Extracto
Antecedentes
A pesar de los avances en la quimioterapia adyuvante en las últimas décadas, de páncreas y los cánceres de colon siguen siendo las causas más comunes de muerte en el mundo. Las toxinas bacterianas, que se unen específicamente a las células glicoesfingolıpidos expuestos en la superficie, son una terapia potencial novela. Se determinó la expresión de globotriaosilceramida (Gb3Cer /CD77), el receptor de la toxina Shiga, en adenocarcinomas de páncreas y de colon humanos.
Metodología /Principales conclusiones
extractos de lípidos del tejido de parejas de cancerosos y adyacentes el tejido normal de 21 de páncreas y 16 pacientes de cáncer de colon se investigó con el ensayo de superposición cromatografía en capa fina en combinación con un enfoque novedoso espectrometría de masas. Gb3Cer /CD77 fue localizado por microscopía de inmunofluorescencia de secciones criogénicas de muestras de tejidos sanos y malignos correspondientes. 62% de páncreas y 81% de los adenocarcinomas de colon mostró una mayor expresión Gb3Cer /CD77, mientras que 38% y 19% del páncreas maligno y el tejido de colon, respectivamente, no lo hizo, lo que indica una asociación de este marcador con la transformación neoplásica. También, Gb3Cer /CD77 se asoció con pobre diferenciación (G & gt; 2) en el cáncer de páncreas (P = 0,039). análisis de espectrometría de masas pone de manifiesto una mayor expresión de Gb3Cer /CD77 con ácidos grasos de cadena larga (C24) y cortas (C16) en los tejidos malignos y señaló la presencia de lipoforms de ácidos grasos hidroxilados, que se proponen ser importante para el receptor de orientación. Podían detectarse en el 86% de páncreas y aproximadamente 19% de los adenocarcinomas de colon. Inmunohistología de criosecciones de tejido tumoral indicó asociación de estos receptores.
Conclusiones /Importancia
Aumento de expresión Gb3Cer /CD77 en la mayoría de los adenocarcinomas de páncreas y colon indicaciones de la toxina Shiga consideración, su subunidad B o subunidad B-derivados como nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de estos cánceres desafiantes
Visto:. Distler T, Souady J, M Hülsewig, Drmić-Hofman I, J Haier, Friedrich AW, et al. (2009) Toxina Shiga receptor Gb3Cer /CD77: Tumor-Asociación y prometedora diana terapéutica en el páncreas y cáncer de colon. PLoS ONE 4 (8): e6813. doi: 10.1371 /journal.pone.0006813
Editor: Georg Hacker, Universidad Técnica de Munich, Alemania |
Recibido: 30 Marzo, 2009; Aceptado: 22 Junio 2009; Publicado: 28 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 Distler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio ha sido financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (URL: www.dfg.de) concede FR2569 /1-1 y MU845 /4-1, el Graduiertenkolleg GRK1409 /1 (URL: http: //zmbe.uni-muenster.de/GRK1409 /) y el Deutsche Krebshilfe (URL: www.krebshilfe.de) conceder DKH 106742. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
la competencia. intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
páncreas y colon son la cuarta y la segunda causa más frecuente causas de mortalidad por cáncer en el mundo occidental, respectivamente, que representan el estimado. 84,250 muertes en 2008 en los EE.UU. por sí solas [1]. Con un período de supervivencia media de aproximadamente 6 meses y las tasas & lt supervivencia a 5 años; 5% filas de cáncer de páncreas entre los más letal de los tumores comunes. El pronóstico para pacientes que sufren de carcinomas de colon con metástasis a distancia en el momento del diagnóstico es casi tan pobre como para cáncer de páncreas [2]. Sólo alrededor del 10-15% de los pacientes con cáncer de páncreas son candidatos a la cirugía potencialmente curativa [3], [4], lo que subraya la necesidad urgente de desarrollar nuevas estrategias para tratar a los pacientes con estos tumores no resecables. Las terapias dirigidas, por ejemplo, a partir de las toxinas bacterianas y de plantas o anticuerpos monoclonales, que reconocen la superficie celular glicoesfingolípidos (GSL), que se sobreexpresan en el páncreas y /o cáncer de colon, podría llegar a ser enfoques prometedores para la terapia adyuvante después de la cirugía [5] -. [9]
GSL, que consiste en una cadena de oligosacárido hidrófila y una hidrófoba membrana ceramida ancla [10], se expresan como constituyentes integrales de balsas lipídicas en el prospecto exterior de la membrana plasmática [11]. Además de su participación en la regulación del crecimiento celular y la adhesión celular [12], la superficie expuesta de células cadenas de oligosacáridos de GSL "servir" como sitios de unión para las bacterias [13] y son explotadas por diferentes toxinas, incluyendo las toxinas Shiga (STXS), para la superficie de unión , tráfico intracelular, y eventos de señalización [14]. STXS (también denominado verotoxinas), que se producen a partir de
Escherichia coli
cepas patógenas [15] - [19], pertenecen a la AB
5 familia de toxinas bacterianas. Se componen de un enzimáticamente activa subunidad A que inhibe la biosíntesis de proteínas mediante la modificación de anfitrión rRNA y un no tóxico homopentamérica subunidad B [20], [21]. El pentámero B se une a su receptor preferencial globotriaosilceramida GSL (Gb3Cer /CD77) y desencadena la internalización de la AB
complejo de 5 Gb3Cer por endocitosis mediada por receptor de
a través de
vesículas revestidas de clatrina [22] o por endocitosis rutas que no impliquen depresiones revestidas de clatrina [23]. El complejo de toxina-receptor experimenta transporte retrógrado a través de la red de Golgi en el retículo endoplásmico. Después de retro-translocación en el citosol [24], una molécula de la A proteolíticamente procesados
1 de la subunidad puede inhibir la síntesis de proteínas y matar a una célula.
expresión aberrante de GSL se produce en casi todos los animales humanos y tipos de cáncer [12], [25] y muchos antígenos asociados a tumores son ahora conocidos por ser los GSL. El aumento de expresión de la Stx-receptor Gb3Cer /CD77 Se ha informado sobre varios tumores sólidos tales como de ovario [26] y el cáncer de mama [27] o meningioma maligno [28]. Recientemente, una mayor expresión de Gb3Cer /CD77 se ha descrito como la correlación con el desarrollo de la metástasis en el cáncer de colon [9], [29]. Gb3Cer /CD77 también permite la localización de membrana de plasma específico de tumor de las proteínas (e. G. Hsp70) [30]. Como moléculas de superficie celular, los GSL asociados a tumores son accesibles a anticuerpos o GSL-unión toxinas (es decir, STX), lo que los objetivos candidatos para aplicaciones oncológicas [31]. En consecuencia, la Stx-ligando Gb3Cer /CD77 está actualmente bajo investigación como candidato objetivo potencial para terapias basadas en la toxina [28], [29], [32], [33].
En este estudio se analizaron de páncreas y tejido de cáncer de colon para la expresión de Gb3Cer /CD77, usando la cromatografía de capa fina (TLC) de GSL extractos de tejidos y tinción inmunohistoquímico de secciones criogénicas de tejido. La expresión potenciada de STX-receptores era detectable en la mayoría de tejidos de páncreas y cáncer de colon, respectivamente, lo que indica una asociación con la transformación neoplásica. Además, las modificaciones estructurales de los anclajes lipídicos de Gb3Cer asociado a tumor /especies CD77 se detectaron en tejidos cancerosos de ambos tipos de tumores que emplean un enfoque novedoso espectrometría de masas combinado con TLC inmunodetección [8], [34]. Por lo tanto, una mayor expresión de lípidos y alteraciones de Gb3Cer /CD77 en los carcinomas hacen que este objetivo un candidato prometedor para Stx y /o STX-construcciones en aplicaciones oncológicas de ambos páncreas y tumores malignos de colon.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el comité de ética local del Colegio de Médicos de Westfalen-Lippe y la Facultad de Medicina de la Clínica Universitaria de Münster (Münster, Alemania) aprobó el estudio actual (número de referencia 1IXHai). Todos los pacientes fueron informados y dieron su consentimiento por escrito.
Las muestras quirúrgicas
El estudio se llevó a cabo utilizando muestras de páncreas (n = 21) y (n = 16) adenocarcinomas de colon de pacientes que habían sido sometidos a cirugía por sus tumores primarios [5]. la histología del tumor se determinó siguiendo los criterios de la UICC [35]. Las características clínico-patológicas de la cohorte de pacientes con los carcinomas se describen en los cuadros suplementarios S1 y S2. especímenes tumorales se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido inmediatamente después de la intervención quirúrgica y se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis. Correspondientes muestras de control fueron obtenidas del mismo paciente en el mismo lugar órgano sin afectación tumoral macroscópico que fue confirmado por el examen histológico.
Preparación de extractos de lípidos a partir de muestras quirúrgicas
Los tejidos se homogeneizaron y se extrajeron dos veces con 2 ml de cloroformo /metanol (1/2, v /v), 2 ml de cloroformo /metanol (1/1, v /v), y 2 ml de cloroformo /metanol (2/1, v /v). Los sobrenadantes combinados de cada extracto de tejido (12 ml) se secaron por evaporación rotatoria y los fosfolípidos se saponifican por incubación en 4 ml de NaOH acuoso 1 N durante 1 hora a 37 ° C. Después de la neutralización con 400 l de HCl 10 N, las muestras se dializaron frente a agua desionizada y se secaron por evaporación rotatoria. Los extractos se ajustaron a los volúmenes definidos de cloroformo /metanol (2/1, v /v) correspondiente a 0,1 mg de peso húmedo por microlitro.
Purificación de Stx1
Stx1 se purificó a partir
E. coli
C600 (H19J) que lleva el
STX
1 | gen de
E. coli O26
: H11 cepa H19 [36]. Brevemente, las bacterias se desintegraron por sonicación y se extrajeron con polimixina B (3000 U /ml) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania). Después de la centrifugación, el sobrenadante que contiene Stx1 bruto se concentró por ultrafiltración y se somete a cromatografía en columna de hidroxilapatito seguido por cromatoenfoque [37]. Las fracciones de la columna que contienen Stx1 se agruparon, se dializaron y las alícuotas se almacenaron a -70 ° C hasta su uso. La pureza de la preparación Stx1 se controló por SDS-PAGE, y la integridad estructural de la toxina se comprobó mediante mapeo de péptidos empleando espectrometría de masas [21]. La actividad biológica se determinó la citotoxicidad de células Vero [38].
Anti-Gb3Cer /CD77 y anti-anticuerpos Stx1
La preparación y la especificidad del anticuerpo policlonal anti-pollo Gb3Cer /CD77 reconociendo la Galα1 -4Galβ1-4Glc residuos de especies /CD77 Gb3Cer se ha descrito [39], [40]. Stx1 se detectó con el anticuerpo anti-ratón-Stx1 IgG1 monoclonal 109/4-E9b (Sifin, Berlín, Alemania).
De alto rendimiento Cromatografía en capa fina (TLC) y Referencia GSL
Una mezcla de los GSL neutros de eritrocitos humanos, que consta de monohexosylceramide, lactosilceramida, Gb3Cer /CD77, y globotetraosilceramida (Gb4Cer), se utilizó como referencia [40] para el anticuerpo TLC y los ensayos de superposición stx1. La nomenclatura de los GSL sigue las recomendaciones de la IUPAC-IUBM 1997 [41]. GSL de referencia y extractos de lípidos de tejidos se aplicaron a gel de sílice soporte de vidrio 60 de cromatografía en capa fina de alto rendimiento con capa preliminar placas (TLC) (sin 1.05633.0001;. Merck, Darmstadt, Alemania) con un aplicador automático (Linomat IV, CAMAG, Muttenz, Suiza) y se separó en cloroformo /metanol /agua (120/70/17, cada uno en vol., con mM CaCl 2
2). GSL de referencia se tiñeron con orcinol.
TLC superposición Ensayo
Gb3Cer /CD77 se detectó utilizando el anticuerpo policlonal de pollo o superpuesto Stx1 como se describe [40], [42]. Los anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina anti-primaria Gb3Cer /CD77 y secundaria (Dianova, Hamburgo, Alemania) fueron utilizados en diluciones 1:2000. anticuerpos secundarios unidos se visualizaron mediante el desarrollo de color con 0,05% (w /v) 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato sal p-toluidina (BCIP, no 6368,3;. Roth, Karlsruhe, Alemania). Los cromatogramas inmunoteñidas se lavaron con tampón de glicina y se almacenaron a -20 ° C. Gb3Cer /CD77-bandas azules immunopositive se cuantificaron con un escáner de CD60 (Desaga, Heidelberg, Alemania, software ProQuant
R, versión 1.06.000). cantidades Gb3Cer /CD77 se determinaron semicuantitativamente como expresión relativa en comparación con los GSL de referencia. Los datos densitométricos secundaria (ver "Análisis estadístico", infra) se utiliza para definir las 4 categorías de expresión tumoral en comparación con los tejidos normales por análisis de punto de corte formal de: alta sobreexpresión (categoría I, 4000 & lt; x), la sobreexpresión moderada (categoría II, 700 & lt; x & lt; 4000), la igualdad de expresión (categoría III, -700 & lt; x & lt; 700), y disminuyó la expresión (categoría IV, x & lt; -700) para el carcinoma de páncreas y de alta sobreexpresión (categoría I, 2000 & lt; x), la sobreexpresión moderada (categoría II, 200 & lt; x & lt; 2000), la igualdad de expresión (categoría III, -200 & lt; x & lt; 200), y disminuyó la expresión (categoría IV, x & lt; -200) para el carcinoma de colon, respectivamente
La inmunohistoquímica.
La tinción inmunocitoquímica se llevó a cabo como se describe [8]. Brevemente, criosecciones (4 micras) se incubaron con el anticuerpo anti-Gb3Cer /CD77 (1:15) y un anticuerpo anti-CD31 (1:200) (IgG1 de ratón, clon MEM-05, ImmunoTools, Friesoythe, Alemania). Se detectaron anticuerpos de unión a Gb3Cer /CD77 y CD31 con dichlorotriazinylamino de fluoresceína (DTAF) marcado con anti-pollo-IgY anticuerpo (Dianova) y Alexa Fluor 568 conjugado anti-ratón-IgG de anticuerpos (Invitrogen, EE.UU., CA), se diluyó 1: 40 y 1:250, respectivamente. Para los controles negativos, inmunohistoquímica se realizó con suero preinmune de pollo y el anticuerpo IgG1 de ratón irrelevante (ImmunoTools). El ADN nuclear de las células se tiñó con 4 ', 6-diamidina-2-fenilindol-dihidrocloruro (DAPI, Sigma-Aldrich, EE.UU.). Los anticuerpos marcados con fluorocromos y núcleos teñidos con DAPI fueron evaluados bajo un microscopio de fluorescencia (Axioskop, Zeiss, Jena, Alemania), aumento original × 40 (lente objetivo Plan-Neofluar, apertura numérica 0,75), siguiendo los protocolos publicados [43]. Para confirmar la naturaleza hidrófoba de la diana de los anticuerpos anti-Gb3Cer /CD77, los lípidos se extrajeron con metanol y cloroformo /metanol (1/1, v /v) de las secciones montadas antes de la tinción.
Infrarrojo asistida por matriz de desorción láser /ionización ortogonal de Tiempo de Vuelo (IR-MALDI-o-TOF) espectrometría de masas
las especificaciones del espectrómetro de masas MALDI-IR-o-TOF (MDS Sciex, Concord, Ontario , Canadá) y directa TLC-IR-MALDI-MS-análisis de bandas inmunopositivas del ensayo de superposición Stx1 TLC se han detallado por Distler et al. [34]. GSL fueron analizados en el modo de iones positivos utilizando glicerol como matriz.
Análisis estadístico
Los datos densitométricos primarias de bandas inmuno Gb3Cer /CD77 y datos densitométricos secundarios, obtenidos a partir de valores de diferencia de pares coincidentes calculados por restando los valores normales del tejido tumoral relacionados, fueron compilados con el paquete de software SPSS, versión 14.0.2 (SPSS Inc., Chicago, IL) para el análisis estadístico no paramétrico. Se utilizó la prueba de los signos para el conjunto de datos densitométricos primarios para examinar la importancia de la relación entre la expresión Gb3Cer /CD77 y la transformación neoplásica. Se realizó la prueba de la mediana para datos densitométricos primaria y secundaria para probar si Gb3Cer /CD77-expresión fue significativamente diferente entre los tumores que comprenden diversas categorías clinicopatológicos. Los coeficientes de correlación se calcularon para los valores clasificados de los datos densitométrico primaria de los tejidos normales y tumorales, respectivamente, y los valores de diferencia clasificados. τ de Kendall se utilizó para evaluar el grado de asociación entre Gb3Cer /CD77-expresión y la clasificación histopatológica. Todas las pruebas fueron dos colas y αwas fijó en 0,05.
Resultados
probaron tejidos de pacientes con adenocarcinoma de páncreas 21 y 16 de colon para la expresión del receptor de Stx-Gb3Cer /CD77 (para la estructura véase la figura 1 ). Para este propósito, los extractos de lípidos brutos y criosecciones de postoperatorio coincidir pares de
frente
tejidos no afectados adyacentes malignos de los mismos pacientes se analizaron por medio de la técnica de superposición TLC y microscopía de inmunofluorescencia. Para obtener más detalles estructurales de modificaciones asociados a tumores de especies /CD77 Gb3Cer, se empleó un enfoque novedoso espectrometría de masas que combina TLC inmunodetección con IR-MALDI-o-TOF-MS [8], [34]. Los pesos húmedos de los tejidos cancerosos y sanos investigados y los datos de patología correspondientes se indican en los cuadros suplementarios S1 y S2.
alícuotas de extractos de lípidos crudo equivalentes a 2 mg de tejido de peso en húmedo de normal (N) y el tejido tumoral (T) se separaron simultáneamente por TLC. GSL neutros de eritrocitos humanos sirven de referencia como positivo en el ensayo de superposición (R, 10,8 g) y la mancha orcinol (O, 16,0 g). La sinopsis de Gb3Cer /CD77-expresión en tejidos cancerosos de ambas entidades tumorales se proporciona en la Tabla 1, y los datos histopatológicos de páncreas y de colon carcinomas se resumen en los cuadros suplementarios S1 y S2, respectivamente. se muestran ejemplos representativos de páncreas (A) y los cánceres de colon (B) de I a IV categorías de tumores. Ninguno de los carcinomas de colon investigado se encontró con la misma expresión de Gb3Cer /CD77 en el tejido normal adyacente (B). Por lo tanto, la categoría III permaneció vacante en la cohorte de pacientes. C, la estructura de Stx1 receptor Gb3Cer (d18: 1, C16: 0). La ceramida (Cer) de anclaje lipídico aparece preferentemente en tejidos humanos sanos con ácidos grasos C24 o C16, pero esfingosina constante (d18: 1).
TLC inmunodetección de asociados a tumores Gb3Cer /CD77 en el páncreas y colon cáncer
alícuotas idénticas de extractos de lípidos en bruto de pares coincidentes de los tejidos no afectados neoplásicas y las correspondientes fueron sometidos simultáneamente a TLC, seguido por la detección de superposición TLC de Gb3Cer /CD77 usando Stx1 y el anticuerpo anti-Gb3Cer /CD77. bandas positivas se clasifican de acuerdo a la diferente expresión de Gb3Cer /CD77; rango 1 indica la intensidad más alta (tabla 1). Sobre la base de la densitometría, los tumores se agruparon en cuatro categorías: van desde alta (I), y moderada sobreexpresión (II), igual (III), y disminuyó la expresión (IV) guía empresas
cánceres pancreáticos
la figura 1A muestra cuatro manchas único representante Stx1 TLC superposición de tumor y extractos de tejido sano relacionadas, cada una representando una de las cuatro categorías de los cánceres de páncreas. En total, el 61,9% de los carcinomas pancreáticos investigados mostró moderada a alta sobreexpresión de Gb3Cer /CD77, mientras que el 14,3% mostró igual y un 23,8% los niveles de expresión disminuida Gb3Cer /CD77 (ver Tabla 1). Globotetraosilceramida (Gb4Cer), conocido como "baja afinidad" ligando de Stx1, fue indetectable en los tumores de páncreas y tejidos normales adyacentes utilizando Stx1 como herramienta de detección. inmunotinciones TLC empleando el anticuerpo /CD77 policlonal anti-Gb3Cer fueron similares en los resultados a los obtenidos con los ensayos de superposición Stx1 TLC que muestran poca sensibilidad más alta en el rastreo de Gb3Cer /CD77-especies (véase la Figura complementario S1 A).
Colon los cánceres.
Figura 1B muestra tres manchas de superposición único representante Stx1 TLC de pares emparejados de cáncer de colon, cada una representando una de las tres categorías verificadas en los cánceres de colon. Gb3Cer /CD77 fue de moderada a altamente sobreexpresado en el 81,3% de los
frente
tejidos de colon sanos malignos. Ninguno de los tumores de colon mostró igual expresión resultante en la categoría III vacante. Menos Gb3Cer /CD77 se detectó en el 18,8% del tejido tumoral (ver Tabla 1). Al igual que en los tejidos pancreáticos, Gb4Cer era indetectable en los tumores de colon y los tejidos normales adyacentes usando Stx1 como herramienta de detección. Las inmunotinciones TLC paralelos que emplean el anticuerpo anti-Gb3Cer /CD77 policlonal se muestran en la Figura complementario S1 B.
Detección inmunohistoquímica de asociados a tumores Gb3Cer /CD77 en el páncreas y cáncer de colon
La unión de anti- Gb3Cer /CD77 anticuerpo a secciones congeladas de tejidos de páncreas y carcinoma de colon y a los tejidos sanos de los mismos pacientes correspondiente se controló histoquímicamente. Las secciones fueron co-inmunotinción con un anticuerpo contra la CD31 endotelial marcador de células y núcleos de las células se visualizaron con DAPI fluorocromo.
Por ejemplo, se detectó extensa de anticuerpo de unión a las células tumorales pancreáticas (T) para el paciente 18 (tumor Categoría I) como se muestra en la Figura 2A. Por el contrario, poco o ningún Gb3Cer /CD77 se encuentra en el tejido pancreático normal (N). ocasionales células endoteliales de los vasos sanguíneos, conocidos para llevar a Gb3Cer /CD77 [21], [39], [43], también mostró tinción positiva en los tejidos malignos de páncreas.
Secciones de la normalidad (N) y el tejido tumoral (T) de páncreas paciente de cáncer 18 (A) y de paciente de cáncer de colon 13 (B) se inmunotiñeron con el anticuerpo anti-Gb3Cer /CD77 y coimmunostained con un anticuerpo contra la CD31 endotelial marcador de células. Los núcleos celulares se detectaron con DAPI. Las barras de escala corresponden a 20 micras. Los ejemplos representativos de los tumores de la categoría I se muestran (ver Tabla 1). Los datos histopatológicos de páncreas y el carcinoma de colon se resumen en los cuadros suplementarios S1 y S2, respectivamente.
comparaciones inmunohistoquímicas demostrar alta Gb3Cer /CD77 niveles de expresión en los tumores de colon (T) como ejemplos para el paciente 13, figura 2B. En contraste, el tejido normal adyacente (N) del mismo paciente carecía Gb3Cer /CD77. La angiogénesis parece ser avanzado en algunos cánceres de colon investigados como se evidencia por las células endoteliales positivas CD31 y Gb3Cer /CD77 dentro de la masa tumoral.
Las secciones de control se incubaron con controles de isotipo IgG1 de ratón, así como con suero preinmune de pollo no se tiñeron . Después de la extracción de los tejidos GSL, Gb3Cer /CD77 ya no era detectable con el anticuerpo (datos no mostrados).
Caracterización estructural de los asociados a tumores Gb3Cer /CD77 en el páncreas y cáncer de colon
La stx1 bandas positivas de los extractos de lípidos separados por TLC se analizaron directamente en las placas de TLC por TLC-IR-MALDI-MS como se describe [34]. Los espectros de masas se adquirieron en el modo de iones positivos y se detectaron como una sola carga monosodiated todas las especies /CD77 Gb3Cer iones moleculares.
cánceres pancreáticos.
detección combinada Stx1 y TLC-IR-MALDI-MS demostrar cambios en la composición de especies individuales /CD77 Gb3Cer sobreexpresados en neoplásico en comparación con tejido pancreático no afectado (por ejemplo, paciente 19 (tumor categoría I), la Figura 3). El análisis de la parte superior de la banda Stx1 positivo el triple del tumor (T, el panel izquierdo, recuadro), más abundante [H
3 * + Na] iones moleculares
+ apuntan a la presencia de Gb3Cer (d18: 1 /d18: 0, C24: 0) con d18 saturada: 0 esfinganina además de la d18 monoinsaturadas más comunes: 1 esfingosina (esfingenina). Lo mismo vale para el menor [H
2 * + Na]
+ y [M
1 * + Na]
+ iones, que se refieren a las estructuras de Gb3Cer (d18: 1 /d18 : 0, C23: 0) y Gb3Cer (d18: 1 /d18: 0, C22: 0), respectivamente. En contraste, sólo una baja expresión de Gb3Cer /CD77 podría ser detectada en la banda positiva Stx1 superior del tejido pancreático normal como se muestra en la Figura 3 (N, panel izquierdo). La alta abundancia [H
4 + Na]
+ iones de la banda inferior positivo Stx1 del tumor (T, panel central) indican una fuerte sobreexpresión de Gb3Cer (d18: 1, C16: 0) en el tejido tumoral en comparación a los iones de muy baja abundancia en el tejido sano correspondiente (N, panel central). Sin embargo, la alteración estructural más prominente se encontró en la banda positiva Stx1 más bajo del tejido canceroso mediante la detección de [M
5 * + Na]
+ iones (t, panel derecho), que eran indetectables en el tejido normal ( N, panel derecho). Cuando se compara con Gb3Cer (d18: 1, C16: 0) (T, panel central), el cambio en 16 unidades de masa atómica indica hidroxilación del grupo ceramida que conduce a la estructura propuesta de Gb3Cer (d18: 1, h16: 0) que lleva un C16 hidroxilado: ácido graso 0. Además, los iones a
m /z 1064,65
indican la presencia de Gb3Cer (d18: 0, h16: 0). Esta modificación ceramida sorprendente se produjo en el 85,7% de los tumores de páncreas hasta ahora investigados. Una sinopsis de las estructuras propuestas de especies /CD77 Gb3Cer se proporciona en el cuadro complementario S3.
Lipid extrae equivalente a 2 mg de peso húmedo de normal (N) y el tejido tumoral (T) de (categoría de pacientes 19 tumor I, véase el cuadro 1 y el cuadro complementario S1) se separaron de forma simultánea por TLC seguido de un análisis de superposición usando Stx1. Las bandas positivas Gb3Cer /CD77 Stx1, que están marcados con flechas en las inserciones, se analizaron por TLC-IR-MALDI-MS. El prevalente [H
3 * + Na]
+ iones moleculares de la banda superior del tejido tumoral (T, panel izquierdo) corresponden a Gb3Cer (d18: 1 /d18: 0, C24: 0) y el iones menores podrían ser asignados a Gb3Cer (d18: 1 /d18: 0, C23: 0) y Gb3Cer (d18: 1 /d18: 0, C22: 0), respectivamente. En la banda superior de tejido normal (N, panel izquierdo) mucho más bajas intensidades de estos iones moleculares se observaron. La alta abundancia [H
4 + Na]
+ iones de la banda inferior en el tumor (T, panel central) representan Gb3Cer (d18: 1, C16: 0), que es detectable sólo en cantidades traza en el tejido normal (N, panel central). Análisis de la banda más baja del tumor (T, panel derecho) reveló [H
5 * + Na]
+ iones, que son indicativos de hidroxilado Gb3Cer (d18: 1 /d18: 0, h16: 0) . Esta variante Gb3Cer /CD77 fue indetectable en el tejido normal (N, panel derecho). El
m /z
valores de iones moleculares y estructuras propuestas de Gb3Cer /CD77-variantes de tejidos normales y malignas adyacentes, así como las referencias de los eritrocitos humanos se enumeran en el cuadro complementario S3.
cánceres de colon.
detección Stx1 combinado con TLC-IR-MALDI-MS permitió perfilar las estructuras individuales de las especies /CD77 sobreexpresados Gb3Cer mostrados como a modo de ejemplo para el paciente 16 en la Figura 4 (T, panel izquierdo) . Alta abundante [H
3 + Na]
iones + apuntan a Gb3Cer (d18: 1, C24: 1 /C24: 0) como las variantes Gb3Cer /CD77 más probables en la banda positiva Stx1 superior, acompañado por menos pronunciado [H
2 + Na]
+ y [M
1 + Na]
+ iones, que corresponden a Gb3Cer (d18: 1, C23: 0) y Gb3Cer (d18: 1, C22: 0), respectivamente. Los mismos iones pero con intensidades mucho más bajas se obtuvieron de la banda positiva Stx1 superior del tejido normal (N, panel izquierdo). En la banda inferior del tumor (T, panel central), prominente [H
4 + Na]
iones + podrían ser asignados a la Gb3Cer (d18: 1, C16: 0) estructura, que también es detectable en el tejido normal, pero con menor intensidad de iones (N, panel central). En la banda más bajo [M
5 * + Na]
iones + indican la presencia de la Gb3Cer (d18: 1, h16: 0) variante con C16 hidroxilado: ácido 0 graso, que no se podría encontrar en el el tejido normal (N, panel derecho). Esta modificación ceramida notable se encuentra en aproximadamente el 19% del tumor de colon TLC inmunotinciones hasta ahora investigado. Una sinopsis de las estructuras propuestas de especies /CD77 Gb3Cer se proporciona en el cuadro complementario S3.
Lipid extrae equivalente a 2 mg de peso húmedo de normal (N) y el tejido tumoral (T) de (categoría de pacientes 16 tumor II, véase el cuadro 1 y el cuadro complementario S2) se separaron de forma simultánea por TLC seguido de un análisis de superposición usando Stx1. Las bandas Gb3Cer positivo Stx1, que están marcados con flechas en las inserciones, se analizaron por TLC-IR-MALDI-MS. El prevalente [H
3 + Na]
+ iones moleculares de la banda superior del tejido tumoral (T, panel izquierdo) corresponden a Gb3Cer (d18: 1, C24: 1 /C24: 0) y el menos abundantes [H
2 + Na]
+ y [M
1 + Na]
+ iones a Gb3Cer (d18: 1, C23: 0) y Gb3Cer (d18: 1, C22: 0 ), respectivamente. En la banda superior de tejido normal (N, panel izquierdo) mucho más bajas intensidades de los iones moleculares correspondientes fueron observados. La fuerte [H
4 + Na]
+ iones de la banda inferior en el tumor (T, panel central) representan Gb3Cer (d18: 1, C16: 0), que es detectable sólo en pequeñas cantidades en la normalidad tejidos (N, panel central). Análisis de la banda más baja del tumor (T, panel derecho) reveló [H
5 * + Na]
+ iones, que son indicativos de Gb3Cer hidroxilado (d18: 1, H16: 0). Esta variante Gb3Cer /CD77 fue indetectable en el tejido normal (N, panel derecho). El
m /z
valores de iones moleculares y estructuras propuestas de Gb3Cer /CD77-variantes de tejidos normales y malignas adyacentes, así como las referencias de los eritrocitos humanos se enumeran en el cuadro complementario S3.
parcelas Análisis estadístico
caja de los datos densitométricos primarias de superposición de ensayo TLC determinaron los niveles de Gb3Cer /CD77 en el páncreas (n = 21 pacientes) y se proporcionan de colon (n = 16 pacientes) tejidos (Figura 5A y B, respectivamente). La sobreexpresión de Gb3Cer /CD77 registrada en 81,3% de cáncer de colon en comparación con los tejidos sanos adyacentes fue significativa (P = 0,021), mientras que el aumento de expresión de Gb3Cer /CD77 en 61,9% de los tejidos pancreáticos malignas no fue significativa (P = 0,189). Tanto en el cáncer de páncreas y colon, la presencia de bandas /CD77 Gb3Cer detectado la Stx no se correlacionó con los parámetros clínico (para datos patológicos ver los cuadros suplementarios S1 y S2). Sin embargo, para los tumores pancreáticos, los valores de diferencia de expresión /CD77 Gb3Cer se correlacionan con el grado de diferenciación del tumor (p = 0,039, τ = 0,396), indicando niveles más altos de Gb3Cer /CD77 en tumores malignos menos diferenciadas. Esta asociación entre la mala diferenciación de los tumores en pacientes con Gb3Cer /CD77 sobreexpresión en tejido maligno en el páncreas se representa en los diagramas de caja de la figura 5C. En conclusión, la expresión de Gb3Cer /CD77 es mayor en los tejidos malignos menos diferenciadas que sugiere que el receptor de la Stx como un marcador potencial para la mala diferenciación de los tumores pancreáticos.
Las cajas están delimitadas encima y por debajo por el 25% y el 75 % percentiles. Las líneas en las cajas y los pequeños cuadrados indican la mediana y los valores medios y los dos × los valores mínimo y máximo, respectivamente. A, aunque no significativa (P = 0,189, n = 21), una mayor expresión de Gb3Cer /CD77 se pudo observar en los tumores de páncreas en comparación con los tejidos normales. B, la expresión de Gb3Cer /CD77 se incrementa notablemente en tejidos de colon tumorales en comparación a la de los tejidos normales adyacentes que indican una asociación entre la expresión Gb3Cer /CD77 y la transformación neoplásica (*, P = 0,021, n = 16). C, correlación entre la expresión Gb3Cer /CD77 y la diferenciación del tumor de páncreas (n = 20 pacientes, debido a un tumor no pudo ser asignado; véase la Tabla 1). Los tumores se dividieron en dos grupos de acuerdo con la clasificación histopatológica: grade≤2 (n = 14 pacientes) y grado & gt; 2 (n = 6 pacientes). El análisis de correlación de rangos de valores de diferencia apunta a una mayor expresión estadísticamente significativa Gb3Cer /CD77 en los tumores de páncreas calificado como & gt;. 2 (*, p = 0,039, τ = 0,396) guía empresas
Discusión
Por la agrupación en lípidos microdominios de membrana balsa [11], [44], las cadenas de oligosacáridos de las GSL exhiben fuertes actividades de unión hacia sus ligandos [45]. Por lo tanto, los GSL asociados al tumor, es decir, los GSL que muestran una expresión elevada en cancerosa en comparación con los tejidos normales, son perfectamente adecuados para el diagnóstico de tumores y terapias contra el cáncer dirigidos [31], [46], [47]. En consecuencia, anticuerpos, lectinas o toxinas con especificidades de unión GSL han generado gran interés en oncología.