21], [22], [25], [26]. células BL41-3 son por lo tanto particularmente útil para los estudios de TPA /ERK inducida por Thr 163 fosforilación [24], ya que los efectos sobre la estabilidad de la proteína se pueden examinar en ausencia de sustancial MCL-1 inducción.

nuestros experimentos iniciales caracterizan además la sincronización de los efectos inducidos por TPA, ya que la activación de ERK es a menudo transitoria [17], [49]. la activación de ERK y el aumento de la fosforilación de Thr 163 eran detectables a menos de 0,5 horas después de TPA Además [24], [25] y se mantuvo durante aproximadamente 6 horas, disminuyendo a partir de entonces como un seguimiento durante un máximo de 24 horas (Fig. 1B y Fig. S1A). Para determinar si la disminución de la activación de ERK y Thr 163 fosforilación visto después de una exposición prolongada TPA se reflejaría en una disminución de MCL-1 de estabilización, que supervisó MCL-1 desintegración tanto inmediatamente después de la adición de TPA y 24 horas más tarde. Cuando se aplicó CHX para inhibir la síntesis de proteínas, MCL-1 degradación fue casi completa dentro de 7 horas (Fig. 1C, arriba a la izquierda), pero se vio frenado después de la aplicación concomitante de TPA (Fig. 1C, la parte superior derecha), al igual que en estudios anteriores [ ,,,0],25]. Sin embargo, cuando se aplicó CHX 24 horas después de TPA, MCL-1 de estabilización fue atenuada (Fig. 1C, parte inferior izquierda), aunque podría ser restaurada por la aplicación de TPA adicional en este momento (Fig. 1C, inferior derecha). En suma, la activación de ERK, fosforilación de Thr 163 y MCL-1 de estabilización se producen como eventos tempranos tras la exposición de las células a TPA BL41-3, y están regulados a la baja toda posteriormente. Estos resultados refuerzan las conclusiones anteriores, que habían sugerido una asociación estrecha entre estos efectos inducidos por TPA en que todos fueron inhibidas por el U0126 inhibidor de la vía ERK ([25] y en la Fig. S1D).

MCL-1 en la degradación Las células BL41-3 es LiCl-insensibles

MCL-1 puede ser destinada a la degradación por GSK3, y la exposición a TPA resulta en la inactivación de GSK3 en algunas células [29], [31], [32], [50 ], [51]. Por tanto, parece posible que la TPA inducida por la inactivación de GSK3 y la inhibición de la degradación de MCL-1 a través de esta vía podría explicar la estabilización observada en las células BL41-3. Como medio de examinar esta posibilidad, se probaron para un efecto de TPA sobre la expresión del objetivo GSK3 beta-catenina. El efecto del inhibidor de GSK3 LiCl se monitorizó en paralelo. El último agente sirvió como control positivo capaz de causar un aumento en la expresión de beta-catenina (Fig. 2A carril 3, fotografía de medio). Nuestro propósito era determinar si TPA imitaba el efecto de LiCl para producir un aumento en la expresión de beta-catenina, ya que esto sería sugerente de un efecto sobre GSK3. . Sin embargo, la TPA no parecen tener un efecto tal en que no aumentó la expresión de beta-catenina en ausencia de LiCl (Fig. 2A carril 2, la fotografía central)

A: BL41-3 células fueron o bien no se tratan o se expone a TPA (20 nM) y /o LiCl (20 mM, NaCl o como un control). Después de 18 horas, la expresión de MCL-1, beta-catenina, y GAPDH y se ensayó por transferencia de Western. Se observaron resultados comparables cuando las células fueron expuestas a TPA durante 30 minutos en lugar de 18 horas (no mostrados). B: células BL41-3 se expusieron a las concentraciones indicadas de LiCl (o KCl o NaCl como controles), y se ensayaron para la expresión de MCL-1 y beta-catenina después de 24 horas. Se utilizó un gel de gran formato que separa las bandas de doblete de Mcl-1. inhibición ligera del crecimiento celular se observó a LiCl 10 a 20 mM (13 y 27%, respectivamente, en comparación con 5% con NaCl 20 mM). Resultados similares a los mostrados se obtuvieron con un tiempo de exposición de 12 horas o una concentración de LiCl 40 mM (no mostrado). C: células BL41-3 se incubaron en ausencia o en presencia de LiCl (20 mM) durante 0,5 horas, momento en el que se aplicó CHX. Expresión de MCL-1, beta-catenina, y GAPDH se ensayó después de los tiempos indicados. No hay diferencia sustancial se observó en las células expuestas al paralelas NaCl (20 mM, que no se muestra) en lugar de LiCl.

MCL-1 de expresión también se controló en el experimento anterior, y no se encontró a incrementarse en presencia de LiCl (Fig. 2A, la fotografía superior). De hecho, ningún cambio en MCL-1 se observó expresión incluso a concentraciones de LiCl que causaron un aumento máximo en la expresión de beta-catenina y después de un examen utilizando grandes geles de formato (Fig. 2B). Esta observación fue interesante como LiCl estabiliza MCL-1 en una variedad de células y que había asumido inicialmente que una vía mediada por GSK3, LiCl sensible podría estar involucrado en BL41-3 células. Sin embargo, observaciones adicionales también fueron consistentes con la falta de un papel para esta vía en MCL-1 la degradación en las células BL41-3. Por lo tanto, la exposición de estas células a wortmanina o LY294002, inhibidores de PI3K que pueden prevenir la fosforilación inhibitoria de GSK3 y con ello mejorar la degradación de sus objetivos, no afectó notablemente la expresión de MCL-1, mientras que la reducción de la de la beta-catenina (Fig. S2A ). Además, LiCl no se encontró a afectar MCL-1 la degradación en presencia de CHX (Fig. 2C). En suma, MCL-1 la degradación en las células BL41-3 parecía ser en gran parte LiCl-insensible, y TPA no actuó al imitar el efecto de este inhibidor de GSK3. Estos resultados, tomados en conjunto con los resultados anteriores (Fig. 1 y [25]) sugirieron que la fosforilación de Thr 163 podría estar asociado con MCL-1 en las células de estabilización en el que la degradación de GSK3 orientada no juega un papel importante. Este punto se considera más adelante, utilizando el sistema de células CHO transfectable en el que mutantes del sitio de fosforilación podría ser examinados.

MCL-1 Degradación no depende de la Phosphodegron GSK3-orientada y es marcadamente retrasado por un T163E La mutación en Las células CHO transfectadas las células

CHO proporcionan un sistema fácilmente transfectables útil para el estudio de mutaciones en los sitios encontró a sufrir una modificación posterior a la traducción de forma endógena en BL41-3 células [24], [25], [30], [43] . células CHO contienen basal activan ERK diferencia BL41-3 células. De acuerdo con ello, Thr 163 fosforilación se produce tras la transfección con WT-MCL-1, y no se incrementa aún más por la adición de TPA [25]. por lo tanto, nos dispusimos a examinar el efecto de una mutación T163A no fosforilable, así como una mutación T163E phosphomimetic, tras la transfección de constructos mutantes en células CHO. Curiosamente, los resultados preliminares mostraron que LiCl no afectó a la expresión o la degradación de WT-MCL-1 en células CHO, aunque la expresión de beta-catenina se incrementó (Fig. 3A y la Fig. S2B). Esto proporcionó una paralela a los hallazgos en la expresión endógena BL41-3 células (Fig. 2C), y sugirió que la degradación de MCL-1 podría no ser asimismo mediada a través de GSK3 en células CHO transfectadas. En este caso, no se esperaría que una mutación T163A afectar MCL-1 degradación. Esto sería diferente de lo que se ve en los fibroblastos normales, en los que una mutación T163A se desacelera MCL-1 debido a la degradación de Thr 163 fosforilación de GSK3 ceba inducida Ser 159 fosforilación y la degradación [27]. De hecho, la proteína codificada-T163A-MCL-1 se sometió a una rápida degradación tras la exposición de las células CHO transfectadas de CHX (Fig. 3B), al igual que el WT-MCL-1-, MCL-1-S162A- y MCL-1-S159A proteínas codificados con (Fig. 3B, C). MCL-1-S162A representa un control adicional como la fosforilación no se ha observado en este sitio [25]. Observamos que, al igual que en informes anteriores [27], un /T163A doble mutante S159A no fue examinada, ya que una pérdida casi completa de MCL-1 fosforilación se ve con la mutación T163A en células CHO [25] y este sitio cebador de mutación evita Ser 159 fosforilación en fibroblastos [27]. Tomados en conjunto, estos resultados con mutaciones no fosforilables así como LiCl sugieren que la GSK3 phosphodegron orientada no juega un papel importante en la degradación de MCL-1 en células CHO transfectadas. En esta situación, la proteína codificada MCL-1-T163E exhibió golpear estabilización [Fig. 3B (véase la exposición más ligero incluido en la parte inferior debido a la extensa estabilización visto con esta construcción) y en la Fig. 3C]. Se obtuvieron resultados similares con células AKR-2B (Fig 3D.)

A:. células CHO fueron transfectadas con WT-MCL-1 y se incubaron en presencia de LiCl (+ LiCl; 20 mM) o en su ausencia (-LiCl) que se añadió NaCl 20 mM en el último caso. Después de 10 horas, se aplicó CHX y la expresión del producto del gen WT-MCL-1 introducido, y endógeno beta-catenina y GAPDH, se ensayó después de los tiempos indicados (ChemiDoc). La vida media de MCL-1 caries se estimó en ~ 4 horas en las células expuestas a LiCl, y 3,7 horas en los controles expuestos a NaCl. No hay diferencia sustancial se observó en las células paralelas no expuestas a NaCl o LiCl. La mancha se muestra es representativa de tres experimentos independientes. B-C: células CHO fueron transfectadas con las construcciones indicadas, replated en el día siguiente, y se incubaron durante un período de 24 horas para permitir la expresión. Después, se añadió CHX y la expresión del producto del gen de Mcl-1 introducido y endógeno beta-tubulina se ensayó después de los tiempos indicados por transferencia Western. En el panel B, la disminución de MCL-1 de expresión a las 3 horas en 2 experimentos independientes osciló entre 53-66% con WT-MCL-1, 25-54% con MCL-1-S162A, y 25-50% con Mcl- 1-T163A. Si bien la disminución de la expresión con WT-MCL-1 apareció ser ligeramente mayor que la observada con MCL-1-T163A, esto no fue un hallazgo consistente. Una exposición autorradiográfica corta también se muestra porque bandas adicionales se detectaron en los altos niveles de expresión obtenidos con MCL-1-T163E. Al final del período de observación de 12 horas, la expresión de MCL-1-T163E se redujo ~ 15% en el Panel B y ~27% en el Panel C, como se estima a partir de las exposiciones autorradiográficas cortos. D: células AKR-2B transfectadas con las construcciones indicadas se volvieron a sembrar en el día siguiente, en la que la viabilidad celular tiempo (azul de tripano colorante de exclusión) fue 88 a 92% en no transfectadas, así como cultivos transfectados. Un día después, las células fueron expuestas a 25 microgramos /CHX ml y se ensayaron después de los tiempos indicados para la expresión del producto del gen de Mcl-1 introducido o actina endógeno por transferencia Western. placas duplicadas se muestran en los carriles adyacentes.

MCL-1-T163E Exposiciones elevada acumulación y evita que la derivación de transfectantes estables resistentes a G418

En el experimento anterior, MCL-1- T163E exhibió acumulación elevada durante el período de expresión antes de la aplicación de CHX (Fig. 3B, el tiempo 0). El examen de la evolución temporal de la acumulación confirmó que un aumento dramático se produjo después de la transfección con MCL-1-T163E en comparación con WT-MCL-1 (Fig. 4A, carriles 4-5 frente carriles 1-2).

a: células CHO fueron co-transfectadas con cualquiera de WT-MCL-1 o MCL-1-T163E junto con pEGFP, y se ensayaron en los tiempos indicados para la expresión del producto del gen de Mcl-1 introducido y EGFP por Western Blot. La tasa de aumento de la proteína de Mcl-1-T163E se estimó en al menos 10 veces mayor que la de WT-MCL-1. Aproximadamente expresión equivalente de EGFP en cultivos-transfectadas con T163E MCL-1 WT-MCL-1 y también se observó en el ensayo de citometría de flujo (no mostrado). B: células CHO fueron transfectadas con WT-MCL-1 o MCL-1-T163E y se sometieron a una exposición de pulso 2 horas a
35SMet, momento en el que se recogió una muestra de "tiempo 0". Después se realizó una persecución con medio que contiene metionina no radiactivo y se analizaron los
35SMet- etiquetados proteínas MCL-1 después de los tiempos indicados (fotografía superior). Una banda no específica de ~32 kd se incluye en la figura (*) con fines comparativos y una alícuota separada de cada muestra se ensayó para el total de MCL-1 de expresión por Western Blot (fotografía inferior). La vida media de la caries se estimó mediante PhosphorImager sea, 2,5 veces más larga con
35S-Met-MCL-1-T163E que con
35S-Met-WT-MCL-1.


A marcaje metabólico de pulso /chase,
35S-Met-MCL-1-T163E y
35S-Met-WT-MCL-1 demostró la síntesis equivalente durante el impulso inicial (Fig. 4B, el tiempo 0 ). Después de la persecución, la decadencia de
35S-Met-MCL-1-T163E se vio frenado en comparación a la de
35S-Met-WT-MCL-1 (Fig. 4B), a pesar de la desaceleración que aquí no era tan marcada como se había visto en el control de la proteína total MCL-1-T163E por Western Blot (Fig. 3B). Esto podría reflejar el hecho de que el etiquetado de pulso /Chase Ensayos de la proteína recién sintetizada (generalmente una fracción del total), u otras diferencias entre estos métodos [52], [53]. Tomados en su conjunto, los hallazgos anteriores reforzaron y ampliaron los de BL41-3 células, lo que demuestra que la mutación T163E dio lugar a la estabilización MCL-1 en las células CHO, donde la degradación era en gran medida independiente de la phosphodegron GSK3-dirigido a S
159LPST
163P.

La amplia estabilidad y la acumulación elevada visto con MCL-1-T163E puede estar relacionada con una observación adicional, que fue que no fuimos capaces de derivar líneas celulares transfectadas de forma estable con este constructo. Esta observación fue al principio algo inesperado, porque en continuo crecimiento líneas celulares transfectadas se obtuvieron previamente con WT-MCL-1 después de la selección con G418 (debido a los neo
R marcador [43]) y también podría obtenerse con MCL-1- T163A. MCL-1 expresión en estas líneas celulares transfectadas de forma estable estaba en el intervalo observada en las células que expresan MCL-1 endógena, tales como BL41-3 células y células ML-1 tratadas con TPA ([43] y el panel superior y la leyenda).

a la vista de la observación anterior, se examinaron las culturas MCL-1-T163E-transfectaron en los primeros tiempos después de la transfección y selección con G418. Directamente después de la transfección, se observó una amplia gama de MCL-1 los niveles de expresión (Fig. S3A panel inferior). Cuando G418 se aplicó luego para eliminar las células no transfectadas, las células viables no crecieron a cabo a partir de cultivos MCL-1-T163E transfectadas, a diferencia de lo que ocurrió con el WT-MCL-1 [Fig. S3B (lleno símbolos en la derecha frente panel central), donde las células crecieron en ausencia de G418 en ambos casos, pero perdieron MCL-1 de expresión (símbolos abiertos)]. Las células resistentes a G418 que surgieron con WT-MCL-1 exhibieron niveles mucho menores de expresión que la población mayor inicial transfectadas (Fig. S3C, carriles 10-12). Por el contrario, una expresión abundante se mantuvo en transfectadas-T163E MCL-1 culturas (Fig. S3C, carriles 16-18). En general, la selección con G418 dio como resultado la derivación de líneas transfectantes que muestran expresión en el rango endógeno con WT-MCL-1, así como MCL-1-T163A, pero no con MCL-1-T163E.

Además a su efecto antiapoptótico, MCL-1 se ha informado que inhiben la proliferación celular en algunos sistemas [54], [55]. Este efecto no se observó en los transfectantes estables que expresan la proteína a niveles en el intervalo endógeno [56]. Sin embargo, la inhibición de la proliferación se ha visto después de la transfección transitoria o otros enfoques capaces de producir altos niveles de expresión. El hecho de que las líneas de células CHO transfectadas-MCL-1 WT exhibieron expresión en el rango endógena (panel superior. Figura S3 A) sugiere que estas células pueden haber tenido una ventaja de crecimiento sobre los que tenían niveles más altos de expresión. transfectantes estables con otra línea del destinatario del mismo modo exhibieron expresión en el rango endógena, pero no superior [56]. En general, mientras WT-MCL-1 promueve la viabilidad en clones establemente transfectadas que expresan niveles en el intervalo endógeno, queda por determinar si los niveles de expresión más altos dan lugar a efectos adicionales tales como la inhibición de la proliferación celular.

A la vista de las consideraciones anteriores, tal vez no sea sorprendente que las líneas transfectadas de forma estable no se obtuvieron con MCL-1-T163E. Observamos que la expresión de la tubulina endógeno se redujo en cultivos transfectados con esta construcción (Fig. S3C), que podría relacionarse con elevada expresión de la proteína transfectada y /o la presencia de la mutación Glu no extraíble. También observamos que algunas células dentro de la mayor población inicial transfectadas-T163E MCL-1 exhibieron una menor expresión (Fig. S3 A ​​panel inferior).