Extracto
Antecedentes
Es bien sabido que muchos tumores malignos, incluyendo el cáncer de páncreas ( PC), poseen la capacidad para evadir el sistema inmune mediante la regulación negativa indirecta la maquinaria de la célula mononuclear necesario poner en marcha una respuesta inmune efectiva. Este conocimiento, junto con el hecho de que el trancriptome de las células mononucleares de sangre periférica se ha demostrado que ser alterada en el contexto de muchas enfermedades, incluyendo el carcinoma de células renales, nos llevan a estudiar si tal alteración en la expresión génica existe en PC como se pueden tener utilidad diagnóstica.
métodos y las conclusiones
muestras
CMSP de 26 pacientes con CP y 33 controles sanos fueron analizados por el conjunto de microarrays de ADNc del genoma. Se encontraron tres ochenta y tres genes a ser significativamente diferente entre el PC y los controles sanos, con 65 que tiene al menos un cambio de 1,5 veces en la expresión. Pathway análisis reveló que muchos de estos genes cayeron en vías responsables de la diferenciación hematopoyética, la señalización de citoquinas, y las células asesinas naturales (NK) y la respuesta citotóxica de las células T CD8 +. El análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado identificó un predictor conjunto de ocho genes, que consiste en
SSBP2, Ube2b-RS1, CA5B, F5, TBC1D8, ANXA3, arg1,
y
ADAMTS20, Windows que podría distinguir a los pacientes de PC de los controles sanos con una precisión del 79% en un subconjunto ciego de muestras de pacientes sin tratamiento previo, dando una sensibilidad del 83% y una especificidad del 75%.
Conclusiones
en resumen, hemos reportar la primera comparación en profundidad de los perfiles de expresión génica global de PBMC entre pacientes y controles sanos PC. También hemos identificado un conjunto de genes que potencialmente predictor pueda desarrollarse para su uso en los algoritmos de diagnóstico en PC. Orientaciones futuras de esta investigación deben incluir el análisis de los perfiles de expresión de PBMC en pacientes con pancreatitis crónica, así como aumentar el número de pacientes en estadio temprano para evaluar la utilidad de las PBMC en el diagnóstico precoz de la PC
Visto:. Baine MJ, Chakraborty S, Smith LM, Mallya K, Sasson AR, marca RE, et al. (2011) Transcripción de perfiles de células mononucleares de sangre periférica de los pacientes en el cáncer pancreático Genes Identifica novela con potencial utilidad de diagnóstico. PLoS ONE 6 (2): e17014. doi: 10.1371 /journal.pone.0017014
Editor: Ludovic Tailleux, Instituto Pasteur, Francia |
Recibido: 7 de Diciembre, 2010; Aceptado: January 19, 2011; Publicado: 10 Febrero 2011
Derechos de Autor © 2011 Baine et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud (RO1 CA131944, RO1 CA78590, RO1 CA 133774, EDRN UO1 CA 111.294, y de las esporas CA127297 P50). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. El Fondo para el UNMC Microarray Core recibe apoyo parcial de la INBRE Programa del Centro Nacional de Recursos de Investigación, NIH número de concesión P20 RR016469
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de páncreas (CP) sigue siendo un tumor maligno letal con una tasa de supervivencia global a cinco años de sólo el 5% [1]. Un contribuyente importante al mal pronóstico de los pacientes con CP es el fracaso para detectar el tumor en una etapa temprana y potencialmente resecable. Se estima que sólo el 8% de los casos de PC son diagnosticados con tumores localizados en el páncreas, mientras que sólo el 15-20% se considera resecable. Además, de esos pacientes que han tenido su tumor resecado, sólo el 20% viven más de 5 años después del diagnóstico [2]. La causa más común de muerte después de la resección de metástasis a distancia es; recidiva local es rara. A pesar de los estudios que muestran una supervivencia prolongada en pacientes con CP son poco frecuentes, es incuestionable que la detección temprana y la resección del PC, especialmente en un estado localizado, es probable producir un aumento significativo en la supervivencia
.
El diseño de una prueba de diagnóstico temprano para PC Sin embargo, presenta un desafío particular debido a la relativa rareza de la enfermedad y el hecho de que la enfermedad a menudo permanece asintomática hasta una etapa avanzada. Idealmente, una prueba de diagnóstico temprano para PC sería mínimamente invasiva, y relativamente barato, pero está suficientemente sensible para identificar todos o la mayoría de los casos de PC. Cuando se combina con una prueba de confirmación altamente específica, que podría potencialmente permitir la identificación precoz de los pacientes con enfermedad resecable.
CA19-9 es actualmente el único marcador aprobado por la FDA para su uso en PC. Sin embargo, mientras CA19-9 es útil como un marcador de la carga de la enfermedad, que carece de sensibilidad y especificidad (aproximadamente 80% y 73%, respectivamente) como un marcador de diagnóstico [3] - [8]. No obstante, sigue siendo el estándar de oro contra el que se compara cada biomarcador potencial. En los últimos años, varios nuevos biomarcadores prometedores han surgido que potencialmente puede detectar PC etapa temprana, ya sea en los tejidos (MUC4, MUC1, CECAM1) o en la sangre (MIC-1, NGAL, telomerasa y microRNAs) [9]. Sin embargo, ninguno de estos biomarcadores potenciales están libres de imperfecciones importantes, mostrando sensibilidad y /o especificidades que son pobres o inconsistentes entre los estudios. Por lo tanto, existe una necesidad clínica de nuevos marcadores para el diagnóstico precoz de PC.
sangre periférica de células mononucleares (PBMCs) comprenden las células mononucleares circulantes, incluyendo monocitos, células T, células B y células asesinas naturales (NK), y han surgido en los últimos años como marcadores indirectos de varias enfermedades incluyendo inflamatoria (por ejemplo, la preeclampsia, la artritis reumatoide, y la pancreatitis crónica) y enfermedades malignas (leucemia linfocítica crónica y el carcinoma de células renales) [10] - [14]. Sin embargo, su papel en la detección y pronóstico de tumores sólidos sigue siendo limitada. En el presente estudio, la hipótesis de que una alteración en el perfil de expresión génica global de PBMCs se produce en pacientes con PC e identificación de los subconjuntos de genes en PC específica en PBMCs podría ser potencialmente útil en la detección precoz de esta patología.
los acontecimientos recientes han permitido el desarrollo de chips de genes que contienen un conjunto de genes específicos de la enfermedad, ya sea para el diagnóstico o para predecir el pronóstico de varios tumores malignos como el de mama y el cáncer de esófago [15] - [18]. Los resultados de nuestro estudio sugieren que un predictor conjunto de ocho genes (seleccionados de 383 genes expresados diferencialmente de 39.200 genes) puede distinguir entre individuos sanos y PC con una sensibilidad y especificidad del 83% y 64%, respectivamente.
Materiales y Métodos
estudio de la población
el estudio de biomarcadores basados en la sangre en PC fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Nebraska Medical Center (UNMC) (número IRB 209-00). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y controles antes de su inclusión en el estudio. Para este estudio, 26 pacientes de PC y 33 años de edad, la raza y controles sanos de género fueron reclutados. Un total de 35 muestras se obtuvieron de la PC y 33 de entre el grupo sano. Línea de base información demográfica para ambos grupos se detalla en la Tabla 1.
El diagnóstico de PC se basó en una biopsia positiva de una masa pancreática o una lesión metastásica. Los pacientes fueron clasificados de PC como localizado (estadio 1 y 2a) o no localizada (estadio 2b y superior), antes o después de la cirugía, y antes o después de la quimioterapia. Un paciente fue clasificado como después de la cirugía si hubieran sido objeto de una pancreaticoduodenectomía antes de que se extrajo la muestra. Todas las demás muestras, incluyendo muestras de pacientes que nunca se sometieron a cirugía durante el curso de su enfermedad, se clasificaron como pre-cirugía. Cualquier muestra tomada antes de que el paciente había sido sometido a ningún quimioterapia para PC fue clasificada como pre-quimioterapia. Si el paciente había tenido quimioterapia para PC, independientemente de si o no que la paciente fue sometido a quimioterapia en el momento del sorteo de la muestra, la muestra se clasifica como después de la quimioterapia. Para pacientes en los que se extrajeron varias muestras en diferentes fechas, todas las muestras se utilizaron en el análisis de los datos salvo que se indique explícitamente en la sección de resultados
puesta en escena de PC se basó en uno de los cuatro criterios: 1). Patológico post-puesta en escena cirugía, 2) puesta en escena MRI /CT /ultrasonido, 3) puesta en escena endoscópica, o 4) de biopsia de la enfermedad metastásica.
Aislamiento de RNA total a partir de PBMCs
PBMCs se aislaron de la sangre entera usando el solución de lisis RBC PharmLyse (BD, San José, CA) según las instrucciones del fabricante. El ARN total se extrajo usando el kit de aislamiento de ARN Qiagen RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) y luego se convierte a ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con un protocolo publicado anteriormente [19].
cDNA microarray análisis del perfil de expresión génica global de PBMCs
análisis de microarrays se realizó mediante la instalación de centrales de microarrays UNMC utilizando el protocolo de laboratorio establecido en una falange entera cDNA microarray genoma que contiene 30,275 características sondeo de aproximadamente 22.000 singular genes. Una referencia humana universal (Stratagene, Cat: 740000, Cedar Creek, TX) se utilizó como referencia contra el cual todas las muestras se normalizaron
Análisis estadístico
Registro se aplicó
2 transformación. a todas las proporciones, seguido de la normalización de "centro" cada array usando Lowess más suave a través ArrayTools BRB desarrollado por el Dr. Richard Simon y Amy Peng [20]. Cualquier gen en el que el porcentaje de puntos faltantes o filtrados superó el 50% fue excluido. duplicar los puntos no se promediaron pero tratados como genes separados para el análisis. Los modelos de efectos mixtos se utilizaron luego para determinar qué genes se expresan diferencialmente significativa entre el PC y los grupos de control sanos, lo que permite una tasa de falso descubrimiento 10%. grupo de diagnóstico (cáncer vs. normal) se incluyó en el modelo como un efecto fijo y un efecto sujeto al azar también se incluyó para dar cuenta de múltiples muestras por persona.
análisis de agrupamiento jerárquico de las matrices basadas en la similitud de expresión perfiles se ha realizado mediante el normalizado y registro de información
2-transformado. La agrupación se realizó utilizando la versión Gene Cluster 3.0, utilizando el "centrada" correlación de Pearson similitud vinculación método de agrupación métrica y completa, y se visualizaron utilizando Java TreeView.
Validación de datos de microarrays por Q-RT-PCR
Los resultados de microarrays fueron validados por PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR Q). Todas las reacciones de Q-RT PCR utilizados química basada SYBR verde. Para la validación, seis de los genes más expresados diferencialmente: 3 hasta reguladas (
ANKRD22, ANXA3, ARG1
) y 3 abajo reguladas (
FCER1A, GRAMD1C, y MS4A1
) mediante microarrays se elegido. La validación se realiza en un subconjunto seleccionado al azar de las muestras originales (presentados para el análisis de microarrays) que incluyeron nueve controles sanos y doce pacientes de PC. El factor de cambio en la expresión génica se determinó por el 2
-ΔΔCt método utilizando el mismo ARN referencia humano que el empleado en el microarray. Para determinar la correlación entre los microarrays y los resultados Q-RT-PCR, se calculó la mediana del cambio veces en la expresión (para un determinado gen) para los controles de PC vs sanos, y la comparamos con el cambio veces visto por microarrays para determinar si el gen todavía se expresa de forma diferente en la misma dirección.
la correlación de firmas genéticas con características clínico-patológicas en PC
Para determinar si existe la expresión diferencial de genes en pacientes de PC se correlaciona con las características del paciente, una mixta modelo de efectos se aplicó a las muestras de PC que se agruparon de acuerdo a los siguientes criterios: situación quirúrgica (pre vs post-cirugía), el estado de la quimioterapia (pre vs post-quimioterapia), la historia de tipo II diabetes mellitus antes de la el diagnóstico de PC (presente vs ausente), la localización del tumor (cabeza contra el cuerpo /cola), y la etapa de PC (localizada frente a no localizado y metastásico versus no metastásico). Importantes genes fueron elegidos en base a una tasa de falso descubrimiento permisible de menos del 10%. Etapa 1a y 2a PC se consideraron localizada, mientras que las etapas 2B, 3, y 4 PCs se consideraron no localizada, y de la etapa 4 tumores se consideraron metastásico. Durante dos pacientes reclutados en el estudio, no se pudo obtener información sobre el estadio del tumor, localización del tumor, y la historia de la diabetes mellitus de tipo II.
Identificación de un predictor conjunto de genes que distingue PC de individuos sanos
BRB-ArrayTools Version 3.8.0 se utilizó para analizar todas las combinaciones posibles de los 21,671 genes válidos identificados por microarrays para determinar si una firma genética se pudo identificar que distinguir a los pacientes de PC de los controles sanos con la combinación óptima de sensibilidad y especificidad . Los datos de microarrays para 24 muestras elegidas al azar de PC y 20 controles sanos se introducen en el análisis. Los genes que se seleccionarán para el conjunto predictor estaban obligados a ser significativamente diferente entre el PC y los grupos de control sanos con un nivel de significación de p≤0.0001 y con una expresión veces de diferencia entre los dos grupos ≥ 1,5. validación transversal del conjunto de genes predictor 1 se repitió tiempos K veces (K = 10). El conjunto de genes predictor llegado a través de estos métodos se analizó mediante diversos métodos, incluyendo Compuesto Covariate Predictor, Diagonal análisis discriminante lineal, 1-vecinos más cercanos, 3-vecinos más cercanos, centroide más cercano, máquinas de soporte vectorial, y el Compuesto bayesiano Covariate Predictor. De estos, el Compuesto Covariate Predictor dio los mejores capacidades de predicción utilizando el conjunto de genes predictor y consecuentemente utilizado.
Validación del predictor conjunto de genes
Una vez que el predictor conjunto se estableció, que fue validado en un segundo juego de PC seleccionado al azar y muestras sanas. El estadístico se desconocía la identidad de las muestras. La aplicación de la línea de corte obtenido por el método de predicción compuesto de covarianza, las muestras fueron clasificadas como "PC" o "no-PC". El analizador (M.B.) fue entonces no ciego y la exactitud de la predicción se determina por comparación con el diagnóstico real. También se aplica la misma ecuación para un subgrupo de pacientes de PC pre-quirúrgicas pre-quimioterapia para determinar la capacidad del predictor conjunto de clasificar correctamente a los pacientes en PC frente a no-PC. Esto es importante ya que la influencia de la quimioterapia y /o cirugía en el perfil de expresión génica de las PBMC no puede ser descartado. Además, este último grupo de pacientes representa la población de pacientes ideales en los que la prueba, si se valida se aplicaría en un entorno clínico.
Resultados
Después de la normalización y filtrado de los datos de microarrays, 21671 genes se mantuvieron para su análisis. De éstos, se encontró que 383 genes para tener una expresión diferencial significativa entre los pacientes de PC y los controles sanos (Tabla S1). De éstos, se observó que 65 genes que tienen una expresión diferencial ≥1.5 veces entre los dos grupos (Tablas 2-3).
Una agrupación jerárquica de los datos de microarrays identificado dos grupos de muestras, que se muestran en la Figura 1 y en forma de dendrograma en la Figura 2, un grupo PC y un grupo de control sano. Dos muestras de PC sin embargo agrupan con los controles sanos, mientras que un control sano cayó en el clúster que contiene la mayoría (32/35) de las muestras de PC. Además, el perfil de expresión génica de una muestra de PC no clúster con cualquiera de los controles sanos o las otras muestras de PC.
análisis de agrupamiento jerárquico del perfil de expresión génica global por el conjunto de cDNA microarray genoma comparando control sano y muestras de PC usando todos los genes que se encuentran estadísticamente expresados diferencialmente entre los dos grupos (FDR & lt; 0,10, n = 383 genes). En ningún caso las muestras se agruparon.
Red
indica los genes cuya expresión es elevada en relación con la referencia humana universal (utilizado para normalizar todos los arrays) y
verde indica
genes cuya expresión se reduce con respecto a la referencia humana universal.
a dendrograma de relación de la muestra a partir de los análisis de agrupamiento se muestra en la Figura 1 utilizando los genes estadísticamente significativos expresados diferencialmente. Las muestras agrupadas en grupos principales, alineando así la clasificación de PC o HC. muestras de PC PBMC se indican con
barras grises
mientras que las muestras de PBMC sanos se denotan por
barras amarillas
.
Q-RT-PCR validación
seis de los genes más expresados diferencialmente (
ANKRD22, ANXA3, arg1, FCER1A, GRAMD1C
, y
MS4A1
) fueron elegidos para su validación por Q-RT-PCR en un subconjunto seleccionado al azar de 21 CMSP muestras (compuesto de 12 muestras de PC y 9 muestras de control sanos desde el 68 original utilizado en el microarray). La mediana de expresión veces para cinco de ellos se encontraba en la misma dirección que en el microarray, que nos da un índice de validación de 83%.
FCER1A
era el único gen para el cual no se obtuvo una correlación positiva. Los resultados se representan en la Tabla 4.
Correlación del perfil de expresión PBMC con características clínico
Para determinar si existía una correlación entre el perfil de expresión génica de PBMC en pacientes con CP y el paciente clínicamente relevante características, se dividieron las muestras de PC basado en el estado quirúrgica (23 antes de la cirugía frente a 12 después de la cirugía), la historia de la quimioterapia (15 frente a la quimioterapia pre-20 después de la quimioterapia), el diagnóstico de tipo II diabetes mellitus antes de la diagnóstico de PC (con un 14 frente a 19 con un historial negativo historial positivo), la localización del tumor primario (25 frente a 8 cabeza del cuerpo /cola), y la etapa de la PC al momento del diagnóstico (6 localizada (etapa 1 /2A) vs. 12 no localizados no metastásico (Etapa 2B /3) frente a 15 metastásico (Etapa 4) PC). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa en la expresión de genes entre cualquiera de estos grupos de pacientes que aplican el criterio de un FDR. & Lt; 10%
Gene Predictor Conjunto
A continuación se investigó si se podría identificar un conjunto de genes predictor mínimo que sería discriminar con precisión los casos de PC de los controles sanos. Para ello, 44/68 muestras que comprenden 24 PC y 20 muestras de control sanos fueron escogidos al azar. Todos los 21,671 genes para cada una de las muestras se introdujeron en el análisis. Un predictor conjunto de ocho genes se obtuvo y compuesta por
SSBP2, Ube2b-RS1, CA5B, F5, TBC1D8, ANXA3, ARG1
y
ADAMTS20
. Utilizando el método de la predicción compuesto de covarianza (CCPM), este conjunto predictor dio una clasificación correcta de PC frente a no-PC con una precisión del 73%, proporcionando una sensibilidad del 71% y una especificidad del 75%. Las ponderaciones asignadas a cada gen utilizando CCPM fueron -4.97, -4.83, -4.38, 4.43, 4.44, 4.53, 4.84, y 4.96, respectivamente, con un valor de umbral de 38.98 tales que si Σ
i
w
i
x
i era & gt; el umbral para una muestra se predijo como procedentes de un paciente PC (donde
w
i = peso gen,
x
i = log
2 la expresión génica intensidad).
Validación de los genes predictor conjunto
el uso de este predictor conjunto de ocho genes, la clasificación de una muestra como PC o un control sano se intentó en una forma ciega usando un conjunto de muestras que consta
sólo se
de las muestras que no fueron utilizadas para crear el conjunto de predicción (es decir, 24/68). En esta validación ciego, utilizando la ecuación derivada anteriormente, el predictor conjunto de genes con precisión predijo el diagnóstico de PC con 73% de precisión, dando una sensibilidad del 83% y una especificidad del 64%.
En un intento adicional probar el potencial de la utilidad de diagnóstico de este conjunto predictor gen, un nuevo subconjunto de las muestras, que comprende de 12 muestras de PC obtenidas de pacientes que eran tanto pre-quimioterapia y antes de la cirugía, junto con un número igual de controles sanos seleccionados al azar, fueron cegados de nuevo y se analizaron para predecir su clasificación. Esta vez el predictor de ocho gen fue capaz de clasificar correctamente estas muestras el 79% del tiempo, dando una sensibilidad de 83% y 75% de especificidad del diagnóstico.
Discusión
En los últimos años se ha han demostrado repetidamente que la expresión genética en PBMCs se altera en el contexto de malignidad [13], [14], [21], [22]. Esta observación de un perfil de expresión genética PBMC alterada en pacientes con cáncer fue reportado por primera vez en el linfoma de células B grandes difuso y la leucemia linfocítica crónica y luego se extendió más allá de las hemopatías malignas a través del análisis de la expresión de PBMC de perfiles en pacientes con carcinoma avanzado de células renales (CCR) [ ,,,0],13] - [14]. En ambos neoplasias hematológicas y en el RCC, se informó de que la variación en la expresión génica entre los pacientes con controles de enfermedad y sanos fue mucho mayor que la variación inter-muestra observada para los pacientes sanos solamente, lo que sugiere que PBMCs podría ser marcadores útiles con potencial aplicaciones de diagnóstico y pronóstico en el cáncer. Además, en RCC, se demostró que un conjunto clasificador 8-gen desarrollado a partir de los genes expresados diferencialmente podría predecir el diagnóstico de malignidad con 100% de precisión [14].
Recientemente, Huang et al. han informado de que un perfil de expresión génica diferencial existe en PBMCs de pacientes con CP [22]. Aunque este estudio también se utiliza microarrays y validación Q-RT PCR para establecer la expresión genética diferencial en la sangre periférica de los pacientes de PC, su propósito era establecer biomarcadores potenciales que podrían diferenciar pacientes diabéticos recién diagnosticados con PC de diabéticos sin PC. Si bien los autores del estudio informaron que 48 genes fueron expresados diferencialmente entre pacientes y controles sanos PC mediante microarrays, sólo se utilizaron 8 muestras en cada uno de los dos grupos y que no proporcionó más información sobre estos genes. El tamaño de muestra pequeño y una falta de validación cegado contrastan aún más este estudio con el presente informe. Además, no hemos encontrado ningún gen significativamente expresados diferencialmente en base a la historia de cualquiera de cirugía previa o la quimioterapia, antecedentes de diabetes mellitus de tipo II, o etapa de PC en nuestro estudio. Es importante destacar que, el estudio de Huang et al. utilizada
GAPDH
como la limpieza de genes contra la cual se normalizó la expresión de cada gen. En nuestro estudio, sin embargo, hemos observado que
GADPH
fue uno de los genes más significativamente sobreexpresa en PBMCs de pacientes con CP. Upregulation de
GAPDH
También se ha informado en varias neoplasias incluyendo ovárico, tiroides, hepatocelular y cáncer de páncreas [23] - [26]. La elección del gen de referencia interna ideales en estudios de investigación de potenciales biomarcadores clínicos mediante microarrays sigue siendo una cuestión importante que tendrá que ser abordado en futuros estudios.
Este estudio representa el primer análisis en profundidad del transcriptoma de PBMCs de pacientes con PC en comparación con controles sanos, y sólo la tercera instancia de tales perfiles para los tumores sólidos en general. Establecimiento de dicha expresión diferencial tiene el potencial para producir un rico compendio de posibles genes para su posterior búsqueda como nuevas dianas diagnósticas o terapéuticas. Además, las redes de genes identificados en nuestro estudio ofrecen nuevos conocimientos sobre la desregulación del sistema inmune en PC (Figura 3). Con el hecho de que sólo el 15-20% de los pacientes con CP son diagnosticados con enfermedad resecable y dada la tenaz resistencia de la malignidad a la quimioterapia y la radioterapia, la detección temprana de la enfermedad ofrece la mayor esperanza para un impacto inmediato en mejorar el pronóstico del paciente.
Todos los genes que se muestran a ser baja regulado mayor de 1,5 veces. La cantidad respectiva de expresión diferencial por gen, así como la función indicada se puede encontrar en la Tabla 3. La expresión diferencial de estos genes indica que hay una disminución global en el número de células, la activación y la eficacia del sistema inmune adaptativo en pacientes con PDAC que puede tener un efecto significativo tanto en su morbilidad y mortalidad. Las líneas discontinuas indican la asociación de las células mientras que las líneas continuas indican la diferenciación o la proliferación de un tipo de célula particular. Los números representan los puntos individuales de interacción entre los genes y la diferenciación y la respuesta inmune vía: 1, Presentación del antígeno a las células Th0; 2, La diferenciación de las células Th0 hacia la ruta Th1 o Th2; 3, la proliferación de células inmunes; 4, la estimulación de la actividad citotóxica de las células T por las células Th1; 5, la estimulación de la inmunidad humoral por las células Th2; 6, el reconocimiento y la respuesta a las células diana por los linfocitos T citotóxicos (CTL); 7, la diferenciación de las células B vírgenes; 8, la lisis de células diana por CTL. Las letras representan las poblaciones de células individuales: a, los linfocitos T citotóxicos (CTL); B, B-células. Disminución de los genes asociados a las letras A y B puede representar una disminución de la población de sus respectivos celular asociada.
El potencial para la expresión diferencial de genes de perfiles de CMSP, o de un predictor conjunto de genes pre-determinado establezcan desde ella , para ser útil para el diagnóstico precoz de PC es teóricamente bastante alto; especialmente cuando se considera que los dos mecanismos más probables que subyacen a esta expresión diferencial son el reconocimiento del sistema inmunológico del cáncer y la evasión del sistema inmune por el cáncer. Mientras que otros biomarcadores, tales como CA19-9, se liberan de las células cancerosas y por lo tanto aumentan con el aumento de la carga tumoral, la expresión diferencial en PBMCs puede comenzar, al menos en parte, tan pronto como la inmunogenicidad del cáncer o la evasión inmune está establecido. la evasión del sistema inmune se ha demostrado que ser iniciado tan pronto como la enfermedad pre-maligna en PC, apoyando así la premisa de que el análisis de la expresión génica diferencial en las células inmunes puede ofrecer la capacidad de detectar una lesión neoplásica incluso antes de que gana capacidades invasivas [27] .
Si bien este estudio en sí no trata de mirar las capacidades de diagnóstico precoz de PBMCs, los resultados obtenidos a partir de la obra son un primer paso necesario para un ensayo multiplexado basado en la alteración de la expresión génica en PC para la aplicación potencial en grupos de alto riesgo [28]. El hecho de que un predictor conjunto 8-gen fue capaz de establecer una sensibilidad del 83% con una especificidad de entre el 64 y el 75% en un conjunto de muestras de ciego es prometedor y tendrá que ser validado en un gran conjunto de muestras. Si bien el número de muestras es demasiado pequeña para realizar cualquier análisis adicional detallada, el hecho de que la sensibilidad para el conjunto de genes predictor no disminuyó cuando se aplica a pacientes de PC antes de puntos quimioterapia o la cirugía hacia la utilidad potencial de este conjunto predictor 8-gen en un entorno de diagnóstico, el área principal en la que se carece de CA 19-9 [4] - [8]. Además, el análisis de la expresión génica PBMC no es más invasiva de una prueba de CA19-9, siendo ambos susceptibles de un simple venopunción, y el análisis global no tiene que ser sustancialmente más caros que los métodos clínicos actuales para las pruebas de CA19-9. Si sólo el conjunto clasificador 8-gen se utilizó para el análisis, pruebas de PBMC se podría lograr mediante el uso de chips de micromatriz mini-cDNA o por medio de reacciones de PCR multiplex, ambos de los cuales son clínicamente viable y sería bastante sencilla de añadir al repertorio de pruebas proporcionadas por un laboratorio clínico estándar.
Más allá del potencial de diagnóstico de este perfil de expresión diferencial PBMC, las funciones normales y la dirección de la expresión diferencial de cada uno de los genes, especialmente el 65 que fueron ≥1.5 pliegan expresados diferencialmente, alude a los posibles mecanismos fisiopatológicos. 18/65 genes tienen el potencial de disminuir directamente la proliferación de células T, la señalización del receptor de células T, o linfocitos T citotóxicos (CTL), mientras que la citotoxicidad cuatro pueden modular directamente una disminución de la activación de células B /diferenciación o señal de una disminución de la número de células B circulantes. Tres de los genes puede disminuir directamente la citotoxicidad de las células NK, y dos pueden disminuir la respuesta de los macrófagos. Tomados en conjunto, los resultados de nuestro estudio sugieren que la PC se caracteriza por una disminución significativa en la capacidad del sistema inmunitario para responder a los antígenos no propios, incluyendo antígenos asociados a tumores, tal como se resume en la Figura 3. Una pista parcial sobre los mecanismos subyacentes este compromiso inmunológico puede provenir de la regulación al alza observada de
ARG1
, se observa que se upregulated más de 2 veces en PBMCs de pacientes con CP. Una expresión de ARG1 está estrechamente asociada con un aumento en la presencia de células mieloides derivados supresores (MDSCs) [29]. MDSCs se conocen clásicamente para reducir la respuesta CTL, principalmente a través de la desestabilización de los receptores de células T y la disminución de la expresión de ciertos subtipos de CD3, en última instancia conduce a CTL apoptosis. Sin embargo, se sabe que MDSCs específicamente para causar la regulación a la baja de CD3Z, que no fue demostrado que se expresa diferencialmente en PBMC analizadas en este estudio [29]. Además, se conocen MDSCs para causar una canalización del sistema inmune lejos de la inmunidad celular y hacia la inmunidad humoral y alérgica-respuesta, una propiedad que no está claramente representado en los datos de expresión diferencial de PBMC. Por el contrario, parece (de la alteración en la expresión del gen) que el número de células B circulantes disminuye mientras tanto
FCER1A
, un receptor central para la respuesta alérgica, y
MS4A1
, que desempeña un papel en la B-célula para la diferenciación de células plasmáticas, se redujo regulado. Por lo tanto, mientras que MDSCs pueden desempeñar un papel en la modulación de la expresión diferencial visto en PBMCs de pacientes con CP, es probable que operan en concierto con otros mecanismos para afectar a una baja regulación de la maquinaria respuesta inmune celular y humoral tanto la del cuerpo.
Una comparación del perfil de expresión génica observada en nuestro estudio con los reportados en otras enfermedades reveló poca similitud con otra benigna (pre-eclampsia, la artritis reumatoide (RA), y pancreatitis crónica (CP)) y enfermedades malignas (RCC). En total, 6 genes (
CD160, GOLGA8B, RABGAP1L, MMP8, CRISP3
, y
ARG1
) que se demostró que se expresa de forma diferente en PBMCs de pacientes con preeclampsia fueron también expresados diferencialmente en PBMCs de pacientes con PC, 4 (
CD160, MMP8, CRISP3
, y
ARG1
) diferencialmente expresado en la misma dirección (1% coincidencia) [10]. Doce genes (
BTG2, CCND3, CD151, CD7, CLU, CTSB, KLRK1, SPN, GSTO1, PCMT1, PRDX6
, y
PRF1
) que fueron demostrado ser expresadas diferencialmente en PBMCs de pacientes con AR también fueron expresados diferencialmente en PBMCs de pacientes con CP, 8 de los cuales (
CCND3, CD151, CLU, CTSB, GSTO1, PCMT1, PRDX6
, y
PRF1
) estaban en la misma dirección (2% en común) [11]. Dos genes (PDE3B y Gadd45a) encontrado que se expresa diferencialmente en PBMCs de pacientes con PC también se expresaron diferencialmente en PBMCs de pacientes de PC, ninguno de los cuales se expresan de forma diferente en la misma dirección (0% comunalidad) [12].