Extracto

Antecedentes

La identificación de marcadores de pronóstico adicionales para mejorar la estratificación del riesgo y para evitar un tratamiento excesivo es una de las necesidades más urgentes clínicos en cáncer de próstata (CaP). Los microARN, siendo importantes reguladores de la expresión génica, son prometedores biomarcadores en diversas entidades de cáncer, aunque el impacto como predictores de pronóstico en el CaP es poco conocida. El objetivo de este estudio fue identificar miRNAs específicos como posibles marcadores de pronóstico en el CaP de alto riesgo y para validar su impacto clínico.

Metodología y Principales conclusiones

Se realizó el análisis de microarrays miARN en una de alto riesgo CaP grupo de estudio seleccionados por su resultado clínico (supervivencia libre de progresión clínica (CPFS) vs fracaso clínico (CF)). Se identificaron siete candidato miRNAs (
let-7a /b /c, miR-515-3p /5p, -181b, -146b
, y
-361
) mostró que la expresión diferencial entre ambos grupos. Un análisis más detallado QRT-PCR reveló la baja regulación de los miembros de la
let-7
familia en la mayor parte de una cohorte grande, bien caracterizado CaP de alto riesgo (n = 98). La expresión de
let-7a
/
b
/y
-c
se correlacionó con los parámetros de resultados clínicos de este grupo. Mientras que
let-7a
mostraron ninguna asociación o correlación con los datos clínicos relevantes,
let-7b
y
let-7c
se asocia con FQ en pacientes con CaP y funcionó en parte como marcador pronóstico independiente. La validación de los datos mediante un estudio de cohorte de alto riesgo independiente reveló que
let-7b, España, pero no
let-7c, España tiene un impacto como un marcador pronóstico independiente de BCR y CF. Por otra parte, se identificaron
HMGA1
, una proteína no histona, como un nuevo objetivo de
let-7b
y se encontró correlación de
let-7b
baja regulación con HMGA1 sobre-expresión en muestras de CaP primarias.

Conclusión

Nuestros hallazgos definen un perfil de expresión de los genes miARN distinta en los casos de CaP con principios CF e identificaron
let-7b
como biomarcador pronóstico en CaP de alto riesgo. Este estudio pone de relieve la importancia de
let-7b
como supresor de tumores de miARN en el CaP de alto riesgo y presenta una base para mejorar la terapia individual para los pacientes con CaP de alto riesgo

Visto:. Schubert M, Spahn M, Kneitz S, Scholz CJ, Joniau S, Stroebel P, et al. (2013) Distinto microARN perfil de expresión en cáncer de próstata pacientes con insuficiencia clínica temprana y el impacto de
let-7
como pronóstico del marcador en alto riesgo de cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (6): e65064. doi: 10.1371 /journal.pone.0065064

Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 17 de diciembre de 2012; Aceptado: April 20, 2013; Publicado: 14 Junio ​​2013

Derechos de Autor © 2013 Schubert et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta publicación fue financiado por la Fundación alemana de Investigación (DFG) y la Universidad de Würzburg en el programa de financiación de Publicaciones de Acceso Abierto, una subvención Ferdinand Eisenberger de la Deutsche Gesellschaft für Urologie (Sociedad alemana de Urología), otorgar ID SCM1 /FE-11; y IZKF (Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica), Universidad de Würzburg, conceder Identificación Z-3/14. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de próstata (CaP) es la neoplasia maligna más común entre los hombres en Europa, con una incidencia estimada de 345.900 en 2006 [1]. El curso natural de la enfermedad es heterogénea, variando de indolentes para el cáncer muy agresivo que hace metástasis en una etapa temprana causando dolor y la muerte prematura. estratificaciones de riesgo actuales como bajo /intermedio /y CaP de alto riesgo por sí solos son insuficientes para predecir el resultado clínico. Incluso los hombres con CaP de alto riesgo (PSA & gt; 20 ng /ml y /o biopsia puntuación de Gleason ≥8 y /o etapa clínica ≥ T3) representan un grupo heterogéneo de pacientes. Aunque caracterizada como un grupo que tiene más pobre resultado clínico en todos los grupos de riesgo, sólo hasta 30% desarrollan metástasis y mueren debido a su enfermedad [2] - [4]. Por lo tanto, los nuevos biomarcadores de pronóstico se necesitan con urgencia para mejor a los grupos de riesgo sub-estratificar, identificar la enfermedad letal, con el tiempo evitar un tratamiento excesivo, y mejorar la terapia individual. La identificación de marcadores de pronóstico, especialmente para la enfermedad letal, apenas es posible en un colectivo de PCa sin seleccionar. A pesar de que las cohortes de alto riesgo CaP muestran ahora mucho mejor que los resultados esperados, no dejan de representar un grupo ideal para identificar factores relacionados específicamente con la enfermedad letal
.
Hay una creciente evidencia de que los microRNA (miRNA) son candidatos adecuados para la desarrollo de tales biomarcadores. MiRNAs son pequeñas hebras de ARN no codificantes que regulan la expresión de los genes en el post-transcripcional y el nivel de traducción. miRs individuales se han caracterizado bien como supresores de tumores u oncogenes (oncomiRs) [5].

Varios informes describen el CP-específicos firmas de expresión de los genes miARN, sin embargo, el tipo de miRNAs regulados es diversa. existe un acuerdo entre estos estudios en los que la mayoría de los miRNAs están regulados hacia abajo en las muestras de CaP [6] - [10]. Aunque una correlación con estadio y grado tumoral fue descrita por varios miRs su relevancia como marcadores de pronóstico para predecir los puntos finales clínicos con fuerza, como el fracaso clínico o la muerte relacionada con el cáncer, sigue siendo limitada [8], [11] - [14]. Sin embargo, hay enfoques prometedores para detectar la coherencia entre la expresión alterada de miRNAs específicos y la progresión de la enfermedad. Larne y sus colaboradores identificaron recientemente un modelo de marcadores múltiples basados ​​en miARN como herramienta de pronóstico de la progresión del CaP [15]. Nuestro grupo de trabajo está descrita anteriormente
miR-221
para ser un marcador pronóstico de recurrencia de la enfermedad en el CaP de alto riesgo [16].

Algunos de los MIR más frecuentemente mencionadas que muestran baja regulación en CaP son miembros de la
let-7
familia [6], [9], [17], [18]. Esta familia está compuesta por varios miembros, cuya diversidad es distinto por isoformas (
let- página 7
a-g, -i, miR-98
). La expresión de algunos
let-7 Buscar miembros ha demostrado ser reguladas por otras entidades en varias cáncer, así, como el de mama, de ovario y cáncer de pulmón [19] - [21]. Conocidos los objetivos pertinentes de
let-7 ¿Cuáles son los oncogenes como
Ras
,
cmyc
,
EZH2
y
HMGA2
[17] , [22] - [24], lo que indica una función supresora de tumores de
let-7 fotos: por la regulación de los oncogenes implicados específicamente en el crecimiento y la capacidad de auto-renovación de células de CaP. Más recientemente se ha demostrado que las células madre CaP se caracterizan por la baja regulación de
let-7 Buscar miembros de la familia y que
let-7
es críticamente involucradas en la tumorigenicidad mediante el control de la señalización del receptor de andrógenos, la proliferación y la diferenciación [25] - [27]. Sin embargo, un papel de
let-7 Buscar miembros de la familia como marcadores de pronóstico en el CP no se ha descrito hasta ahora.

El objetivo de este estudio fue identificar miRNAs expresados ​​diferencialmente en alto riesgo PCA con diverso resultado clínico. Se detectó un patrón que consta de 7 miRNAs asociados con la recurrencia clínica temprana e identificado
let-7 Buscar miembros de la familia a ser progresivamente las reguladas en los tumores agresivos. En un gran CaP de alto riesgo cohorte que confirmó estos resultados y demostró que la baja regulación de
let- página 7
b
se correlaciona con la recurrencia bioquímica y fracaso clínico. Por otra parte, se confirmó
let-7b
como marcador pronóstico independiente en el cáncer de alto riesgo en una cohorte de validación independiente. Además hemos demostrado que la expresión de
HMGA1
, una proteína no histona, está regulada por
let-7b fotos: por la unión a la 5'UTR del
HMGA1
. Nuestros resultados demuestran que el CaP de alto riesgo se caracteriza por un perfil específico y que miARN individuales
let-7 Buscar miembros de la familia son prometedores marcadores de pronóstico en este grupo de pacientes.

Materiales y Métodos

cohortes de pacientes

Se trabajó con tres diversos colectivos CaP para nuestro análisis:

una cohorte consta de 98 fijados con formol y embebidos en parafina (FFPE) muestra de tejido de un grupo bien caracterizado de pacientes con CaP de alto riesgo [16]. Ver tabla 1 para los datos clínico-patológica. Las muestras de tejido y los datos clínicos se utilizaron para el análisis de microarrays y QRT-PCR en microARN, así como estudios de correlación y asociación posteriores.

Cohorte B consta de 92 muestras FFPE de RP. muestra de tejido y los datos clínico-patológico se obtuvieron del Departamento de Urología del Hospital Universitario de Lovaina, Bélgica (Tabla 1). Este grupo sirvió como colectivo de validación para confirmar el papel de
let-7b
como marcador pronóstico.

La estadificación preoperatoria en la cohorte A y B incluía tacto rectal, una tomografía abdominopélvica-computarizada (TC) y una gammagrafía ósea. Neoadyuvante tratamiento hormonal, radiación o quimioterapia fue un criterio de exclusión. Metástasis en los ganglios linfáticos y las muestras de próstata (secciones de todo el montaje, intervalos de 4 mm) se organizaron y se clasificaron según la clasificación TNM 2002 y el sistema de clasificación de Gleason como se describe anteriormente [16]. El seguimiento se realiza cada 3 meses durante los primeros 2 años después de la cirugía, cada 6 meses en los siguientes 3 años, y posteriormente cada año. recaída bioquímica (BCR) se definió como PSA ≥0.2 ng /ml en 2 visitas de seguimiento consecutivas. El fracaso clínico fue declarado cuando las metástasis distantes ya sea locales o fueron histológicamente probada o confirmada por tomografía computarizada o hueso. La supervivencia global (OS) se definió como el tiempo desde la peste bovina a muerte atribuida a CaP o complicaciones de la enfermedad.

La hiperplasia prostática benigna muestras (HPB) se derivaron de la pieza de adenomectomía de próstata. Las muestras fueron embebidos en parafina, así; regiones con & gt; 80% se utilizaron tejidos adenoides. Todos los pacientes tuvieron niveles normales de PSA antes de la cirugía y el carcinoma fue excluido por histopatología.

C cohorte consta de 21 muestras de cáncer obtenidos del Departamento de Urología de la Clínica Universitaria de Würzburg, Alemania. Los pares de tejido fresco congelado CaP y tejido benigno adyacente, se utilizaron para mRNA y los genes miARN aislamiento. Este grupo contiene los pacientes con muestras no seleccionadas histopatológicos PCA (alto, intermedio y bajo riesgo de cáncer). Ya que el aislamiento del ARNm de la muestra de tejido fresco congelado es más eficaz en comparación con el aislamiento en muestras FFPE trabajamos con esta cohorte de estudios de correlación en la expresión de
HMGA1
y
let-7b
. Para este análisis de datos clínico-patológica eran irrelevantes y por lo tanto no se muestra. La evaluación histológica fue realizada por un patólogo Senior (P. S.). muestras cancerosas que contienen al menos 80% de células malignas se utilizaron para análisis adicionales. Se seleccionaron áreas con al menos 80% conductos y no hay células cancerosas de tejido benigno adyacente.

Los estudios fueron aprobados por el comité de ética local de la Facultad de Medicina de la Universidad de Würzburg, Alemania (n. 59/04 ) y la Universidad Católica de Lovaina, Bélgica (UZL Estudio número S54424; número Estudio belga B322201214832); todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito.

Análisis de microarrays

Para detectar el candidato MIR, que se correlaciona con un mal resultado 6 tejidos de BPH y 13 muestras de CaP de alto riesgo se hibridó con microarrays (cohorte A) . especímenes CaP de alto riesgo fueron subdivididos en dos grupos (grupo 1: CPFS (n = 7); grupo 2:. CF (n = 6) (véase la Tabla 2 para más detalles) Un conjunto de 668 MIR (sonda conjunto 1564V2 mirVana Aplicadas Biosysems ) fue descubierto en Nexterion ™ hisense e microarrays diapositivas por cuadruplicado. se utilizó el FFPE RNA total Kit Enlace Pure-Aislamiento y el módulo de Concentración RiboMinus (Invitrogen) para la purificación de ARN. Slide procesamiento se realizó de acuerdo con el de Applied Biosystems
MIR
Vana ™ manuales. El microarray de datos está disponible bajo el número de GEO GSE18671.

La extracción de RNA y transcripción reversa

extracción de ARN total a partir de muestras incluidas en parafina o tejido congelado y PCA líneas celulares se realizaron utilizando el kit de aislamiento de recuperar todos total de ácido nucleico y el ARN total Extraction Kit, respectivamente (Ambion y miRNeasy Mini Kit, Qiagen). cDNA específico se sintetizó a partir de ARN total con cebadores de transcripción inversa tallo-bucle de acuerdo con la TaqMan® de miR protocolo de ensayo (PE Applied Biosystems). la síntesis de ADNc se realizó con inespecífica Sistema ImProm-II ™ transcripción inversa (Promega) de acuerdo con el protocolo absoluta QPCR SYBR Green (Thermo Scientific).

QRT-PCR

La confirmación de los resultados de microarrays en muestras independientes y en un aumento del tamaño de la muestra se realizó mediante qRT-PCR. M (i) la expresión del ARN en muestras de tejidos y líneas celulares se cuantificó con cualquiera TaqMan® (MIR) o kits de ensayo SYBR Green (ARNm) y la OPTICON BioRad 2, siguiendo las instrucciones del fabricante (BioRad). Los cebadores para la
let-7a-d, miR-16, -29a, -221, -146b, España y
-181b
se obtuvieron de Applied Biosystems; ARN nuclear pequeño
RNU6B
se aplicó para la normalización.
β-actina
sirvieron como ama de llaves de
HMGA1
expresión (Applied Biosystems). Relativa m (i) ARN-expresión se calculó con la comparativa? C
t-método (? C
t muestra = C
t muestra - C
t
RNU6B
). El método 2
-ΔΔCt se utilizó para evaluar los cambios veces en m (i) R-expresión entre las muestras y controles. La media de C
t se determinó a partir de experimentos de PCR por triplicado. La desviación estándar fue ≤0.4, los valores de P & lt; 0,05 se consideró significativo

Cultivo de células y transfección transitoria

LNCaP y células PC-3 se obtuvieron de ATCC, Alemania utilizando pasajes 5-35.. Las células se cultivaron a 37 ° C en una incubadora humidificada a 5% de CO
2. Las células se sembraron y simultáneamente transfectadas en placas de 6 pocillos a una densidad de 3,5 × 10
5 por pocillo usando medio RPMI 1640 Gibco sin PHENOLRED, que contiene 10% de suero de ternera fetal (Invitrogen), Glutamax (Invitrogen), NEAA (Gibco ), solución tampón HEPES (PAA), y la solución de piruvato de sodio (PAA). La transfección transitoria se realizó usando el reactivo Lipofectamine ™ (Invitrogen) y Opti-MEM® (Invitrogen-Gibco) siguiendo las instrucciones del proveedor. Precursor- respectivamente antigo
let-7b
se aplicó para inducir o suprimir
let-7b
expresión, pre-y anti-negativo
let-7b gratis (Applied Biosystems) fueron utilizado para la transfección control. Las células se recogieron 48 h después de la transfección.

Western Blot

Las células fueron lisadas en Cytobuster o Phosphosafe (Novagene) después de la preparación y la determinación de cantidades iguales de proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y posteriormente transferidos a membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad). Para la expresión de proteínas de
HMGA1
se utilizó 1 mg ml /cabra anticuerpos policlonales (
HMGA1a /1b
, Abcam);
β-actina gratis (Abcam) sirvió como ama de llaves. Para la visualización se utilizó rábano picante anticuerpos peroxidasa acoplada secundarios (Abcam y Dako) y el kit ECL Plus (GE Healthcare). Para la cuantificación de la intensidad de la banda se utilizó la imagen J (http://imagej.nih.gov/ij/).

ensayo de luciferasa

El 3'UTR del ser humano
HMGA1
gen se amplificó por PCR usando los siguientes cebadores que contenían Hind III adicional o sitios Spe I: HMGA1Hindfor: 5'-GATC AAGCTTCATATTGTGGTGATGGAG-3 '; HMGA1SpeIrev: 5'-CAAT ACTAGT GAACATTTGGCGCTGGTAG-3 '. El resultado
HMGA1
fragmento de PCR que contiene los dos más aguas abajo situada
let-7b
sitios complementarios a
HMGA1
fue clonado aguas abajo de la luciferasa de Renilla parada codón en un plásmido indicador de luciferasa (pMIR- INFORME-luciferasa, apllied Biosystems) usando los sitios Hind III y Spe I. Para llevar a cabo ensayos de luciferasa células LNCaP fueron sembradas en placas de 6 pocillos a una densidad de 3,5 × 10
5 por pocillo y se incubaron durante 24 horas. El vector reportero fue co-transfectadas en células LNCaP con un control no director de oligonucleótidos de ARN o
let-7
precursor de miARN. La transfección transitoria se realizó usando el reactivo Lipofectamine ™ (Invitrogen). 48 horas después de la transfección de la actividad de la luciferasa se analizó por Reporter sistema de ensayo de doble Luciferase® (Promega). Se utilizó la actividad de Renilla para la normalización y como control de transfección eficiencia

Análisis Estadístico y Bioinformática

Microarray-Análisis:. Spot intensidades de diapositivas escaneadas se cuantificaron utilizando software ScanAlyze (http: //rana .lbl.gov /EisenSoftware.htm). Los datos fueron analizados con diferentes paquetes de I del proyecto Bioconductor (www.bioconductor.org). Resultantes intensidades de señal se normalizaron por la estabilización de la varianza [28]. Genes expresados ​​diferencialmente fueron seleccionados a partir de los datos de microarrays por limma (modelos lineales para el análisis de microarrays) paquete [29]

QRT-PCR-Análisis:. Las muestras se compararon con una muestra de dos t-test de Welch. Antes de avanzar en el análisis de un colectivo, se crearon las puntuaciones z de los valores relativos de expresión. Posteriormente, el punto de corte óptimo para
let-7
expresión fue determinada por el receptor de funcionamiento (ROC) análisis de la curva característica (R-paquete 'proc'). Según el umbral resultante se clasificó según los valores de expresión. Las asociaciones entre la expresión y la recurrencia clínica se determinó mediante regresión de Cox con los modelos uni y multivariados. El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar la función de supervivencia en diversos puntos temporales. las proporciones de riesgo univariante y multivariante y sus intervalos de confianza del 95% (IC) se calcularon usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox ( "supervivencia" Bioconductor paquete). los valores & lt; P 0,05 se consideraron significativos. Para probar, si este enfoque es aplicable a un conjunto de datos de pruebas independiente, las puntuaciones z se crearon para B. colectiva Sin embargo, para la dicotomización se utilizó el umbral derivada de A colectiva. Todos los pasos posteriores se realizaron como se ha descrito para A. Por colectiva correlación entre
HMGA1 Restaurant and let-7b
de correlación de Pearson se calculó
.

Resultados

Cáncer específica Etapa miARN expresión en alto riesgo CaP

se realizó el análisis de microarrays de genes miARN aislados de seis HPB incluido en parafina y 13 muestras para la detección de CaP candidato miRNAs están asociados con el desarrollo o la progresión de la enfermedad de alto riesgo. Los casos de CaP analizadas fueron parte de un colectivo de alto riesgo bien caracterizado (cohorte A) (Tabla 1) y se seleccionaron en función de su evolución clínica. Los casos preseleccionados CaP fueron separados en dos grupos por fracaso clínico y el seguimiento sin recurrencia de la enfermedad (grupo 1: CPFS vs. grupo 2: CF). La Tabla 2 muestra las características del cáncer de ambos grupos.

El objetivo de este análisis fue para la detección de una firma específica miARN de pacientes con cáncer de alto riesgo con la recurrencia de la enfermedad. Inicialmente se compararon los genes miARN expresión en los 13 casos de CaP de alto riesgo, junto a la de la enfermedad benigna. De todos los miRNAs expresados ​​diferencialmente (expresión veces el cambio & gt; 1,5 y el valor p & lt; 0,05) la mayoría de los 61 MIR se redujeron regulado y 21 MIR fueron hasta reguladas en la enfermedad de alto riesgo. Véase la Tabla S1 para el listado de todos los miRNAs arriba y hacia abajo regulados. La agrupación jerárquica, en base a los 82 miRNAs expresados ​​diferencialmente seleccionados, genera un árbol con clara distinción entre la enfermedad maligna y la hiperplasia benigna (Fig. 1A). A pesar de que la comparación se realizó sólo entre la benigna y la enfermedad maligna, un sub-grupo de los tumores en función de su evolución clínica fue evidente.

A. Microarrays de perfiles de HPB 6 y 13 muestras de tejido CaP de alto riesgo (cohorte A). Estos últimos se subdividen por resultado clínico: Grupo 1: CaP de alto riesgo + CPFS (n = 7); grupo 2: CaP de alto riesgo + CF (n = 6). De modo de fila reducido heatplot de genes que muestran un factor de cambio & gt; 1,5 y un valor de p & lt ajustado; 0,05. Roja que indica una alta expresión, expresión baja verde. tejidos de la próstata cancerosas y no cancerosas están claramente separadas. La agrupación indica una distinción entre el grupo 1 y 2. B. validación técnica de los microarrays de datos por QRT-PCR. expresión relativa de
miR-16
,
-29a
, y
-221
se analizó en 6 HPB (blanco) y 13 muestras de CaP de alto riesgo (gris). miARN expresión se muestra como medio de expresión y la HPB CaP de alto riesgo con barras de error para la desviación estándar. * Indica p. & Lt; 0,01, valores de p se calcularon utilizando la 2 muestra la prueba t de Welch

Para realizar una validación técnica de los resultados de la matriz se analizó la expresión de tres de los miRNAs expresados ​​diferencialmente más, entre otros. Como se muestra en la Figura 1B y 2B podríamos confirmar la significativa baja regulación de
let-7a /b /c, miR-16
,
-29a
,
-146, - 181
y
-221
antes visto en la matriz de datos de QRT-PCR.

a. diagrama de Venn que muestra las relaciones entre miRs humanos que se expresó significativamente diferente (± 1,5 veces) en el grupo de PCa 1 vs. grupo CaP 2 vs. BPH (adj p & lt; 0,05). Círculos incluyen números de miRs humanos altura o hacia abajo-regulados de cada comparación por pares. miRs comunes entre diferentes comparaciones se muestran en las intersecciones. Los recuadros grises indican el estado de expresión de los
7 let-
miembros de la familia. La siguiente tabla contiene todas miRs humanos en los que la expresión fue significativamente diferente ya sea: entre (Gr.1 vs. gr.2), (gr.2 vs. HPB) y (Gr.1 vs. HPB) (columna roja); entre (. gr gr 1 vs 2.) y (2 gr frente a la HBP.) (columna verde); o entre (gr. 1 vs. gr 2) y (gr. 1 vs. HPB) (azul columna). Todos los miRNAs se clasifican en base a la máxima expresión del cambio veces. Las dos columnas a un lado la lista de miRNAs indican una regulación hacia abajo arriba o en la expresión (ver las flechas) y la dimensión de los cambios de expresión de plegado. B. La validación de los datos de microarrays de QRT-PCR. expresión relativa de
miR-146b
,
-181b
, y
let-7a
/
b
/y
-c
se analizó en 6 HPB (blanco), 7 muestras de CaP de alto riesgo con CPFS (grupo 1) (gris claro), y 6 muestras de CaP de alto riesgo con FQ (grupo 2) (gris oscuro). miARN expresión se muestra como medios de expresión de la HPB y el tejido de alto riesgo, respectivamente, con barras de error para la desviación estándar. * Indica p. & Lt; 0,01, los valores de p se calcularon utilizando la 2 muestra la prueba t de Welch

MIR perfil de expresión de CaP de alto riesgo con diversas Clínica supervivencia libre de progresión

Based en la separación de los dos grupos de riesgo por análisis de conglomerados que la hipótesis de encontrar un perfil de miARN en los casos de CaP con enfermedad progresiva. Por lo tanto, se analizaron los datos de microarrays con respecto a MIR que se expresa de forma diferente en ambos grupos de alto riesgo (doble cambio & gt; 1,5 y el valor de P & lt; 0,05). El diagrama de Venn en la figura 2A y la figura S1 a visualizar el trazado de todos los MIR humanos que son expresados ​​diferencialmente en tejido de BPH, en alto riesgo de tejidos con CaP CPFS, y en el tejido de alto riesgo con FQ En total, 148 MIR se expresaron diversa dentro de los tres tipos de tejidos. La expresión de siete miRNAs (es decir,
let-7a /c, miR-515-3p /5p, -181b, -146b
, y
-361
) resultaron ser significativamente diferente entre los tres grupos analizados (HPB, el grupo 1 y 2) que indica un perfil miARN específico para CaP de alto riesgo con enfermedad progresiva. 47 miRNAs mostraron una expresión diferente en el grupo 1 frente a grupo 2; entre las diez primeras miRNAs expresados ​​diferencialmente más encontramos varios miembros de la
let-7
familia (Fig. S1).

El uso de RT-PCR análisis de las diferencias de expresión entre la HPB, el grupo 1 y 2
let-7a, 7c let-
,
miR-146b
, y
-181b
se pudo confirmar (Fig. 2B). Dado que la expresión de
let-7b
y
-d
fue mostrado para discriminar al menos dos de los tres tipos de tejidos que incluimos tanto
let-7
miembros de la familia en otros análisis . Como se predijo por los datos de la matriz, el
let-7 Buscar miembros de la familia mostraron una baja regulación progresiva de benigno a maligno (grupo 1) y en relación con la enfermedad agresiva (grupo 2), mientras que la expresión de
miR-146b
y
-181b
fue más bajo en el grupo 1 (Fig. 2B).
Let-7d
expresión era difícilmente detectable mediante RT-PCR y fue, por lo tanto, excluye en nuevas investigaciones.

Expresión de
let-7a /b /c
es significativamente el regulado en el CaP de alto riesgo

Por microarrays y RT-PCR análisis identificamos algunas
let-7 Buscar miembros de la familia (
let-7a-c
) como potencial miRs candidatos para marcadores de diagnóstico y pronóstico en CaP de alto riesgo.

ahora nos queríamos confirmar estos resultados por QRT-PCR experimentos en toda la cohorte de alto riesgo (n = 98). El análisis estadístico de los datos de QRT-PCR confirmó una regulación a la baja significativa de
let-7a-c Hoteles en los casos de CaP de alto riesgo en comparación con hiperplasia benigna (p≤0.001) (Fig. 3A). En alrededor del 81/84 /y 96% de las muestras de tejidos analizados, la expresión de
let-7a /b
y
-c, España, respectivamente, fue por debajo de la mediana de expresión de las muestras de HPB (Fig. 3B), que indica el valor específico de tumor de la
let-7 Buscar miembros de la familia en los pacientes con cáncer de próstata de alto riesgo.

A. Caja- y bigotes parcela de expresión relativa de
let-7a /b /c Hoteles en 6 HPB (barra blanca) y 98 CaP de alto riesgo (barra gris) muestras de tejido. La expresión se evaluó mediante qRT-PCR. B. La figura 3B resume la mediana de expresión de
let-7a
/
b
/
c Hoteles en 6 HPB y 98 muestras de CaP y programas de desviación estándar y el valor de p correspondiente . La mediana de expresión de las muestras de BPH se utilizó como umbral. El porcentaje de muestras con CaP que las reguladas
let-7
expresión se muestran en la sexta columna de la tabla. C. Box- y bigotes parcelas muestran la expresión de
let-7b
y
-7c Hoteles en 98 tejidos de alto riesgo CaP y 6 muestras de HPB; evaluado por QRT-PCR. Los subgrupos se basan en: • características del tumor patológica como la puntuación de Gleason y el estadio tumoral patológico (GS ≤7, pT ≤3a - gris claro), (GS ≥8, pT ≥3b - gris oscuro) y • características clínico-patológica como BCR, CF, CRD (sin BCR /no CF /no CRD - gris claro), (BCR /CF /CRD - gris oscuro). A. + C
Let-7a
/
b
/y se muestra
-c
expresión como medias con barras de error para la desviación estándar. * Indica p & lt; 0,01 (A) o p & lt; 0,05 (C). Los valores de p se calcularon utilizando la 2 muestra la prueba t de Welch.

El descenso de regulación de
let-7b
se asocia con las características del cáncer agresivos

Sobre la base de la suposición de que algunos
let-7 Buscar miembros de la familia son progresivamente reducido regulado en los casos más agresivos PCA (grupo 2), que postula que la baja regulación de
let-7
podría también estar asociados con las características clínico-patológica o el pronóstico de los pacientes con CaP. Por lo tanto, buscamos correlación entre
let-7a /b /c
de expresión y tumorales características del CaP Un colectivo como puntuación de Gleason (GS 7≤ ≥8), estadio tumoral patológico (3a ≤pT ≥3b) y criterios de valoración clínicos como BCR, CF, y CRD (ver Tabla 2). Encontramos progresiva baja regulación de
let-7b Hoteles en pacientes con cáncer con características pobres como alta puntuación de Gleason (≥8), recaída bioquímica y fracaso clínico (p & lt; 0,05) (Figura 3C.). Sin embargo, la expresión de
let-7c
se correlacionó con la única CF. No se observó correlación entre el
let-7b
o
-7c
expresión y patológica del tumor etapa (3a ≤pT ≥3b) o CRD (Fig. 3C). Desde
let-7a
carecían de cualquier resultado significativo en términos de las características del cáncer y los criterios de valoración clínicos hemos descuidado este MIR en nuestros análisis posteriores (Fig. S2).


Let-7b
y
let-7c
como pronóstico de marcador para la progresión en un CaP de alto riesgo colectivo (cohorte a)

para determinar si
let-7b
o
- 7c
podría servir como un indicador pronóstico de recaída bioquímica o fracaso clínico dicotomizamos un grupo de estudio de alto riesgo (cohorte a) en baja y alta
let-7b /expresión de c
basado en las puntuaciones z. estimaciones de Kaplan-Meier mostró una diferencia significativa entre los grupos de alto y bajo
let-7b
expresión en BCR (log rank p = 0,01), mientras que
let-7c
mostraron significación marginal (log rank p = 0,08) (Fig. 4A). La bioquímica tasa de supervivencia libre de progresión de 10 años fue del 65% y del 37% para
let-7b
expresión alta y baja, respectivamente. Para
let-7b
y
let-7c
de Kaplan-Meier estima también predijo una diferencia significativa entre los grupos de alta y baja expresión en la FQ (log rank p & lt; 0,001) (Fig. 4A) . 14 de 38 pacientes (37%) con baja let-7b
expresión
, pero sólo 5 de 60 pacientes (8,3%) en el alto let-7b
expresión grupo
se encontró que han experimentado FQ

El análisis de Kaplan-Meier para la recaída bioquímica y clínica de 98 y 92 pacientes con enfermedad de alto riesgo (cohorte a y B). Los grupos se dicotomizaron en baja y alta
let-7b y
-
7c
expresión. Las curvas de supervivencia se generaron utilizando el paquete Bioconductor "supervivencia". A. Análisis de Kaplan-Meier de la cohorte A, establece los datos de aprendizaje (n = 98). B. Análisis de Kaplan-Meier de la cohorte B, el conjunto de datos de prueba (n = 92). Bajo
let-7b
expresión se asocia con el BCR y CF.

El análisis de regresión de Cox mostró que
let-7b
pero no
let-7c
univariately expresión era significativa para la predicción de BCR (HR 0,36 (0,16-0,82)). Cuando
let-7b
expresión y la puntuación de Gleason fueron considerados juntos en un modelo multivariado ambas variables predecían de forma independiente BCR. Con el tiempo, se evaluó si
let-7b
o
let-7c ¿Cuáles son marcadores independientes para el fracaso clínico en la cohorte A. La expresión de ambos MIR son univariately significativa para la predicción de fracaso clínico (Tabla 3). Sin embargo, en un modelo de regresión de Cox multivariado sólo de alta puntuación de Gleason pero no
let-7b
o -
c
se correlacionaron significativamente con mal pronóstico

En resumen. las estimaciones de Kaplan-Meier y el análisis de regresión de Cox indican que bajo
let-7b
y
let-7c
expresión podría ser correlacionada con BCR y CF en la cohorte A.

Validación de
let-7b
y
let-7c
como marcadores de pronóstico en una independiente, externa de la prueba colectiva (cohorte B)

Para validar el papel de
let-7b Opiniones y -
c
como marcadores de pronóstico que trabajamos con un colectivo independiente de los casos de CaP de alto riesgo primarios (cohorte B). Como ya se ha observado en la cohorte A se detectó una baja regulación significativa de
let-7b
y
let-7c Hoteles en muestras de CaP en comparación con BPHS (Tabla S2). Hemos creado niveles de puntuación z en base a la analizada? C
t datos de expresión de ambos
let-7
s en la cohorte de pruebas. Posteriormente dicotomizamos la cohorte de prueba utilizando los niveles de corte identificados para A. Cada muestra colectiva se prevé que sea ya sea en alto o bajo riesgo con respecto a BCR o CF en base a estos umbrales.