Extracto
Justificación
Nuevos enfoques para definir los factores que subyacen a la inmunopatogenia de enfermedades pulmonares incluyendo sarcoidosis y tuberculosis están necesaria para desarrollar nuevos tratamientos y biomarcadores. La comparación de la respuesta transcripcional de sangre de la tuberculosis a otras enfermedades pulmonares similares avanzará conocimiento de vías de la enfermedad y ayudar a distinguir las enfermedades con cuadros clínicos similares.
Objetivos
Para determinar los factores que subyacen a la inmunopatogenia del granulomatosa enfermedades, sarcoidosis y tuberculosis, mediante la comparación de las respuestas transcripcionales sangre en estas y otras enfermedades pulmonares.
Métodos
Se compararon los perfiles de transcripción de sangre entera en la sarcoidosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, a la comunidad todo el genoma neumonía y cáncer de pulmón primario y controles sanos, antes y después del tratamiento, y en las poblaciones de leucocitos purificados adquirida.
mediciones y resultados principales
Un interferón-inducible por la firma transcripcional de sangre de neutrófilos impulsada estuvo presente en tanto sarcoidosis y tuberculosis, con una mayor abundancia y de expresión en tuberculosis. La heterogeneidad de la firma sarcoidosis correlacionó significativamente con la actividad de la enfermedad. perfiles de transcripción en la neumonía y cáncer de pulmón revelaron una sobre-abundancia de las transcripciones inflamatorias. Después de un tratamiento exitoso de la actividad transcripcional en los pacientes con tuberculosis y la neumonía se redujo significativamente. Sin embargo, los pacientes con sarcoidosis glucocorticoides sensible mostraron un aumento significativo en la actividad transcripcional. transcripciones 144 de sangre fueron capaces de distinguir tuberculosis de otras enfermedades pulmonares y controles.
Conclusiones
Tuberculosis y sarcoidosis revelaron perfiles de transcripción de sangre similares, dominadas por las transcripciones de interferón-inducible, mientras que la neumonía y cáncer de pulmón mostraron distintas firmas, con predominio de los genes inflamatorios. También hubo diferencias significativas entre la tuberculosis y la sarcoidosis en el grado de su actividad transcripcional, la heterogeneidad de sus perfiles y su respuesta al tratamiento transcripcional
Visto:. Bloom CI, CM Graham, Berry MPR, Rozakeas M, Redford PS, Wang Y, et al. (2013) Blood transcripcional firmas Distinguir la tuberculosis pulmonar, sarcoidosis pulmonar, neumonías y cánceres de pulmón. PLoS ONE 8 (8): e70630. doi: 10.1371 /journal.pone.0070630
Editor: Jyothi Rengarajan, Escuela de Medicina de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Marzo, 2013; Aceptado: 20 Junio 2013; Publicado: 5 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Bloom et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. AOG, CMG, PSR, Consejo de Investigación médica (U117565642), FR & amp; Consumibles, Instituto Mérieux, SILA, CIB apoyada por el Consejo de Investigación Médica de Investigación Clínica de becas de formación; RJW & amp; KAW, MRC U1175.02.002.00014.01, Wellcome Trust 084.323 y 088.316, EDCTP (IP.07.32080.0002), y la Unión Europea (7PM IRSES295214). El reclutamiento de pacientes en: Paris (DV, GG, MM y PP) con el apoyo de una subvención de AP-HP (PHRC AOR-09-085); Lyon, Lyon Red (acciones Incitatives Hospices Civils de Lyon). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Co-autor Robert Wilkinson es PLOS ONE miembro del Consejo Editorial sin embargo, esto no altera el la adhesión autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. De lo contrario, todos los demás autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
Aproximadamente nueve millones de nuevos casos de tuberculosis activa (TB), y 1,4 millones de muertes por tuberculosis, se estima que ocurre a nivel mundial cada año 1]. El diagnóstico temprano es vital para evitar el retraso del tratamiento, por lo tanto, la capacidad de discriminar TB de otras afecciones pulmonares que pueden presentar de manera similar a la tuberculosis, como la sarcoidosis, o presentarse de forma aguda (neumonía adquirida en la comunidad) o la presentación crónica (cáncer de pulmón primario) es importante.
TB y la sarcoidosis son enfermedades multisistémicas generalizados que impliquen preferentemente el pulmón y, a menudo presente en una forma clínica y radiológica y similares. Distinguir estas enfermedades, por tanto, puede requerir una biopsia invasiva. La formación de granulomas es fundamental para ambas condiciones y aunque el patógeno
Mycobacterium tuberculosis
se reconoce como la causa etiológica de la tuberculosis, lo que subyace en la sarcoidosis es desconocida [2]. Las vías de señalización implicadas en la inflamación granulomatosa también son poco conocidos y hay poca comprensión de las diferencias específicas de la enfermedad. La tuberculosis y la sarcoidosis también pueden mostrar una presentación similar a agudas enfermedades infecciosas pulmonares como la neumonía adquirida en la comunidad y los trastornos pulmonares crónicas como el cáncer de pulmón primario.
Dada la complejidad de estas enfermedades un enfoque de biología de sistemas puede ayudar a desentrañar el director respuestas inmunes del huésped. La sangre periférica tiene la capacidad de reflejar los cambios patológicos e inmunológicos en otras partes del cuerpo, y la identificación de alteraciones enfermedad asociada puede ser determinada por una firma transcripcional sangre [3]. En apoyo de este concepto, hemos demostrado recientemente un interferón (IFN) inducible por la firma de sangre en pacientes con tuberculosis pulmonar de Londres y Sudáfrica [4], que ahora ha sido validado en tres estudios independientes en África [5], [6] e Indonesia [7]. perfiles de expresión génica de la sangre también se ha aplicado con éxito a otros trastornos infecciosos e inflamatorios, tales como lupus eritematoso sistémico (LES), para ayudar a comprender los mecanismos de la enfermedad y mejorar el diagnóstico y el tratamiento [3]. Dos estudios recientes han utilizado sangre transcripcional de perfiles para la comparación de la tuberculosis pulmonar y la sarcoidosis; ambos estudios se encuentran las enfermedades tuvieron respuestas similares transcripcional, que implicaban la sobreexpresión de los genes de IFN-inducible [8], [9]. Sin embargo, estos estudios no examinaron otras enfermedades pulmonares similares han planteado la cuestión de si estas firmas transcripcionales también reflejan otros trastornos pulmonares.
El principal objetivo de nuestro estudio era mejorar nuestra comprensión de la inmunopatogenia sarcoidosis y tuberculosis subyacente mediante la comparación de las respuestas transcripcional en la sangre en pacientes con tuberculosis pulmonar a la encontrada en los pacientes con sarcoidosis, neumonía y cáncer de pulmón pulmonares. También se compararon las respuestas transcripcional de sangre antes y después del tratamiento en cada enfermedad, y examinamos las respuestas transcripcionales visto en las diferentes poblaciones de leucocitos de las enfermedades granulomatosas. Además se investigó la asociación en la sarcoidosis entre la actividad clínica y la heterogeneidad observada transcripcional sangre.
Métodos
Población de estudio y de inclusión Criterios
La mayoría de los pacientes con tuberculosis fueron reclutados del Royal Free hospital NHS Foundation Trust, Londres. Los pacientes con sarcoidosis fueron reclutados de Royal Free Hospital NHS Foundation Trust, de St Mary Hospital NHS Trust Imperial College, Barnet y Chase Farm NHS Trust de Londres, la sarcoidosis Clínica Oxford, Hospital Churchill, en Oxford, y el Hospital Avicena en París. Los pacientes con neumonía fueron reclutados de Royal Free Hospital, Londres. Los pacientes con cáncer de pulmón y 5 de los pacientes con tuberculosis en la prueba fueron reclutados por la Red de Colaboración Lyon, Francia. Todos los pacientes fueron reclutados consecutivamente durante el tiempo de tal manera que el conjunto de entrenamiento fue reclutado en primer lugar seguido por el equipo de prueba, la validación del conjunto y, por último, las muestras de los pacientes que fueron utilizados en la purificación de células. los datos de expresión de genes de sangre adicionales se obtuvieron de los pacientes con tuberculosis pulmonar y latentes reclutados y analizados en nuestro estudio anterior que fueron luego re-analizados en este estudio al comparar las respuestas antes y después del tratamiento de la tuberculosis [10].
Los criterios de inclusión eran específicos para cada enfermedad. los pacientes con tuberculosis pulmonar confirmada por cultivo:
Mycobacterium tuberculosis
, ya sea en el esputo o lavado broncoalveolar; sarcoidosis pulmonar: diagnóstico realizado por un especialista en la sarcoidosis, de granuloma en la biopsia, los resultados clínicos y radiológicos compatibles (dentro de los 6 meses de contratación) de acuerdo con las directrices WASOG [11]; adquirida en la comunidad pacientes con neumonía: cumplido con las directrices de la British Thoracic Society para el diagnóstico [12]; pacientes con cáncer de pulmón: el diagnóstico de un especialista en cáncer de pulmón, características histológicas y radiológicas compatibles con el cáncer de pulmón primario; controles sanos: su género, etnia y edad fueron similares a los, QuantiFERON-TB negativo Oro en tubo (QFT) (Cellestis) prueba pacientes. Los criterios de exclusión para todos los pacientes y controles sanos incluyen otros antecedentes de interés (incluyendo cualquier inmunosupresión, como la infección por VIH), menores de 18 años o embarazadas. Los pacientes fueron reclutados entre septiembre de 2009 y marzo de 2012. Los pacientes fueron reclutados antes de comenzar el tratamiento a menos que se indique lo contrario.
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación 3 London Central (09 /H0716 /41) y CPP Sud-Est IV, Francia, CCPPRB, Pitié-Salpêtrière, París. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito.
IFN lanzamiento de prueba del ensayo
Se realizó el ensayo QFT (Cellestis) según las instrucciones del fabricante.
perfiles de expresión génica
3 ml de sangre entera se recogieron en tubos de Tempus (Applied Biosystems /Ambion) por flebotomía estándar, mezcladas vigorosamente inmediatamente después de la recogida, y se almacena entre -20 y -80 ° C antes de la extracción de ARN. RNA fue aislado utilizando sangre total de 1,5 ml y la MagMAX-96 RNA Blood Kit de aislamiento (Applied Biosystems /Ambion) según las instrucciones del fabricante. 250 g de RNA total aislado se globina reducida utilizando el kit GLOBINclear 96 pocillos formato (Applied Biosystems /Ambion) según las instrucciones del fabricante. total integridad y la reducción de globina-ARN se evaluó utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). rendimiento del ARN se evaluó mediante un espectrofotómetro NanoDrop8000 (NanoDrop Products, Thermo Fisher Scientific). Biotinilado, de ARN complementario (cRNA) objetivos antisentido amplificado se prepararon entonces a partir de 200-250ng del ARN reducida globina-usando el kit de amplificación de ARN Illumina CustomPrep (Applied Biosystems /Ambion). 750 ng de ARNc marcado se hibridó durante la noche para Illumina humano HT-12 V4 matrices BeadChip (iluminación), que contenía más de 47.000 sondas. Los arrays se lavaron, se bloquearon, se tiñen y digitalizadas en un Illumina iScan, según las instrucciones del fabricante. GenomeStudio (Illumina) se utilizó entonces para llevar a cabo el control de calidad y generar valores de intensidad de señal.
Purificación de la célula y el procesamiento del ARN para Microarray
Toda la sangre se recogió en heparina sódica. células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) fueron separadas de los granulocitos /eritrocitos utilizando un gradiente de densidad Lymphoprep ™ (Axis-Shield). Los monocitos (CD14 +), se aislaron células T CD4 + (CD4 +) y células T CD8 + (CD8 +) secuencialmente a partir de las PBMCs utilizando anticuerpo acoplado (MACS) perlas de sangre entera magnéticas (Miltenyi Biotec, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los neutrófilos se aislaron de la capa de granulocitos /eritrocitos después de la lisis de glóbulos rojos seguido de perlas CD15 + MACS (Miltenyi Biotec, Alemania). El ARN se extrajo a partir de sangre entera (5 'Prime PerfectPure Kit) o poblaciones de células separadas (Qiagen RNeasy Mini Kit). integridad de ARN total y el rendimiento se evaluó como se describió anteriormente. Biotinilado, de ARN complementario (cRNA) objetivos antisentido amplificado se prepararon entonces a partir de 50 ng de RNA total usando los NuGEN WT-Ovation ™ ARN de amplificación y Encore Módulo BiotinIL (NuGEN Technologies, Inc). Amplificada de ARN se purificó usando el kit de purificación de Qiagen MinElute PCR (Qiagen, Alemania). entonces cRNA se trata como se ha descrito anteriormente.
Tratamiento de datos sin procesar
Los datos primarios fueron procesados mediante GeneSpring GX versión 11.5 (Agilent Technologies) y se aplicó la siguiente para todos los análisis. Después de la sustracción del fondo cada sonda se atribuyó una bandera para indicar su detección intensidad de la señal
p-valor
. Banderas se utilizan para filtrar los conjuntos de sonda que no resultaron en un "presente" llaman en al menos el 10% de las muestras, donde el "presente" de corte más bajo = 0,99. Los valores de señal A continuación, se establece en un nivel de umbral de 10, log2 transformado, y se normalizaron por el chip usando 75
º algoritmo de turno percentil. Siguiente normalización por-gen se aplicó dividiendo cada ARN mensajero transcrito por la intensidad media de todas las muestras. Todos los análisis estadísticos se realizó después de esta etapa. microarrays de datos en bruto se ha depositado en GEO (número de acceso GSE42834). Todos los datos recogidos y analizados en los experimentos se adhieren a la información mínima sobre un experimento de microarrays (MIAME) directrices.
Análisis de Datos
GeneSpring 11,5 se utilizó para seleccionar las transcripciones que muestran la variabilidad de la expresión de la mediana de todas las transcripciones (análisis no supervisado). Un filtro fue definida para incluir sólo las transcripciones que tenían por lo menos al doble cambios con respecto a la mediana y presente en ≥10% de las muestras. Se utilizó el análisis no supervisado para derivar las transcripciones-3422. La aplicación de un filtro estadístico no paramétrico (prueba de Kruskal Wallis con un FDR (Benjamini Hochberg) = 0,01), después de que el análisis no supervisado, las firmas generadas 1446 y 1396 de transcripción-transcripción. Las dos firmas diferían sólo en que los grupos se aplicó el filtro estadístico de ancho; 1446, cinco grupos (TB, sarcoidosis, neumonía, cáncer de pulmón y controles) y 1396, seis grupos (TB, sarcoidosis activa, no activa la sarcoidosis, neumonía, cáncer de pulmón y controles).
genes expresados diferencialmente para cada enfermedad se obtuvieron mediante la comparación de cada enfermedad a un conjunto de controles emparejados por etnia y género dentro de una diferencia del 10%. GeneSpring 11,5 se utilizó para seleccionar las transcripciones que se ≥1.5 veces diferente en la expresión de la media de los controles y estadísticamente significativa (Mann Whitney no apareado FDR (Benjamini Hochberg) = 0,01). Comparación Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Inc., Redwood, CA) se utilizó para determinar las vías canónicas más significativos asociados con los genes expresados diferencialmente de cada enfermedad con respecto a las otras enfermedades (exacta FDR de Fisher (Benjamini Hochberg) = 0,05). El eje x inferior y las barras de cada comparación gráfica IPA indican el registro (p-valor) y el eje x la parte superior y la línea indican el porcentaje de genes presentes en la vía.
distancia molecular para la salud (MDTH ) se determinó como se describe anteriormente [13], y luego se aplica a diferentes firmas transcripcionales. Se aplicó el análisis de modular la transcripción como se describe anteriormente [14]. Los niveles de expresión de todas las transcripciones primas detectado significativamente de fondo de hibridación se compararon entre cada muestra y todos los controles existentes en ese conjunto de datos. El porcentaje de genes expresados de manera significativa en cada módulo está representado por la intensidad del color (prueba t de Student,
p Hotel & lt; 0,05), el rojo indica la sobreexpresión y el azul indica subexpresión. El porcentaje medio de genes importantes y las veces el cambio promedio de estos genes en comparación con los controles en módulos especificados también se muestra en forma gráfica. MDTH y modular de análisis se calcularon en Microsoft Excel 2010. GraphPad Prism versión 5 para Windows fue utilizado para generar los gráficos.
genes expresados diferencialmente entre los pacientes con tuberculosis Conjunto de Entrenamiento y pacientes con sarcoidosis activas se obtuvieron mediante el análisis de la importancia microarrays (SAM) (
q Hotel & lt; 0,05) y ≥1.5 veces el cambio de expresión [15]. SAM se utilizó debido a la mayor sensibilidad de esta prueba no paramétrica en comparación con Mann-Whitney permitiendo transcripciones más expresados diferencialmente a ser identificados entre la tuberculosis y sarcoidosis activa. Clase de predicción se realizó dentro de GeneSpring 11.5 usando las máquinas de soporte algoritmo de vector de la máquina aprendido (SVM). El modelo se construye a partir de la muestra clasificadores TB "o" no TB '. El modelo SVM debe ser construido en un estudio de cohortes y correr en una cohorte independiente para evitar el exceso de ajuste de la firma predictivo. Esto fue posible para todas las cohortes de nuestro estudio. Cuando las cohortes del estudio utilizaron una plataforma de microarrays diferente del modelo SVM tuvo que ser reconstruido en esa cohorte. Para reducir los efectos de exceso de ajuste se utilizan siempre los mismos parámetros de SVM. El tipo de kernel utilizado fue iteraciones lineales, máximo 100.000, costó 100, relación de 1 y tipo de validación N-pliegue donde n = 3 con 10 repeticiones. La curva de funcionamiento del receptor (ROC) y el área bajo la curva (AUC) se calcularon utilizando Microsoft Excel 2010.
univariante y análisis multivariado de regresión se calcularon utilizando STATA 9 (StataCorp 2005. Statistical Software Stata: Release 9. Colegio estación, TX; StataCorp LP). En el análisis de regresión multivariante donde había desaparecido puntos de datos (ACE sérica y actividad de la enfermedad TCAR) para evitar el borrado lista sabia simulado se utilizó ajuste variable
.
Los cálculos de potencia se realizaron utilizando el software para análisis de potencia y tamaño de la muestra (PASS) 2008.
Resultados
perfiles de transcripción de sangre son similares en las enfermedades pulmonares granulomatosas, la tuberculosis y la sarcoidosis, pero distinta de la neumonía y cáncer de pulmón
las cohortes de la tuberculosis y la sarcoidosis , adquirida en la comunidad pacientes con neumonía y cáncer de pulmón, y controles sanos se muestran en la Tabla 1 y las Figuras S1-S3, y de manera apropiada corresponde demográficamente y clínicamente (Cuadros S1-2). El poder del estudio se calculó para un conjunto de entrenamiento (desviación estándar = 0,4, 3.000 sondas verdaderamente expresados diferencialmente, doble cambio de ≥1.5, muestra de dos t-test con FDR de 0,05). De ocho a 40 pacientes por grupo proporcionan una potencia de más de 0.85 para cada sonda (calculado usando el paso 2008) con un beneficio mínimo de aumentar el tamaño de la muestra.
análisis imparcial demostró que la tuberculosis y la sarcoidosis transcripcional de sangre perfiles agrupados juntos, pero claramente de la neumonía y el cáncer, que a su vez agrupados juntos (la serie de entrenamiento; transcripciones 3422, figura S4A). filtrado estadística generada 1446 transcripciones expresados diferencialmente (conjunto de entrenamiento, la figura S4B). Este patrón de agrupamiento se verificó en una cohorte independiente (Equipo de prueba, Figura 1), y no fue influenciado por el origen étnico o género (datos no mostrados). Pathway análisis (IPA) reveló que las muestras de tuberculosis y sarcoidosis se asociaron con abundancia excesiva de interferón (IFN) de señalización y de las vías de respuesta inmune (Figura 2). muestras de neumonía y cáncer de pulmón se asociaron con la sobreabundancia de vías vinculados con la inflamación. Todas las enfermedades mostraron un bajo-abundancia de vías de células T y B.
1446-transcripciones fueron expresadas diferencialmente en toda la sangre de los controles sanos conjunto de entrenamiento, los pacientes con tuberculosis pulmonar, pacientes con sarcoidosis pulmonar, pacientes con neumonía y cáncer de pulmón pacientes. La agrupación de las transcripciones 1446 se pusieron a prueba en una cohorte independiente de la que no se derivan de, el equipo de prueba. El mapa de calor muestra las transcripciones y los perfiles de los pacientes como Test Set organizado por el algoritmo no sesgada de la agrupación jerárquica sin supervisión. Una línea de puntos se añade al mapa de calor para ayudar a la visualización de las principales agrupaciones generadas por el algoritmo de agrupamiento. valores de intensidad de Transcripción se normalizan a la mediana de todas las transcripciones. transcripciones rojas son relativamente transcripciones sobre-abundantes y azules bajo-abundante. La barra de color en la parte inferior del mapa de calor indica a qué grupo pertenece el perfil.
Cada uno de los tres grupos dominantes de las transcripciones se asocia con diferentes grupos de estudio en el conjunto de entrenamiento. El grupo transcripción superior es excesivamente abundante en los pacientes con neumonía y cáncer y se asocia significativamente con las vías del PIA relacionadas con la inflamación (exacta de Fisher con Benjamini Hochberg FDR = 0,05). El grupo transcripción del medio es demasiado abundante en los pacientes con tuberculosis y sarcoidosis y se asocia significativamente con la señalización de IFN y otras vías de respuesta inmunitaria (IPA exacta de Fisher con Benjamini Hochberg FDR = 0,05). El grupo transcripción inferior está bajo-abundante en todos los pacientes y se asocia significativamente con las vías de IPA de células T y B (exacta Benjamini Hochberg FDR = 0,05) de Fisher.
La heterogeneidad de los perfiles de transcripción en la sarcoidosis pacientes se correlaciona con el fenotipo clínico
perfiles de transcripción de los pacientes con sarcoidosis agrupados ya sea con pacientes con tuberculosis o con los controles sanos (1446 transcripciones, Figura 1). Los pacientes fueron evaluados por lo tanto para la actividad de la enfermedad (etiquetado como activo o no activo) por un árbol de decisión pre-definido de un material compuesto de los parámetros clínicos que reflejan un perfil de instantánea de la actividad de la enfermedad en ese punto de tiempo (Figura S5; Tabla S3). Se encontraron 1396-transcripciones que se expresó diferencialmente utilizando esta clasificación sarcoidosis. Una vez más pacientes con sarcoidosis activos agrupados con los pacientes de tuberculosis, mientras que los pacientes con sarcoidosis no activos agrupados con los controles (1396 transcripciones, Figura 3A). Este fue validado en la Prueba de cohortes independientes y Validación Sets (Figura S6A & amp; B; Tabla S4A, S4B).
1396-transcripciones se expresan diferencialmente en la sangre total del conjunto de entrenamiento después de aplicar el análisis a lo largo de seis grupos que incluyen los dos fenotipos de pacientes con sarcoidosis. (A) Las transcripciones de 1396 y los perfiles de los pacientes conjunto de entrenamiento están organizados por la agrupación jerárquica sin supervisión. Una línea de puntos se añade al mapa de calor para aclarar las principales agrupaciones generadas por el algoritmo de agrupamiento. valores de intensidad de Transcripción se normalizan a la mediana de todas las transcripciones. (B) la distancia molecular para la salud de las transcripciones de 1396 en los conjuntos de entrenamiento y prueba demuestra la cuantificación de los cambios transcripcional en relación con los controles. La media, SEM y
p-
se muestran los valores (ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Tukey).
Aplicación de la distancia molecular para la salud (MDTH) algoritmo [13] para todos los grupos de enfermedades mostraron que la puntuación sarcoidosis MDTH no activo no era cuantitativamente significativamente diferente de los controles, mientras que la puntuación sarcoidosis MDTH activo fue (Figura 3B). Las puntuaciones de tuberculosis fueron significativamente más altas que las puntuaciones sarcoidosis, neumonía y las puntuaciones fueron significativamente más altas que las puntuaciones de cáncer de pulmón, neumonía y la tuberculosis que tiene las calificaciones más altas MDTH. En conjunto, esto sugiere una cuantitativa, así como diferencia cualitativa en las firmas de la transcripción de sangre.
Tres de minería de datos estrategias demostró que la tuberculosis y sarcoidosis activa están dominadas por los genes de IFN-inducible, Considerando neumonía y cáncer de pulmón están dominadas por los genes inflamatorios
además, investigó los procesos biológicos asociados a cada grupo de enfermedad, utilizando análisis modular, [14] genes, IPA, y la anotación de la parte superior expresados diferencialmente para cada grupo de enfermedad. modular de análisis, que tiene en cuenta todos los genes expresados diferencialmente frente a los controles, se verifica que la tuberculosis y la sarcoidosis activa mostró sobreexpresión significativa de los módulos de IFN en comparación con los otros grupos de enfermedades pulmonares (Figura 4A; conjunto de entrenamiento; Figura S7, Equipo de prueba), mientras que la neumonía y los pacientes de cáncer mostraron sobreexpresión significativa de los módulos de inflamación (Figura 2). los pacientes con TB mostraron un aumento cuantitativo significativo en el número de genes de IFN-inducible y su grado de expresión, en comparación con los pacientes con sarcoidosis activos (figuras 4B, 4C). La neumonía y cáncer de pulmón mostraron un aumento significativo en el número de genes presentes en los módulos de la inflamación y su grado de expresión, en comparación con la tuberculosis y la sarcoidosis activa (Figuras 4D, 4E). pacientes con neumonía mostraron un mayor número de genes presentes en el módulo de neutrófilos (Figura S8), en correlación con el recuento de neutrófilos en la sangre (correlación de Spearman, r = 0,42,
p Hotel & lt; 0,0001).
( a) los niveles de expresión genética de todas las transcripciones que se detectaron de manera significativa en comparación con la hibridación de fondo (15212 transcripciones,
p Hotel & lt; 0,01) se compararon en el entrenamiento conjunto entre cada grupo de pacientes: la tuberculosis, la sarcoidosis activa, no activa sarcoidosis, neumonía, cáncer de pulmón, con los controles sanos. Cada módulo corresponde a un conjunto de genes co-regulados que fueron asignadas funciones biológicas mediante imparcial perfiles literatura. Un punto rojo indica significativa sobre-abundancia de las transcripciones y un punto azul indica significativa bajo-abundancia (p & lt; 0,05). La intensidad de color se correlaciona con el porcentaje de genes en ese módulo que se expresan diferencialmente de manera significativa. El análisis modular también se puede representar en forma gráfica como se muestra en (B) - (E), incluyendo muestras tanto de la formación y de prueba. La media, SEM y
p-
se muestran los valores (ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Tukey). (B) El porcentaje de genes sobreexpresados significativamente en los 3 IFN módulos para cada enfermedad. (C) El factor de cambio de la expresión de los genes presentes en los módulos de IFN en comparación con los controles. (D) El porcentaje de genes sobreexpresados significativamente en los módulos 5 de la inflamación para cada enfermedad. (E) El factor de cambio de la expresión de los genes presentes en los módulos de inflamación en comparación con los controles.
Comparación de IPA, utilizando genes que son expresados diferencialmente entre cada grupo de enfermedad y un conjunto combinado de los controles , reveló las vías más significativas cuando se comparan a través de las enfermedades (≥1.5 veces el cambio de los controles, Mann Whitney Benjamini Hochberg
p Hotel & lt; 0,01; TB = 2524, sarcoidosis activa = 1391, 2801 = neumonía y cáncer de pulmón = 1626 transcripciones). Los cuatro primeros vías importantes estaban relacionadas con la síntesis de proteínas (de señalización eIF2), la respuesta inmune, la señalización de IFN, los receptores de reconocimiento de patrones que reconocen las bacterias y los virus, y la presentación de antígeno (Figura 5A y la Tabla S11). Sub-abundancia de la vía de señalización eIF2 fue impulsado por los pacientes con neumonía. Otros genes relacionados con la síntesis de proteínas (proteínas ribosomales y otros factores de iniciación eucarióticos) y la respuesta de la proteína desplegada (una respuesta de estrés a la síntesis de proteínas en exceso), fueron también significativamente menores de abundante en los pacientes con neumonía por ejemplo, PERK, CHOP, ABCE1 (datos no mostrados). La significación estadística (eje x inferior, gráfico de barras, Figura 5A) y el porcentaje de genes (arriba eje x, gráfico de línea, Figura 5A) de las tres vías de respuesta inmune fueron impulsados principalmente por los pacientes con tuberculosis y sarcoidosis activa, demostrando de nuevo la similitud de las vías biológicas subyacentes de estas enfermedades. Sin embargo, la vía de señalización de IFN-fue más significativa (Figura 5A) y contenía un mayor número de genes de tuberculosis que la sarcoidosis activa (Figura 5B).
genes expresados diferencialmente se derivan del conjunto de entrenamiento mediante la comparación de cada enfermedad a controles sanos emparejados por sexo y origen étnico: TB = 2524, sarcoidosis activa = 1391, el cáncer de la neumonía = 2801 = 1626 y pulmón transcripciones (≥1.5 veces el cambio de la media de los controles, Mann Whitney con Benjamini Hochberg FDR = 0,01). (A) IPA vías canónicas se utilizó para determinados las vías más importantes (I-IV) asociados a cada enfermedad con respecto a las otras enfermedades (exacta de Fisher con Benjamini Hochberg FDR = 0,05). El eje x inferior y barras de cada gráfico indica el log (p-valor) y el eje x la parte superior y la línea indica el porcentaje de genes presentes en la vía. Los genes en la vía de señalización eIF2 son predominantemente bajo-abundante genes sin embargo, los genes en los otros tres vías son predominantemente sobre-abundante en relación a los controles. Vías por encima de la línea de puntos azules son significativas (p & lt; 0,05). (B) La vía de señalización de IFN IPA se superpone a cada grupo de enfermedad. genes de color se expresan diferencialmente en ese grupo de enfermedad en comparación con sus controles de la misma (exacta de Fisher FDR = 0,05). rojas representan los genes sobre-abundancia y verde bajo-abundancia. La vía para la tuberculosis se amplía de modo se muestra el detalle de los genes puede verse, también se muestra de nuevo en una escala mucho menor y además de otras enfermedades por lo que una comparación visual se puede hacer más fácilmente.
los 50 mejores transcripciones sobre-expresados diferencialmente abundantes para cada enfermedad se correlacionó con los resultados del análisis modular e IPA donde la tuberculosis y la sarcoidosis activa fueron dominados por los genes de IFN-inducible por ejemplo, IFITM3, IFIT3, GBP1, GBP6, CXCL10, OAS1, STAT1, IFI44L, FCGR1B (cuadro S5). Nuevamente, estas fueron mayores en número en tuberculosis que la sarcoidosis. La parte superior 50 sobre-abundantes transcripciones de neumonía fueron dominados por los genes relacionados con neutrófilos antimicrobianos por ejemplo elane, DEFA1B, MMP8, CAMP, DEFA3, DEFA4, MPO, LTF. Los genes FCGR1A, B y C fueron excesivamente abundante en las 50 transcripciones de las cuatro enfermedades pulmonares. Un diagrama de Venn-4 conjunto de los genes expresados diferencialmente demostró genes únicos para cada grupo de enfermedad (Figura S9 y Tabla S6), con más de tres veces el número de genes únicos de TB que los genes únicos activos sarcoidosis. Los genes únicos TB comprendidas la respuesta inmune genes asociados significativamente con la vía de señalización de IFN-y presentación de antígenos. Los genes neumonía únicas se asociaron con un bajo-abundancia de vías relacionadas con la síntesis de proteínas. Los genes únicos del cáncer de pulmón se asociaron con la sobreabundancia de vías relacionadas con la inflamación y bajo-abundancia de vías de células T. La superposición de genes comunes a los cuatro grupos de enfermedades se asociaron significativamente con bajo-abundancia de vías de células T y B.
tuberculosis y la neumonía pacientes después del tratamiento mostraron una disminución de los perfiles de transcripción Mientras que la sarcoidosis pacientes que responden a glucocorticoides mostró un aumento significativo en la actividad transcripcional
a continuación examinó la respuesta transcripcional a tratamiento. pacientes con neumonía, seguidos por lo menos 6 semanas después de su alta hospitalaria, mostraron una buena respuesta clínica al tratamiento estándar con antibióticos (Tabla S7A) y una disminución en sus perfiles de transcripción al nivel de los controles mediante análisis modular (todas las transcripciones detectables) y MDTH (1446-transcripciones) (Figura 6 A & amp; 6b). El MDTH de los 1446-transcripciones obtenidas en el presente estudio de diferentes enfermedades pulmonares, también se vio disminuida en la sangre de pacientes con TB de Sudáfrica al terminar el tratamiento, volviendo a la firma de los controles de tuberculosis latente (Figura 6C) y el apoyo a nuestro informe anterior [10].
(A) análisis modular.