Extracto
Antecedentes
T inmunoglobulina celular (Tim-3) se ha identificado como un regulador negativo de la lucha contra El tumor inmunidad. Estudios recientes ponen de relieve la importancia del papel de Tim-3 en las células CD8
+ T agotamiento de las células que se lleva a cabo en los dos modelos de cáncer en humanos y animales. Sin embargo, la naturaleza de la expresión Tim-3 en la célula tumoral y el mecanismo por el que inhibe la inmunidad anti-tumor no son claros. El presente estudio tiene como objetivo determinar Tim-3 se expresa en células de cáncer cervical y para evaluar el papel de Tim-3 en la progresión del cáncer de cuello uterino.
Metodología
Un total de 85 muestras de tejido cervical que incluye participaron 43 cáncer de cuello uterino humano, 22 neoplasia intraepitelial cervical (NIC) y 20 cervicitis crónicas. Tim-3 de expresión en las células tumorales se detectó y se encontró que se correlacionan con parámetros clínico. Mientras tanto, la expresión de Tim-3 se evaluó mediante RT-PCR, Western Blot y microscopía confocal en líneas celulares de cáncer de cuello uterino, HeLa y SiHa. El potencial de la migración y la invasión de las células HeLa se evaluó después de la inhibición de Tim-3 de expresión por ADV-antisentido Tim-3.
Conclusiones
Hemos encontrado que Tim-3 se expresa a un nivel más alto en las células de cáncer cervical clínicos en comparación con el CIN y controles cervicitis crónica. Hemos apoyado este hallazgo mediante la confirmación de la presencia de Tim 3-mRNA y proteína en las líneas de células del cuello uterino. Tim-3 de expresión en las células tumorales correlacionadas con parámetros clínico. Los pacientes con alta expresión de Tim-3 tenían un significativo potencial metastásico, cáncer avanzado grados y la supervivencia general más corta que aquellos con menor expresión. El análisis multivariado mostró que Tim-3 de expresión fue un factor independiente para predecir el pronóstico de cáncer de cuello uterino. De manera significativa, regular por disminución la expresión de la migración inhibido proteína Tim-3 y la invasión de las células HeLa. Nuestro estudio sugiere que la expresión de Tim-3 en las células tumorales puede ser un factor pronóstico independiente para los pacientes con cáncer de cuello uterino. Por otra parte, Tim-3 de expresión puede promover el potencial metastásico en los cánceres de cuello uterino
Visto:. Cao Y, Zhou X, Huang X, Q Li, Gao L, Jiang L, et al. (2013) Tim-3 de expresión en el cáncer cervical promueve la metástasis tumoral. PLoS ONE 8 (1): e53834. doi: 10.1371 /journal.pone.0053834
Editor: Pierre Busson, Instituto Gustave Roussy de Cancerología, Francia |
Recibido: 27 de septiembre de 2012; Aceptado: 6 de diciembre de 2012; Publicado: 15 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Cao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. En este artículo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (Nº 81.001.049) y el Fondo Nacional de Ciencia para jóvenes Académicos Distinguidos de China (Nº 81025011). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los estudios actuales siguen demostrando una fuerte correlación entre Tim-3 de expresión y supresión inmunológica asociada al tumor [1] - [3]. Sakuishi et al [4] encontró que Tim-3 se expresó en CD8
+ linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) en ratones portadores de tumores sólidos. Todo Tim-3
+ TIL coexpresan PD-1, y este tipo de TIL representa la fracción predominante de células T que infiltran tumores. Tim-3
+ PD-1
+ TILs exhiben el fenotipo más grave agotado como se define por la falta de proliferar y producir IL-2, TNF y IFN-γ. dirigido combinado de los Tim-3 y PD-1 vías es más eficaz en la restauración de la inmunidad antitumoral que centrarse en cualquiera de las rutas solo. Zhou et al [5] detecta el mismo fenómeno en ratones con leucemia mielógena aguda diseminada. Incluso en pacientes con melanoma, también se encuentra la regulación positiva de Tim-3 y PD-1 de expresión que se asocia con tumor específica de antígeno CD8
+ disfunción de las células T [6]. En nuestro estudio anterior, se encontró que Tim-3 se expresa preferentemente en las células endoteliales de linfoma derivado y suprimió la activación de CD4
+ linfocitos T a través de la activación de la vía de interleucina-6-STAT3. Tim-3 también facilitó la creación de linfoma tolerancia inmune [7]. Sin embargo, si Tim-3 también se expresa en las células cancerosas en otros cánceres hematológicos siguen siendo una pregunta abierta.
El cáncer cervical es un tumor que posee distintos antígenos asociados a tumores (TAA). Virus del papiloma humano (VPH) han demostrado que causa cambios progresivos en el epitelio del cuello uterino, que conduce al cáncer de cuello de útero. Mayor que 99% de las neoplasias cervicales puerto HPV (principalmente HPV-16 y HPV-18). E6 y E7 son las dos proteínas expresadas por el virus que son necesarios para la iniciación y la progresión del cáncer [8]. Varios estudios [9], [10] muestran que hay otras posibles funciones como el sistema Fas-FasL y la pérdida de HLA de clase I para el escape inmune en cáncer de cuello uterino. Debido a que muchas vías están potencialmente implicados en el cáncer cervical, nos preguntamos si Tim-3, un antígeno que se ha implicado en el desarrollo de diversos tipos de cáncer, también puede desempeñar un papel en el desarrollo de cáncer cervical. Además, nuestro estudio anterior encontró que Tim-3 se sobreexpresa en los cánceres epiteliales. Estas razones combinadas nos hicieron interesados en investigar el papel de Tim-3 en el cáncer de cuello de útero
.
Dos estudios recientes [11], [12] han identificado la expresión Tim-3 en las células madre leucémicas (LSC) en pacientes con leucemia mieloide aguda (AML). Tim-3
+ células de AML fue capaz de reconstituir la LMA y el anticuerpo anti-humano Tim-3 bloquearon AML injerto en un modelo de xenotrasplante. Aunque los anticuerpos anti-Tim-3 parecen reducir el potencial metastásico de células cancerosas, el mecanismo de acción no se entiende bien. En este estudio, hemos utilizado ADV-antisentido Tim-3 para regular a la baja Tim-3 en la línea celular HeLa cáncer de cuello uterino y luego se evaluó la capacidad de las células cancerosas para migrar e invadir.
Nuestros resultados de este estudio confirmó el nivel de expresión de ARNm y proteína de Tim-3 en líneas celulares de cáncer de cuello uterino y reveló por primera vez que Tim-3 se expresa preferentemente en las células de cáncer cervical primarios clínicos en comparación con el CIN y cervicitis crónica. Además, los pacientes con alta expresión de Tim-3 tuvieron una mayor potencial metastásico y grados avanzados de cáncer y la supervivencia general más corta que aquellos con una menor expresión Tim-3. Por lo tanto, Tim-3 puede ser potencialmente un factor pronóstico independiente para los pacientes con cáncer de cuello uterino. También se encontró que ADV-antisentido Tim-3 puede inhibir la migración y la invasión de las células HeLa. En combinación con nuestro estudio anterior, en el que se encontró que Tim-3 activa la vía de IL-6-STAT3 para suprimir la activación de las células CD4
+ linfocitos T, nuestro estudio abre la posibilidad de que Tim-3 puede promover la metástasis a través de la activación de la vía de IL-6-STAT3.
Materiales y Métodos
Los pacientes
Las muestras de tejidos de cáncer de cuello uterino 43, 22 y 20 tejidos CIN tejidos cervicitis crónica se derivaron de pacientes que se sometieron a cirugía primaria para las enfermedades del cuello uterino en el Departamento de Oncología Ginecológica del hospital Tongji (Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología, Wuhan, china) a partir de 2004-2006. Todos los tejidos de cáncer de cuello uterino seleccionados cumplen los siguientes criterios de inclusión: sin antecedentes de cualquier otro tipo de tumor maligno, sin tratamiento neoadyuvante antes de la cirugía. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el análisis de sus tejidos con fines de investigación. Este estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital de Tongji para el análisis de tejidos humanos. Los pacientes tenían edades comprendidas entre 27 a 67 años (edad media, 39 años). El examen histológico de los tejidos del cuello uterino escindidos se lleva a cabo después de hematoxilina & amp; eosina (H & amp; E) tinción de secciones embebidas en parafina. 31 pacientes de cáncer de cuello uterino invasivo fueron clasificados como grado I, IIa y sin metástasis, mientras que 12 pacientes fueron de grado IIb, III y IV con metástasis.
Seguimiento
Los datos de seguimiento Obtenido de la historia clínica osciló entre 5-60 meses después de la cirugía (mediana, 45,2 meses). la supervivencia global de cada paciente (OS) se calcula como el período comprendido entre la fecha de la cirugía hasta la fecha de la muerte.
Detección inmunohistoquímica de Tim-3 en los tejidos del cuello uterino
secciones de tejido
embebidos en parafina-estaban desparafinado en xileno y se sometió a análisis inmunohistoquímico tal como se describe anteriormente [13]. Anti-Tim-3 anticuerpo policlonal de cabra (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y anticuerpo secundario biotinilado se utilizaron en el presente estudio. Para la evaluación semicuantitativa, se aplicó un sistema de puntuación inmunoreactividad (IRS). La intensidad de la tinción fue designado como inexistente (0), débil (1), moderada (2), o fuerte (3). El porcentaje de células positivas se denomina como la puntuación de expresión. El IRS se calculó multiplicando la puntuación de expresión con la puntuación de intensidad, y puede variar de 0-3. La muestra con las puntuaciones del IRS de 0-1 puntos se consideró como expresión negativa de Tim-3, si no se designa como tinción positiva. Estos datos fueron analizados a lo largo de un continuo, y el objetivo era utilizar este método semicuantitativo para evaluar las diferencias entre los diferentes grupos experimentales. También se observó la localización subcelular de la tinción (citoplasmática y /o nuclear).
Líneas Celulares
líneas celulares de cáncer de cuello uterino utilizados en el presente estudio se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) (HeLa, SiHa). Estas dos células se cultivaron en medio DMEM con suero bovino fetal al 10%.
polimerasa transcriptasa inversa Detección de la Reacción en Cadena de Tim-3
En pocas palabras, el ARN total fue extraído a partir de dos líneas celulares de cáncer de cuello uterino . A 'cebador sentido (5'-CGGAGGTCGGTCAGAATGCCTATC-3' 5) y un cebador antisentido (5'-GGGCTCCTCCA CTTCATATACGTTC-3 '3) se utilizaron para amplificar Tim-3 transcripciones. El producto esperado para la longitud completa de Tim-3 es 749 pb. A 'cebador sentido (5'-CTCACGAAACTGGAATAAGC-3' 5) y un cebador 3 'antisentido (5'-AAGCCACACGTACTAAAGGT-3') se utilizaron para amplificar un control interno 180-bp β-actina. El ARN total extraído de PBL se utilizó como control positivo. Los cebadores utilizados para la detección de RT-PCR de Tim-3 fueron diseñados para abarcar intrones para evitar amplificaciones de falsos positivos resultantes de amplificaciones de ADN. Mientras tanto utilizamos producto total RNA sin transcripción inversa como plantillas para la PCR como control negativo para estar seguro libre de contaminación de ADN genómico.
Western Blot detección de la expresión de Tim-3 Proteína
Dos tipos de células de cáncer cervical se lisaron durante 30 min a 4 ° C en un tampón de lisis compuesta de 150 mmol /L de NaCl, 50 mmol /L Tris (pH 8,0), 5 mmol /L EDTA, 1% (v /v) NP40, 1 mmol /L de fluoruro de fenil-metilsulfonilo, 20 mg /ml de aprotinina, y 25 mg /ml de leupeptina. Cantidades iguales de extractos de proteínas (10 g) se resolvieron mediante SDS-PAGE. Después de la transferencia a un filtro de nitrocelulosa, que se bloqueó durante 1 h a temperatura ambiente con tampón que contiene 20 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,5), 500 mmol /L de NaCl, y 5% de leche sin grasa; se incubaron con Tim-3 de anticuerpos (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) durante la noche a 4 ° C; lavado; y se incubaron con una IgG anti-cabra marcado con peroxidasa de rábano picante burro anticuerpo secundario (1:5000) durante 1 h a temperatura ambiente. Por último, las transferencias fueron desarrolladas utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia (Amersham Life Science). En el experimento preliminar, encontramos NK-92 línea celular expresa predominantemente proteínas Tim-3, mientras que de THP-1 línea celular no expresaba la proteína Tim-3. La proteína total extraída de la línea celular NK-92 se utilizó como control positivo de la proteína Tim-3, mientras que la proteína total extraído de THP-1 línea celular se utilizó como control negativo.
detección inmunofluorescente de HeLa línea celular
células HeLa se recogieron con una combinación de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se lavaron en PBS, y se hicieron crecer en cubreobjetos. células entonces fueron fijadas en 95% etnol y se bloquearon con 1% de BSA durante 1 h, y después se incubaron con el anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche. El anticuerpo primario usado fueron de cabra anti-Tim-3 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) a una dilución de 1:100. Las muestras luego se lavaron en PBS durante 5 minutos 3 veces. Los portaobjetos de control negativo se incubaron sin el anticuerpo primario. Burro IgG anti-cabra conjugado con FITC diluida con 2% BSA /PBS a una dilución de 1:100 se incubó durante 2 h a temperatura ambiente, de núcleos de células se tiñó por PI a una dilución de 1:1000, comprobado por microscopio confocal.
adenovirales mutantes
se utilizó el sistema AdEasy (MP Biomedicals) en este estudio para construir un vector de adenovirus de replicación deficiente recombinante llamado ADV-antisentido Tim-3 que contenía un fragmento de Tim- inversa 3 cDNA (pb 198 a 1312). Los protocolos estándar fueron seguidos como se describe anteriormente [14]. ADV-GFP que contiene un gen de GFP bajo el control de un promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous en la región de los genes adenovirales E1 extirpados se utilizó como control en este estudio. Se infectaron células HeLa con ADV-antisentido Tim-3 o ADV-GFP a una MOI apropiada determinada por ensayo de apoptosis durante 2 h, después se cultivaron durante otras 24 h y se sometió a experimentos posteriores.
Apoptosis Ensayo
resumen, las células HeLa infectadas con diferentes títulos de mutantes de adenovirus o tratados con PBS durante 72 h. Luego, las células se fijaron con 70% de etanol durante 1 h, se lavaron en PBS y, tratadas con RNasa durante 15 minutos a 37 ° C y luego se tiñeron con 50 mg /ml de yoduro de propidio. Las células se recogieron y se sometieron a análisis FACS de la población sub-G1.
Curación de Heridas Ensayo
Las células se cultivaron hasta la confluencia en una placa de cultivo de 6 pocillos. Una herida lineal fue hecha por el rascado de la monocapa con una punta de pipeta de 10-ul estéril. Las monocapas heridos se lavaron 3 veces con medio normal y se incubaron en medio libre de suero fresco. Las fotografías fueron tomadas a las 0 h, 24 hy 48 h después de la herida por microscopía de contraste de fase.
Transwell invasión Ensayo
invasión celular se ensayó usando cámaras Transwell (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.) con filtros de poro de policarbonato 8-micras que se revistieron con Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Las células infectadas con los mutantes adenovirales durante 24 h fueron sembradas en las cámaras superiores en medio libre de suero a una densidad de 2,0 × 10
4 por pocillo, y se colocaron 500 l de medio que contenía suero bovino fetal al 10% en la parte inferior cámara como quimio-atrayente. Después de 48 h a 37 ° C en 5% de CO2, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con una solución de 0,1% de cristal violeta. Las células en la superficie superior del filtro se retiraron con bastoncillos de algodón. células invadidas en la parte inferior del filtro se fotografiaron y se contaron mediante microscopía de contraste de fase (x 200 aumentos). Los experimentos se realizaron por triplicado.
Análisis estadístico
El programa de software estadístico SPSS fue utilizado para la prueba de correlaciones entre las variables cuantitativas mediante el establecimiento de regresión lineal no paramétrico. Los datos se presentan como media ± SD de al menos tres experimentos y se analizaron mediante análisis unidireccional de varianza seguido por la prueba de Student-Newman-Keuls. El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar la tasa de supervivencia global como una función del tiempo. Se analizaron las diferencias de supervivencia mediante la prueba de log-rank. El modelo de riesgo proporcional de Cox se utilizó en el análisis univariante y multivariante de los factores pronósticos. Todos los valores de p fueron de dos caras, y
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo. el software SPSS (versión 11.5) fue utilizado para todos los procedimientos estadísticos.
Resultados
Tim-3 se expresa preferentemente en el tejido del cáncer de cuello
Se analizaron secciones de tejido tumoral de 43 los pacientes que fueron operados de cáncer de cuello uterino, de 22 pacientes con CIN y de 20 pacientes con cervicitis crónica. La tinción positiva para la proteína Tim-3 se observó en sólo el 15,0% (3 de 20) de la cervicitis crónica, pero el 50,0% (11 de 22) de la NIC y el 65,1% (28 de 43) de cáncer de cuello uterino teñidas positivamente para proteína Tim-3 (Fig. 1A-D). Cuando la expresión de la proteína Tim-3 se comparó además por inmunoreactividad semicuantitativa H-puntuación, cáncer de cuello uterino y CIN mostrado una mucho más alta puntuación de Tim-3 que el tejido cervicitis crónica. (0.905 ± 0.584, 0.558 ± 0.123 vs 0.102 ± 0.075;
P
& lt; 0,01). (Tabla 1)
(A) cervical carcinoma escamoso, (B) adenocarcinoma cervical, (C ) neoplasia intraepitelial cervical, y (D) el tejido cervicitis crónica. aumento original × 200.
Tim-3 Expresión correlacionado con los parámetros clínico-patológico
Se correlacionaron los Tim-3 los datos de expresión a características clínico, tales como la edad, el tipo histológico, clínica grado, el grado histológico, la metástasis y la supervivencia global. Se encontró alta inmunorreactividad de Tim-3 que se correlaciona significativamente con el grado clínico (
p = 0,018
), el grado histológico (
p = 0,038
) y metástasis (
p
= 0,004). No se encontraron correlaciones significativas con la edad (
p = 0,178
) y el tipo histológico (
p = 0,773
) (Tabla 2).
Al final de nuestro periodo de seguimiento, 15 pacientes murieron en el grupo 3-Tim positivo, mientras que 3 de Tim-3 grupo de negativo, la tasa de supervivencia a los 5 años fue del 46,4%
vs
80%, respectivamente (
P
= 0,006) (Fig. 2).
Una comparación de cinco años curva de supervivencia acumulada de pacientes con cáncer de cuello uterino entre Tim-3 expresión positiva (línea discontinua) y Tim-3 expresión negativa (línea gruesa) se muestra.
Tim-3 se expresa en líneas celulares de cáncer de cuello uterino
RT-PCR y Western blot se utilizaron para detectar los niveles de Tim 3-ARNm y proteínas en dos cervical humano líneas celulares de cáncer HeLa y SiHa. Como era de esperar, se encontró que un producto 749-bp que estar presente en estas dos líneas celulares, lo que confirma la presencia de la expresión de ARNm Tim-3. oligonucleótidos ß-actina se utilizaron para detectar una banda de ARN de 180 pares de bases y se utilizó como control (Fig. 3A). Una banda de 33 kD se encontró que confirma la expresión de proteínas Tim-3 (Fig. 3B). La microscopía confocal se utilizó para probar la localización subcelular de Tim-3. Tim-3 se distribuye en todo el citoplasma (fluorescencia verde) de la línea de células Hela, sin la distribución en el núcleo (rojo) (Fig. 3C).
se detectaron (A) Tim-3 transcripciones en líneas de células HeLa y SiHa. Las plantillas de los diferentes carriles de la siguiente manera: Carril 1, ARN total de PBL; Carril 2, el ADNc de PBL; carril 3, ARN total de SiHa; carril 4, cDNA de SiHa; carril 5, el ARN total de Hela; carril 6, el ADNc de Hela. (B) proteína Tim-3 se determinó por transferencia de Western en las líneas celulares HeLa y SiHa. las células (C) Hela tiñeron con inmunofluorescencia con anticuerpos anti-Tim-3 y se observaron con un microscopio de escaneo láser confocal. proteína Tim-3 (verde, puntas de flecha) se encuentra en el citoplasma de Hela. Los núcleos celulares (rojo) se visualizaron por tinción con PI.
La represión de Tim-3 inhibe la expresión de migración e invasión de células Hela
Para comprender mejor la correlación de Tim-3 y el tumor metástasis, se infectaron células HeLa con ADV-antisentido Tim-3. En una multiplicidad de infección (MOI) de 1, ADV-antisentido Tim-3 células HeLa infectadas mostraron disminuyó significativamente Tim-3 de expresión con una respuesta de muerte celular menor; Por lo tanto, se utilizó esta concentración en los siguientes experimentos (Fig. 4A-B). Dado que la migración de células de cáncer y la invasión están directamente relacionados con la metástasis, se realizaron un ensayo de cicatrización de la herida y un ensayo de invasión de células para determinar si la represión de Tim-3 inhibe la expresión de la migración de células Hela y la invasión. células Hela infectadas o bien con ADV-antisentido Tim-3 o con ADV-GFP como se evaluó un control durante 24 h y 48 h. Como se muestra en la Figura 5A-B, a las 24 h y 48 h, respectivamente, ADV-antisentido Tim-3 células infectadas mostraron 40% y el cierre de la herida 70%, mientras que las células infectadas ADV-GFP mostraron 60% y 100%, lo que sugiere que la inhibición de Tim-3 expresión disminuyó la migración de las células HeLa. Como se muestra en la Figura 5C-D, el número de células Hela que pasa a través del filtro en el ADV-antisentido Tim-3 grupo (151 ± 33) fue notablemente menor que en el grupo ADV-GFP (545 ± 48), que muestra que la inhibición de Tim-3 expresión suprime la invasión de células Hela in vitro.
(a) transferencia de Western se realizó para detectar Tim-3 expresión en células HeLa infectadas con ADV-GFP y antisentido ADV- Tim-3 o tratados con PBS. (B) resultado típico de apoptosis de las células determinada por citometría de flujo en células HeLa infectadas con ADV-antisentido Tim-3 y ADV-GFP o tratados con PBS. Los datos se representan como la media ± DE de triplicados.
(A) capacidad de migración celular se determinó con un ensayo de cicatrización de heridas. Las fotografías fueron tomadas inmediatamente (0 h), a las 24 hy 48 h después de la herida. (B) Cuantificación de cierre de la herida. Los datos presentan la distancia media de la migración celular a la zona de la herida a las 24 y las 48 horas después de la herida en tres sitios de la herida independientes por grupo. (C) La capacidad de las células para invadir Matrigel se analizó por el ensayo transwell invasión a través de una matriz de gel. Las células HeLa se sea infectado con ADV-GFP o con ADV-antisentido Tim-3, Después de 10 h se fijaron y se contaron las células viables invasivos. Los valores y las barras de error que aparecen en este gráfico representan los promedios y las desviaciones estándar, respectivamente, de tres experimentos independientes. (D) Imágenes representativas de la transwell ensayo de invasión.
Discusión
En nuestro trabajo anterior, se encontró que Tim-3 se expresa preferentemente en las células endoteliales de linfoma derivados (EC) , y que el nivel de Tim-3 en B endotelio linfoma de células se correlaciona estrechamente tanto a la difusión y el mal pronóstico. Tim-3
+ ECs modula la respuesta de células T a los antígenos de linfoma de sustitución mediante la supresión de la activación de CD4
+ linfocitos T a través de la activación de la vía de interleucina-6-STAT3, la inhibición de la polarización Th1, proporcionando inmunidad protectora, y facilitar la establecimiento de linfoma tolerancia inmune. Aunque los estudios sugieren que Tim-3 está implicada en la regulación inmune de los tumores, su expresión directa en la célula tumoral y su función en la metástasis tumoral eran todavía desconocidos.
En el presente estudio, se encontró que Tim-3 se expresa preferentemente en los tejidos de cáncer cervical, y su expresión se correlacionó significativamente con los grados de cáncer avanzado (
p = 0,018
), los grados histológicos (
p = 0,038
), metástasis (
p
= 0,004) y la supervivencia más corta (
p
= 0,006). La presencia de Tim 3-mRNA y proteína en dos líneas celulares de cáncer de cuello uterino (HeLa y Siha), además de la localización de Tim-3 en el citoplasma de la célula Hela confirmaron que Tim-3 fue de hecho expresado en la célula de cáncer cervical. Para aclarar la relación entre Tim-3 y la metástasis del tumor, se utilizó ADV-antisentido Tim-3 para hacer un ensayo de cicatrización de la herida y transwell ensayo de invasión. Se encontró que el ADV-antisentido Tim-3 células infectadas mostraron 40% y el cierre de la herida 70% a las 24 h y 48 h, respectivamente, en comparación con las células 60% y 100% visto en ADV-GFP infectadas. Además, notablemente menos células Hela pasado por el filtro en el ADV-antisentido Tim-3 grupo (151 ± 33) que en el grupo ADV-GFP (545 ± 48). Estos resultados sugieren fuertemente que la regulación negativa de la expresión de Tim-3 disminuye la migración y la invasión de las células HeLa de manera significativa.
De acuerdo con nuestro estudio, Wiener et al [15] también encontró que se expresó Tim-3 no sólo en los mastocitos en los alrededores de melanomas, sino también en las células tumorales en secciones de tejido y líneas celulares de melanoma humano WM35 y HT168-M1. Mientras tanto, Kikushige y Jan [11], [12] identificaron Tim-3 de expresión en las células madre de la leucemia (LSC) en pacientes con leucemia mieloide aguda. Para determinar si Tim-3 se expresa universalmente en las células tumorales, se requieren estudios adicionales sobre otras células cancerosas.
A pesar de los progresos realizados en la comprensión de la participación de Tim-3 en la inmunidad tumoral, el vínculo entre Tim-3 expresión y tumor propia célula aún no ha sido definida. Uno de nuestros hallazgos más sorprendentes es que cuando se utilizó ADV-antisentido Tim-3 regular a la baja la expresión de Tim-3 en células HeLa, tanto la migración y la invasión de las células HeLa se inhibe de manera significativa. De hecho, la expresión de alto puntaje de Tim-3 se correlacionó significativamente con la metástasis (
p
= 0,004) en pacientes con cáncer de cuello uterino. El siguiente paso sería determinar cómo Tim-3 de expresión se correlaciona con metástasis tumoral y las vías que están involucrados? En nuestro trabajo anterior, hemos verificado que Tim-3 puede activar la vía de IL-6-STAT3. Tim-3 expresión aumentó la producción derivada de EC de IL-6 por casi 10 veces, y la adición de IL-6 aumentó significativamente el nivel de STAT3 fosforilados (p-STAT3). De acuerdo con los estudios publicados [16] - [19], la vía de IL-6-STAT3 desempeña un papel importante en la metástasis tumoral. STAT3 puede promover la formación de nicho premetastatic y células metastásicas pueden escapar a los efectos pro-apoptóticos de TNF-α mediante el aumento de la señalización de IL-6-STAT3 autocrina. Además, la inhibición de p-STAT3 mejora la eficacia IFN-α contra el melanoma metastásico en un modelo murino. Sobre la base de estos hallazgos anteriores y nuestros resultados de este estudio, la hipótesis de que Tim-3 podría facilitar la metástasis del tumor a través de la vía de IL-6-STAT3. Debido a que la metástasis a distancia es un factor importante en la supervivencia de los individuos con cáncer de cuello de útero, Tim-3 puede ser un marcador pronóstico importante para el cáncer de cuello uterino.
En conjunto, nuestro estudio sugiere que Tim-3 regula negativamente no sólo contra el tumor inmunidad, pero también influye en el desarrollo del cáncer directamente a través de su expresión en las células cancerosas. Por primera vez, hemos asociado la expresión de Tim-3 en las células tumorales con peores parámetros patológicos clínicos en cáncer de cuello uterino. Además, se encontró que la inhibición de la expresión de la proteína Tim-3 puede prevenir la metástasis del tumor. Por lo tanto, es racional para futuros experimentos para explorar Tim-3 como un objetivo para la terapia anti-cáncer, inmunoterapia tumoral, y en el control de enfermedades metastásicas.