Extracto
V-Raf sarcoma murino viral homólogo de oncogén B (BRAF) mutado cáncer de pulmón es relativamente agresivo y es resistente a la actualidad terapias disponibles. En un reciente estudio de fase II en pacientes con cáncer no microcítico de pulmón de células BRAF V600E (CPNM), BRAF inhibidor V600E demostró evidencia de actividad, pero el 30% de este grupo seleccionado progresó durante el tratamiento, lo que sugiere la necesidad de desarrollar estrategias alternativas. Hemos probado dos opciones diferentes para mejorar la eficacia de vemurafenib (inhibidor de BRAF V600E) en BRAF mutado NSCLC. La primera opción fue la adición de erlotinib a vemurafenib para ver si la combinación proporcionó sinergia. El segundo fue para inducir la inhibición de MEK (aguas abajo de la Royal Air Force) con trametinib (inhibidor de MEK). Hemos encontrado que la combinación de vemurafenib y erlotinib no era sinérgica a la inhibición de la señalización de p-ERK en las células BRAF-V600E. Vemurafenib causó la apoptosis significativa, la detención de G1 y la regulación al alza de BIM en las células BRAF-V600. Trametinib fue eficaz como agente único en BRAF mutado células, ya sea V600E o no V600E. Finalmente, la combinación de vemurafenib y trametinib causó un pequeño pero significativo aumento en la apoptosis, así como una regulación positiva significativa de BIM en comparación con cualquiera de los agentes solo. Por lo tanto, haciendo alusión a la posibilidad de utilizar una aproximación mixta para la gestión de este grupo de pacientes. Es importante destacar que, trametinib solo causó la regulación positiva de p-AKT en las células mutadas del gen BRAF V600 no, mientras que este efecto fue anulado con la combinación. Este hallazgo sugiere que, la combinación de un inhibidor de MEK con un inhibidor de BRAF será más eficaz en el ámbito clínico para los pacientes con NSCLC BRAF mutado
Visto:. Joshi M, SJ Rice, Liu X, Miller B, Belani CP (2015) Trametinib con o sin vemurafenib en BRAF mutado de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (2): e0118210. doi: 10.1371 /journal.pone.0118210
Editor Académico: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos |
Recibido: Septiembre 10, 2014; Aceptado: 9 Enero 2015; Publicado: 23 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Joshi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) son diagnosticados en una etapa posterior y los tratamientos actualmente disponibles, incluyendo la quimioterapia y la radioterapia parecen ser insuficientes en la batalla contra esta enfermedad mortal. La presencia de una mutación activadora en el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se asocia con altas tasas de respuesta y la supervivencia libre mejorado progresión (SLP) con el uso de inhibidores de tirosina quinasa de EGFR (TKIs) [1-3]. Erlotinib y gefitinib son TKIs de primera generación que causan inhibición reversible del dominio de la tirosina quinasa de EGFR. Erlotinib fue aprobado inicialmente para uso clínico en CPNM avanzado en la segunda configuración de la línea sobre la base de los resultados positivos del ensayo de fase 3 BR.21 [4]. Estudios de fase 3, al igual que ÓPTIMA (quimioterapia erlotinib frente como tratamiento de primera línea para los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas mutación positiva del EGFR avanzado) [5] y IPASS (Iressa Pan Estudio Asia) [6], han mostrado mejoras claras en las tasas de respuesta y la supervivencia libre de progresión (SLP) con TKIs de primera generación en la primera configuración de la línea, en comparación con la quimioterapia basada en platino tradicional. Esto ya ha llevado al uso de ITC del EGFR como terapia de primera línea para pacientes con CPCNP que albergan una mutación de EGFR sensibilizar a diferencia de la quimioterapia de combinación estándar. Del mismo modo, BRAF (v-Raf sarcoma murino oncogén viral homólogo B1) mutación también puede conducir el desarrollo de tumores en el CPNM. Las mutaciones en el gen
BRAF
tienen una frecuencia de ~2-3% en NSCLC [7,8]. Una mutación V600E en el exón 15 comprende aproximadamente el 50% de todas las mutaciones de BRAF mientras que las mutaciones de BRAF V600E no conforman el resto del 50% [9].
mutante BRAF CPNM se piensa que es agresivo y mostrar resistanceto terapias disponibles en la actualidad [10]. Vemurafenib es un inhibidor oral de BRAF selectivo para la mutación V600E, y se ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de pacientes con melanoma avanzado con la misma mutación. No hay evidencia para apoyar que los inhibidores de BRAF, utilizados solos en el CPNM con mutación BRAF V600E-positivo, demuestran sólo un beneficio modesto con ninguna respuesta completa, respuesta parcial del 40%, y 30% con la progresión de la enfermedad durante el tratamiento [11]. El efecto de la inhibición de MEK (MAPK /ERK quinasa) en BRAF mutante NSCLC no se ha investigado a fondo y un estudio reciente mostró que la combinación de un inhibidor de BRAF (dabrafenib) y el inhibidor de MEK (trametinib) también fue eficaz en el tratamiento de melanoma avanzado [12 ]. Trametinib es un MEK disponible por vía oral inhibidor recientemente aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para su uso en el tratamiento del melanoma metastásico en pacientes con BRAF V600E BRAF-V600K mutaciones, en base a los resultados de un ensayo clínico por Flaherty
et al.
, que muestra un beneficio significativo en la progresión de la supervivencia global y libre [13]
.
en el entorno preclínico, receptor tirosina quinasa (RTK) la inhibición tiene un efecto dominante sobre la supresión de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K ) vía de señalización. Uno de los mecanismos de resistencia para la inhibición RTK en líneas celulares mutante KRAS es a través de la activación de la vía de señalización RAS [14]. Una línea celular de cáncer de colon con una mutación BRAF V600E se demostró que escapar vemurafenib inhibición mediante la activación del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR); sin embargo, el tratamiento de estas células con vemurafenib y un inhibidor de EGFR impedido vemurafenib resistencia y la apoptosis inducida por [15]. Nuestra hipótesis es que la mutación en la vía de BRAF causa hiper-activación de ERK y por lo tanto, la inhibición de EGFR combinación con la inhibición de BRAF sería de beneficio. También nos propusimos determinar si el inhibidor de MEK trametinib sería sensibilizar a las células del tipo salvaje BRAF mutado (WT) EGFR NSCLC a la inhibición de BRAF por vemurafenib. La hipótesis de que las células BRAF-V600E han sensibilidad limitada al inhibidor BRAF debido a la activación de la vía MAPK [12]. Por lo tanto, trametinib podría mejorar la eficacia de un inhibidor de BRAF en BRAF mutado NSCLC. La resistencia a los inhibidores de BRAF está mediada a través de múltiples mecanismos que inducen la reactivación de la vía MAPK [16-19]. Trametinib dirige a MEK, que está aguas abajo de BRAF en la ruta de MAPK. Por lo tanto, la combinación de trametinib con un inhibidor de BRAF, ya sea vemurafenib o dabrafenib, sería más eficaz. Nuestro objetivo era investigar si trametinib y vemurafenib podrían cooperar para suprimir la ruta de señalización de ERK /MAPK en líneas celulares de cáncer mutante BRAF. Se comparó la eficacia de los agentes individuales, vemurafenib o trametinib, a la de la combinación de vemurafenib más trametinib en BRAF líneas celulares de cáncer mutado, HCC364 [V600E-BRAF, WT EGFR] y H1755 [no-V600E, G469A BRAF mutante, WT EGFR ].
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, reactivos y anticuerpos
A549, H460, H1755 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manasés, VA). Considerando que, la línea celular HCC364 fue obtenido por el laboratorio de investigación del Dr. Adi Gazdar F., Universidad de Texas, Southwestern Medical Center (Dallas, TX) [20]. Todas las células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, estreptomicina y penicilina a 37 ° C con 5% de CO
2. mutaciones BRAF V600E y G469A en células HCC364 y H1755, respectivamente, se confirmaron utilizando un método de análisis de fragmentos instantánea de acuerdo con el protocolo desarrollado por Su et al. (S1 Fig.) [21]. Los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). Erlotinib, vemurafenib y trametinib se obtuvieron de Selleckchem (Houston, TX).
La proliferación celular y ensayos de crecimiento a largo plazo
Las células fueron sembradas a 1x10
4 células por pocillo en un 96 placa de cultivo de tejidos -bien. El día siguiente, las células se trataron con erlotinib, trametinib, vemurafenib, o combinaciones como se indica en la Figura leyendas. Sulfóxido de dimetilo (DMSO) se utilizó como un control del vehículo. La proliferación celular se midió 48 ó 72 horas después del tratamiento de drogas utilizando un título de la célula 96 de ensayo no radiactivo acuoso proliferación celular (Promega, Madison, WI) según el protocolo de los fabricantes. viabilidad relativa se calculó para cada pocillo restando la absorbancia de fondo antes de la normalización con el control de vehículo tratado pozos
.
ensayos de crecimiento a largo plazo se llevaron a cabo por las células de siembra a 1500 células por pocillo en una placa de 12 pocillos. Se añadieron fármacos directamente a cada pocillo el día siguiente, y se añadió medio fresco con las drogas después de 4 días. Después de 7 días, las células se lavaron con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 2% durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT), se incubaron con 70% de etanol durante 5 minutos, y luego se tiñeron con 0,1% de azul de tripano durante 60 minutos a RT. Después de decoloración en PBS tres veces, se escanearon los pozos. Posteriormente, el colorante se solubilizó en 1% de SDS y se midió la absorbancia a 590 nm durante tres 100 ml de alícuotas de cada pocillo en un lector de placas Synergy HT (BioTek, Shoreline WA). absorbancia de fondo de un pozo sin células se restó de los valores experimentales y los valores experimentales se normalizaron a tratamiento con vehículo.
inmunotransferencia ensayo
Las proteínas fueron cosechadas a partir de células en un tampón de lisis que contiene 40 mM Tris.Cl pH 7,6, 1% de Triton X-100, 1% de desoxicolato, NaCl 150 mM, más de la proteasa y de fosfatasa cócteles inhibidor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 4 ° C durante 30 minutos. La proteína total se cuantificó con un kit BCA (Thermo Scientific, Waltham MA), y cantidades iguales de proteína se repartieron a través de 10% en geles de SDS-PAGE, electrotransferidas a PVDF, y se bloqueó con 5% NFDM. membranas bloqueadas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios, con adecuada anticuerpo secundario conjugado con HRP, antes de la detección de quimioluminiscencia.
La citometría de flujo
La apoptosis fue ensayada por la tinción de las células con FITC marcado con Anexina-V ( BD Pharmingen, San Jose CA)) y ViaProbe (7-AAD, BD Pharmagen) antes del análisis en un citómetro de flujo Calibur (BD Biosciences, San Jose CA). Las células se sembraron por triplicado en una placa de 6 pocillos, y las celdas siguientes días se trataron con los fármacos indicados. Paclitaxel se utilizó como control positivo para los experimentos de apoptosis. Veinticuatro a 48 horas después de los tratamientos, las células flotantes y las células adherentes se recogieron a continuación, se tiñeron con anexina-V-FITC y 7-AAD en tampón de unión V-anexina 1x (BD Biosciences) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se midió la fluorescencia con un citómetro de flujo, y los datos resultantes se analizaron con WinMDI 2.8 software (Instituto Scripps, http://facs.scripps.edu/software.html).
análisis del ciclo celular se realizó por etidio tinción con bromuro. Las células se sembraron por triplicado en una placa de 6 pocillos un día antes del tratamiento de drogas. Después de 24 horas, los núcleos se recogieron y se tiñeron en una solución de lisis hipotónica (citrato de sodio 7 mM, 0,2% de Triton X-100) con bromuro de etidio (50 ng /ml) y la RNasa A (50 mg /ml) durante 30 minutos en el oscuro. Se midió la fluorescencia en un citómetro de flujo Calibur. Los datos obtenidos fueron analizados utilizando el software ModFitLT 3.2 (Verity Software House, Topsham ME).
El análisis estadístico
La significación estadística de las diferencias entre los dos grupos o entre varios grupos se analizó con dos caras pruebas t de Student para datos independientes (para varianzas iguales) Aplicación por el Excel 2007 (Microsoft Corp., Redmond WA). Todos los datos que se muestran son la media SEM de valores por triplicado a partir de tres experimentos separados. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt; 0,001 en comparación con el grupo control. t de Student pruebas independiente o de una vía ANOVA se utilizaron para comparar las variables continuas entre los dos grupos o más de dos grupos. Los resultados se consideraron estadísticamente significativas a p & lt; 0,05. La sinergia citotóxico se analizó y se representa gráficamente con el uso de software Calcusyn (BioSoft, Cambridge Reino Unido) y se expresó como el índice de combinación en el LC99 (es decir, la concentración letal para 99% de las células). Otra confirmación se obtuvo con una matriz de 5x5 en el uso de un ensayo CellTiter-Glo y la Dicha aditivo análisis del modelo.
Resultados
Expresión de señales de p-ERK y P-Akt en las células NSCLC
La desregulación de ambos RAF /MAPK y las vías de señalización Akt /mTOR se cree que desempeñan un papel crítico en la carcinogénesis y la progresión tumoral en NSCLC [22]. Numerosos componentes de estas vías de señalización pueden actuar como dianas moleculares en la terapéutica del cáncer, pero es imprescindible conocer la presencia de estas aberraciones en células de cáncer de implicación clínica [23]. Primero se determinó la expresión de línea de base (p) -AKT fosforilada y p-ERK 1/2 en nuestras líneas celulares (Fig. 1A). se detectó señal de ERK fosforilado en todas las líneas 4-celulares utilizadas en nuestros experimentos, lo que sugiere que la vía de ERK juega un papel importante en el desarrollo del cáncer en las células KRAS o BRAF mutados. Los fármacos que se dirigen a esta vía pueden resultar eficaces. Sin embargo, p-AKT se detectó débilmente en células BRAF mutado, HCC364 y H1755 cuando se compara con líneas celulares A549 y H460, como se muestra en la Fig. 1A. Esto puede sugerir que la vía de señalización AKT no puede jugar un papel crucial en las células mutadas BRAF
A:. Transferencia de Western de AKT fosforilada y la señalización de ERK en líneas de células sin tratar nativas ([+] mutado; [-] tipo salvaje). Todos los carriles son del mismo gel y ruptura fue creado para incluir sólo es relevante líneas de células B: A549, las líneas celulares H460, H1755 y HCC364 tratados con D (DMSO) o fármacos indicados, E (erlotinib), V (vemurafenib), y EV (erlotinib-vemurafenib) se analizaron después de 72 horas mediante un ensayo MTS. La IC50 para Vemurafenib en HCC364 era 0,8 mM. C: Western blot de diferentes líneas celulares NSCLC, que muestra los cambios en p-ERK, p-AKT y PARP con vehículo D (DMSO), E (erlotinib) 1,6 M, V (vemurafenib) 1,6 M, VE (erlotinib + vemurafenib) 1,6 /1.6, M después del tratamiento 24h. D: La apoptosis por citometría de flujo de tratamiento post 48h con D (DMSO), E (erlotinib) 1,6 M, V (vemurafenib) 1,6 M, EV (erlotinib /vemurafenib 1,6 /1,6 M). Western blot, 48 h después, el apoyo a la escisión de PARP con V y EV en HCC364 pero no H1755 células.
Erlotinib y vemurafenib
La eficacia de la terapia de combinación con erlotinib y vemurafenib. La combinación de un EGFR dirigido anticuerpo monoclonal (cetuximab) y BRAF inhibición (vemurafenib) habían demostrado su eficacia en las células de cáncer de colon con la mutación BRAF [15]. Hemos tratado de determinar si un concepto similar de la combinación de BRAF y EGFR inhibiciones podría ser eficaz en líneas celulares de cáncer. A549, H460, H1755 y HCC364 células fueron tratadas con diferentes concentraciones de erlotinib, vemurafenib, o la combinación de erlotinib y vemurafenib (5 diluciones en serie de fármacos solos y 2.5 diluciones de 1: proporción de la combinación 1). Ensayos de proliferación celular demostró que sólo HCC364 células fueron sensibles a vemurafenib y la combinación de vemurafenib y erlotinib no fue efectivo (Fig. 1B). H1755 células fueron menos sensibles a vemurafenib y ninguna sinergia significativa se observó con la combinación de erlotinib y vemurafenib. Vemurafenib fue ineficaz en las células mutadas del gen KRAS (A549, H460). Además, la falta de sinergia entre erlotinib y vemurafenib fue confirmada por el método de Bliss (S2 Fig.) [24].
Las modificaciones de la señalización oncogénicas después del tratamiento durante 24 horas con la combinación de vemurafenib más erlotinib (1,6 M /1.6 mu M) se analizaron por análisis de inmunotransferencia (Fig. 1C). Vemurafenib disminuyó la fosforilación de ERK en células HCC364 sólo que sin el consiguiente aumento de AKT activado. Este hallazgo sugiere que la falta de sinergia entre erlotinib y vemurafenib visto en ensayos de proliferación se debe a la relación ERK-AKT visto en el cáncer de colon y no está presente en las células HCC364. Esto probablemente no está relacionada con la elección de un inhibidor de EGFR (cetuximab vs. erlotinib). Vemurafenib solo indujo la activación de la señalización de ERK en la no-BRAF mutado células, A549 y H460. Ningún cambio significativo en ERK activada se observó en las células H1755 después del tratamiento con vemurafenib. Curiosamente, se observó que la combinación de vemurafenib y erlotinib resultó en una disminución de la AKT activado en KRAS células mutadas (Fig. 1C).
Finalmente, se evaluó los cambios en la apoptosis después de erlotinib y vemurafenib tratamientos solos o en combinación . HCC364 células fueron sensibles a la apoptosis y la escisión de PARP-vemurafenib inducido, mientras H1755 células fueron resistentes (Fig. 1D). El mecanismo de la apoptosis se evaluó mediante ensayos de inmunotransferencia después de 48 horas de tratamiento con vemurafenib y causó un aumento en BIM (pro-apoptótica), en comparación con DMSO. Una disminución de MCL-1 (anti-apoptótica) también se observó con vemurafenib, pero no se observaron cambios en la Bcl-XL (anti-apoptótica), BCL-2 (anti-apoptótica), BAK (pro-apoptótica), y BAX ( pro-apoptótica) en comparación con DMSO (S3 Fig.).
efectos de vemurafenib como agente único en líneas celulares de cáncer de BRAF mutado. El uso de un vemurafenib ensayo de crecimiento a largo plazo se ha encontrado para ser eficaz en BRAF V600E-mutado HCC364 células y no en no mutado BRAF V600E H1755 células (Fig. 2A). a continuación, hemos querido evaluar más a fondo el mecanismo molecular detrás de esta actividad anti-tumoral. Se analizaron los cambios en el ciclo celular 24 horas después del tratamiento con vemurafenib, tanto en las células H1755 y HCC364. En HCC364 células, vemurafenib causó un aumento significativo en el número de células G1 con una disminución posterior en las células de fase S, el apoyo a la detención en G1 en las células V600E mutados. Vemurafenib, sin embargo, fue ineficaz a causar un bloque G1 en células H1755 (Fig. 2B). Inmunotransferencia mostró cambios en las proteínas del ciclo celular en células HCC364, después del tratamiento con vemurafenib incluyendo, regulación a la baja de la expresión de CDK2 y la regulación positiva de p21 y p27 expresiones (Figura 2C).
A:. A largo plazo ensayo de crecimiento, puesto 7 días el tratamiento con vehículo-D (DMSO), vemurafenib 50 nM, 500 nM, 5000 nM, tanto en HCC364 y H1755 células. HCC364 células eran más sensibles a vemurafenib. * P & lt; 0,05; *** P & lt; 0,001 en comparación con DMSO. B: análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo 24h post-tratamiento con DMSO, V (vemurafenib) en las células HCC364 y H1755. fases del ciclo celular se muestran en G1, S y G2 fase. V induce la detención del ciclo celular en células HCC364, como se evidencia por un aumento en G1 y una disminución significativa en la fase S. C: Western blot a las 48 horas de tratamiento post apoyo a la evidencia de la detención en G1, que muestra aumento de la p27 y la disminución de CDK2 con V (vemurafenib) en comparación con D (DMSO). No se observó efecto en las células H1755. Todos los carriles para HCC364 y todos los carriles para H1755 son de la misma gel. La ruptura ha sido creado para eliminar los carriles tratados con erlotinib.
Trametinib y vemurafenib
Efecto del tratamiento de combinación con trametinib y vemurafenib. El tratamiento con la combinación de inhibidor de MEK y BRAF inhibidor ha sido eficaz en el melanoma avanzado con mutación BRAF-V600, pero el efecto del inhibidor de MEK o esta combinación similar que no ha sido explorado en el CPNM BRAF mutado [12]. Se analizó si la adición de trametinib de vemurafenib mostraría alguna eficacia en las células mutadas del gen BRAF, H1755 y HCC364. Trametinib fue más eficaz en la inhibición del crecimiento después de siete días en ambas líneas celulares en comparación con vemurafenib, sin embargo la combinación de los dos fármacos no fue significativamente diferente de trametinib sola (Fig. 3A, B). Se evaluaron las diferencias en el ciclo celular de las células de NSCLC ambos mutantes BRAF después de un tratamiento de 24 horas con DMSO, vemurafenib, trametinib y la combinación (Fig. 3C). Tanto vemurafenib y trametinib fueron eficaces en la causa de la detención en G1 como se evidencia por un aumento significativo en la fase G1 y una disminución de células en fase S en comparación con el tratamiento DMSO. Sin embargo, la combinación no fue más eficaz que cualquiera de los agentes individuales por sí solos. La detención del ciclo celular observada con citometría de flujo en las células HCC364 se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia de proteínas del ciclo celular después de 24 horas de tratamiento con los agentes respectivos. Se demostró la regulación negativa de CDK2 con la regulación positiva de p21 y p27 con vemurfenib, trametinib y la combinación en comparación con el DMSO (Fig. 3D). Sin embargo, no hubo diferencias observado en las células tratadas con trametinib, vemurafenib, o la combinación de trametinib más vemurafenib en las expresiones de CDK2, p21 o p27 en estas células (Fig. 3D). Además, no se observó ninguna diferencia en pJAK2 y expresiones pSTAT3 (S4 Fig.) Curiosamente, las células H1755 no mostraron una tendencia similar en CDK2 o p21 y p27, a pesar de la detención de G1 y la disminución de la fase S visto con citometría de flujo ( Fig. 3D). Esto nos hace creer que existe otro mecanismo involucrado en la detención de G1, que es independiente de la regulación a la baja de CDK2 en estas células
A, B:. Ensayo de crecimiento a largo plazo, los 7 días después del tratamiento con vehículo DMSO (D ), V (vemurafenib) 1 M, T (trametinib) 1 mM y TV (+ trametinib vemurafenib, 1 mM cada uno) en HCC364 (A), y las células H1755 (B). C: análisis del ciclo celular por citometría de flujo en células H1755 HCC364 y después de 24 horas de tratamiento con D, V 0,5 M, T 0,5 M, TV 0,5 /0,5 M. D: Western blot después de 24 horas de H1755 y HCC364 tratado como en C. (*** p & lt; 0,001 en comparación con DMSO) guía empresas
Además, exploramos la apoptosis efecto de la combinación vemurafenib y trametinib en. BRAF mutado células de NSCLC. Trametinib indujo apoptosis en ambas líneas de células mutadas BRAF. La combinación de vemurafenib y trametinib causó la apoptosis significativamente mayor que cualquiera de los agentes solo en HCC364 y H1755 (Fig. 4A). La apoptosis después de varias dosis de tratamiento trametinib se confirmó por la presencia de la escisión de PARP en células HCC364, mientras que una disminución de la PARP se observó en las células H1755 sin la presencia de PARP escindida (Fig. 4B). La aparición de la apoptosis se ve apoyada por la regulación positiva de la proteína pro-apoptótica, BIM, en ambos HCC364 y H1755 células tras el tratamiento con trametinib. La combinación provocó mayor aumento en BIM en comparación con trametinib solo. Esta observación sugiere que la combinación de vemurafenib y trametinib es mejor en la promoción de la apoptosis que trametinib solo en células mutadas BRAF (Fig. 4C). No se observaron cambios significativos en la expresión de Bcl-2, Bcl-XL, MCL-1, BAX y BAK
A:. La apoptosis por citometría de flujo, tratamiento post 48h con vehículo-D (DMSO), V ( vemurafenib 1 M), T (trametinib 1 M), TV (+ trametinib vemurafenib 1/1 M) en las células HCC364 y H1755. (* P & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001). B: transferencia de Western de PARP escindida en HCC364 y H1755, el tratamiento posterior 48h con D (DMSO) y dosis variables de vemurafenib (0,25, 0,5, con 1 m) y trametinib (0,25, 0,5, con 1 m) C: blot que muestra los cambios Western en ERK, AKT, BIM, la escisión de PARP, tratamiento post 48h con vehículo D (DMSO), V (vemurafenib 1 M), T (trametinib 1 M), TV (+ trametinib vemurafenib 1 /con 1 m) en HCC364 y H1755 células. Cuatro carriles se trataron por duplicado para cada líneas celulares y sólo quedan los 4 carriles de cada uno de las líneas celulares se han mostrado en la figura.
Trametinib como agente único en BRAF mutado NSCLC. El inhibidor de MEK, selumetanib se ha demostrado que regular a la baja la señalización de ERK en modelos preclínicos con pulmón NSCLC KRAS mutado, pero un efecto similar no se ha demostrado en NSCLC BRAF mutado [25]. Quisimos comparar las alteraciones de señal oncogénicos resultantes de la introducción de un inhibidor de BRAF, un inhibidor de MEK, o la combinación de ambos en BRAF mutado NSCLC. Los cambios en las señales oncogénicas se evaluaron mediante la realización de un ensayo de inmunotransferencia para evaluar los cambios en las señales de apoptosis en ambas células con vemurafenib vs. trametinib vs. la combinación en el tratamiento de 48 horas con 1 dosis M de agentes individuales y 1: la proporción de la combinación 1, 1: 1μM dosis cada uno. Hemos observado que el tratamiento con trametinib provocó una supresión significativa de la fosforilación de ERK en comparación con DMSO o vemurafenib solo en tanto HCC364 y H1755 células (Fig. 4C). La combinación de trametinib y vemurafenib no era mejor que trametinib solo. Además nos dimos cuenta de que pAKT no estaba elevada en HCC364 células con el uso de cualquiera de los agentes individuales o combinación (p-AKT se detectó débilmente en HCC364 células y la expresión no cambió el inmunoblot no se muestra). Sin embargo, hemos visto un aumento en la expresión de p-AKT con el uso de solo trametinib agente en BRAF no V600E mutado H1755 células y de manera interesante la combinación de trametinib y vemurafenib no mostraron un aumento de la p-AKT en comparación con DMSO, lo que sugiere que quizás vía de p-AKT puede jugar un papel en la resistencia al tratamiento con un solo agente trametinib. Trametinib también es eficaz en la causa de la apoptosis tanto en las células H1755 (Fig. 4A) y HCC364. Además, trametinib también causó la detención en G1 en células BRAF mutado (Fig. 3C). A pesar de los cambios en las proteínas del ciclo celular, regulación a la baja de CDK2 y la regulación positiva de p21 y p27 expresiones, sólo se observaron en las células HCC364.
Discusión
vía BRAF juega un papel importante en la tumorigénesis en NSCLC, inhibidores de BRAF, dabrafenib vemurafenib y han demostrado una eficacia modesta en los cánceres mutante BRAF V600E-[11,13]. A pesar de la orientación esta mutación específica, el uso de dabrafenib, en el CPNM con mutación BRAF-V600E ha resultado en sólo una tasa de respuesta del 40% junto con una progresión de la enfermedad 30% decepcionante [11]. Estos resultados reflejan que la inhibición de BRAF por sí sola no es una opción de tratamiento ideal y nuevas estrategias para el tratamiento optimizado y eficaz de este selecto grupo de pacientes están garantizados. Esta hipótesis es apoyada por un estudio clínico en el melanoma que muestra una ventaja significativa en la supervivencia libre de progresión con la combinación de dabrafenib más trametinib vs. dabrafenib sola [12]. Nuestros experimentos in vitro confirmó que vemurafenib es eficaz en la inhibición del crecimiento, disminución de señalización de ERK y la inducción de la apoptosis en la línea celular mutante BRAF V600E HCC364, mientras que en la línea de no-V600E BRAF mutante celular, H1755, no fue tan sensible. Prahallad
et al.
, Han demostrado una mayor actividad por el tratamiento combinado de la cetuximab inhibidor de EGFR con vemurafenib mediante la vinculación de ERK y AKT señalización a través de la Cdc25C intermediario en células de cáncer de colon BRAF mutado [15]. Sin embargo, nuestros resultados reflejan que la combinación de erlotinib y vemurafenib no es eficaz en células de NSCLC. Aunque no hemos podido detectar Cdc25C en las líneas celulares mutante BRAF HCC364 (V600E) y H1755 (no-V600E), estas células no responden a la inhibición de ERK con la activación de AKT mejorado lo que sugiere que ERK y AKT señalización no están vinculadas a través Cdc25C en estos las células.
el vemurafenib era capaz de modular las proteínas relacionadas con la apoptosis y el ciclo celular [26,27]. Se encontró que el tratamiento con vemurafenib dio como resultado niveles reducidos de la proteína anti-apoptótica niveles elevados de la BIM proteína pro-apoptótica en líneas celulares de cáncer MCL-1 y. MCL-1 derrota junto con el aumento BIM [28-30], conduce a la inducción de la apoptosis, y aumento de los niveles de BIM también puede iniciar la apoptosis [31-33]. Además, la proteína relacionada con el ciclo celular, CDK2, se downregulated mientras que las proteínas inhibidoras del ciclo celular, p21 y p27, se upregulated después del tratamiento vemurafenib en HCC364 células, lo que resulta en la detención del crecimiento. Especulamos que estos cambios de expresión de proteínas están probablemente relacionados con la reducción de la actividad de ERK [34,35], ya efecto similar se observó en el tratamiento con trametinib (Fig. 3D). Esto refuerza la hipótesis de que la modulación de BIM y MCL-1 están relacionados con la reducción de la actividad de ERK en células HCC364. Por desgracia, H1755, células BRAF V600E-no, mostró G1 del ciclo celular depende de la regulación a la baja de ERK mediante tratamiento con trametinib. detención del ciclo celular se produjo sin alteración de la proteínas del ciclo celular, CDK2, p21 y p27. Esto sugiere que las células H1755 pueden tener un mecanismo diferente que participan en la detención de G1 independiente de punto de control de CDK2 en el ciclo celular.
Nuestros resultados muestran trametinib es eficaz en la causa de la apoptosis tanto en BRAF V600E y células mutadas no V600E. Trametinib era potente en la disminución de la señalización de ERK en células mutantes BRAF, y esta supresión es más pronunciado con trametinib si se compara con vemurafenib incluso en BRAF V600E células mutadas. A largo plazo, los resultados del ensayo de crecimiento también demostrar que trametinib tiene mejor eficacia como agente único en comparación con vemurafenib en células BRAF V600E pero esto podría ser como resultado de una vida media más corta de vemurafenib [36,37]. Curiosamente, el tratamiento con un solo agente trametinib causó la regulación positiva de la señalización Akt en las células no sólo V600E BRAF, lo que sugiere un mecanismo de escape potencial de desarrollo de resistencia al tratamiento con el inhibidor de MEK solo. Esto puede proporcionar una visión de desarrollo de resistencia a los inhibidores de MEK. La vía de AKT no parece ser upregulated cuando las células no V600E BRAF fueron tratados con la combinación de trametinib y vemurafenib, lo que sugiere que la terapia de combinación puede ser superior a cada uno de los dos agentes individuales en este grupo también. La relación mecanicista entre la inhibición de ERK y la activación de AKT en BRAF mutante NSCLC por inhibidor de MEK necesita ser evaluado más. También demostramos por primera vez que el tratamiento de combinación provocó un aumento significativo en la regulación positiva de BIM tanto en las células V600E y no V600E, jugando así un papel importante en la apoptosis [31]. El tratamiento combinado también causó un aumento de pequeño pero significativo en la apoptosis en células BRAF mutado en comparación con un solo agente, lo que sugiere la justificación del uso de combinación de BRAF y MEK inhibidor en este selecto grupo. Además, la combinación de trametinib y vemurafenib podría superar la resistencia a trametinib solo y por lo tanto mejor que solo trametinib agente. Lupin et al. han puesto de relieve el posible mecanismo detrás de la resistencia en las células NSCLC BRAF V600E-mutado para el inhibidor de BRAF [38]. Los dos mecanismos moleculares discretas para la adquisición de resistencia a los inhibidores de BRAF incluyen la pérdida de larga duración en BRAF V600E junto con la expresión de una forma aberrante de BRAF V600E que conserva la dependencia vía RAF y constitutiva de señalización del EGFR autocrina impulsado por c-Jun mediadas la expresión del ligando de EGFR. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de la mutación BRAF- activación independiente de la vía MAPK que lleva al desarrollo de resistencia a los inhibidores de BRAF en el tratamiento de BRAF V600E-mutado NSCLC. Además, el efecto secundario y el perfil de toxicidad (19% del carcinoma cutáneo de células escamosas en el brazo inhibidor de BRAF
vs
. 7% en el grupo de combinación en pacientes con melanoma) favorece la terapia combinada [12].