Extracto
RBP2 se ha encontrado para participar activamente en la progresión del cáncer. Inhibe la senescencia de las células cancerosas, media la proliferación de células cancerosas y promueve la metástasis del cáncer. También es esencial para la tolerancia a las drogas. Sin embargo, los efectos de RBP2 en la transición epitelio-mesenquimal son todavía desconocidos. En este estudio, se analizaron los efectos de RBP2 en la transición epitelio-mesénquima en el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Los resultados mostraron que RBP2 el regulado de la expresión de E-cadherina mediante la inhibición de la actividad del promotor de E-cadherina y regulado hasta la expresión de N-cadherina y caracol través de la activación de la señalización de Akt, y la sobreexpresión de epithelial- RBP2 inducida mesenquimal de las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas. Nuestro estudio indica además thatRBP2 puede ser un objetivo potencial para la terapia contra el cáncer de pulmón
Visto:. Wang S, Wang Y, Wu H, Hu L (2013) RBP2 induce la transición epitelio-mesenquimal de células no pequeñas Cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (12): e84735. doi: 10.1371 /journal.pone.0084735
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Agosto, 2013; Aceptado: 19 Noviembre 2013; Publicado: December 20, 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong [Z2005C02]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la causa más común de mortalidad por cáncer, y su morbilidad está aumentando en todo el mundo [1]. Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa el 85% de todos los cánceres de pulmón. Desafortunadamente, muchos pacientes con CPNM desarrollar metástasis a distancia durante la etapa temprana de la enfermedad. Por otra parte, la mortalidad entre los pacientes con CPNM es más a menudo causada por la metástasis en lugar de sus tumores primarios. Por lo tanto, la detección temprana y la prevención de la metástasis es un paso clave en la detención de la progresión del NSCLC [2].
Retinoblastoma proteína 2 de unión (RBP2) se identificó originalmente como una proteína crítica retinoblastoma (pRb) proteína de unión [3]. En 2007, se encontró por primera RBP2 ser un desmetilasa histona de tri- y lisina dimethylated 4 de la histona H3 (H3-K4me2 y H3K4me3) [4,5]. Es ampliamente aceptado que la histona metilación es muy importante para la expresión de diversos genes y desempeña papeles importantes en la progresión del cáncer [6-8]. metilación aberrante contribuye a la proliferación excesiva de las células y la tumorigénesis, y el estado H3K4me0 está altamente correlacionado con mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama [9]. Como desmetilasa histona, RBP2 participa activamente en la progresión del cáncer. Sin embargo, a diferencia de otras enzimas modificadoras de histonas, RBP2 se puede unir directamente el ADN diana. Tiene un dominio de interacción rica en AT (áridos) que reconoce específicamente la secuencia de ADN CCGCCC [10]. Esta secuencia de ADN especial se enriquece en las regiones promotoras de los genes diana RBP2. En el cáncer gástrico, RBP2 se une a las regiones promotoras de la p16
INK4a, p21
CIP1 y p27
Kip1 genes para inhibir sus expresiones y disminuir la senescencia de las células del cáncer [11]. En el cáncer de pulmón, RBP2 se une a la región promotora de p27, ciclina D1 y la integrina beta 1 para mediar la proliferación de células de cáncer y la metástasis [12]. En este estudio, se analizaron los efectos de RBP2 en la transición epitelio-mesenquimal (EMT) en el CPNM.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
se obtuvieron información y muestras de pacientes
con el consentimiento informado por escrito. Cada paciente en este estudio dieron su consentimiento informado por escrito para publicar estos detalles del caso. La investigación fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Qilu.
Los pacientes
Los especímenes de cáncer de pulmón (n = 61) y distantes tejidos pulmonares normales (n = 47, 5 cm del margen del cáncer de pulmón) se obtuvieron de pacientes con NSCLC en Qilu el hospital entre 2007 y 2008. Los tejidos fueron almacenadas a -80 ° C hasta su uso. Todas las muestras eran de pacientes que no habían sido sometidos a radioterapia o quimioterapia preoperatoria. La puesta en escena patológica de los 61 pacientes se realizó de acuerdo con el sistema de nodo metástasis tumoral (TNM) [13].
La inmunohistoquímica
Las muestras de tejido fueron incluidos en parafina. Las secciones se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en un gradiente de etanol. Después se recuperaron los antígenos, las secciones se trataron con 3% de H
2O
2 durante 10 min, seguido por 5% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 30 min. A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios contra RBP2 (dilución 1: 250), E-cadherina (dilución 1: 200), N-cadherina (dilución 1: 200) o un caracol (dilución 1: 200) durante la noche a 4 ° C , y se añadieron anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, CA, EE.UU.) durante 1 hora a 37 ° C. La visualización de la unión del anticuerpo se realizó mediante tinción con DAB. Los núcleos se tiñeron con hematoxilina. Los resultados de inmunotinción fueron evaluados de forma independiente por dos patólogos. El porcentaje de las células cancerosas positivas se estimó de acuerdo con los siguientes criterios: 0 = no positiva células cancerosas, 1 = & lt; 10% positivas las células cancerosas, 2 = 10% de células cancerosas -35% positivos, 3 = 35% -75% de células cancerosas positivas y 4 = & gt; 75% de células de cáncer positivas. La intensidad de la tinción se estimó de acuerdo con los siguientes criterios: 1 = no tinción, 2 = tinción de color amarillo claro (tinción débil), 3 = tinción amarilla (tinción intermedia) y 4 = tinción marrón (fuerte tinción) [14]. El marcador final fue igual a la puntuación zona y la puntuación de intensidad [15]. Una tinción cuenta final ≥ 4 se definió como la sobreexpresión, y una puntuación & lt tinción final; 4 se definió como nonoverexpression [15].
Cultivo celular, el ARN de interferencia y Gene sobreexpresión
El cáncer de pulmón de células A549 líneas humana y SK-MES-1 y la línea de células del epitelio bronquial humano Beas2B se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). células Beas2B y A549 se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2 en medio RPMI-1640 (Sigma, Santa Clara, CA, USA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Gibico, Carlsbad, CA, ESTADOS UNIDOS). Los SK-MES-1 en las células se cultivaron en MEM (Gibico, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% FBS. Cuando se analizaron los efectos de señalización Akt en la expresión de N-cadherina y caracol, las células A549 fueron tratados con 24 mM inhibidor de PI3K (LY294002) (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.) durante 24 h. Para la interferencia de ARN y la sobreexpresión del gen, las células se cultivaron en placas de 6 pocillos (1,0 x 10
5 células /pocillo) durante la noche, seguido de la transfección con 5 l de RBP2 siRNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) o 2 g del plásmido pcDNA3-HA-RBP2 (un generoso regalo de WG Kaelin) con 5 l de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.); las células se cultivaron luego durante 48 h. Las siguientes secuencias de siRNA se utilizaron en este estudio: RBP2 siRNA1 5'-AAUAUCCAGGGCCUUCAUGUAGCCC-3 '; RBP2 siRNA2 5'-UUGUGUACUCGUCAAACUCUACUCC-3 '; RBP2 siRNA3 5'-UUAACAUGCCGGUUAUCCAGGCUCU-3 '; siRNA control 5'-UUCUCCGAAGGUGUCACGUTT -3 '. El siRNA RBP2 que podría agotar más eficaz RBP2 se utilizó en los siguientes experimentos.
La extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR
El ARN total de las muestras de tejidos y líneas celulares se aisló utilizando el Trizol reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). cDNA fue sintetizado utilizando la primera hebra de cDNA Kit de síntesis (Thermo, San Jose, CA, EE.UU.). Para el análisis de PCR en tiempo real, los ADNc fueron amplificados utilizando SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, Otsu, Shiga, Japón) y se detectaron utilizando un Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. la expresión génica relativa se normalizó a la expresión de la β-actina y se calculó utilizando la 2
- método de [16] (△△ CT). Los siguientes cebadores se utilizaron en este experimento: β-actina adelante 5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 'y 5'-revertir AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'; RBP2 adelante 5'-GCTTGGCAATGGG AACAAAA-3 'y revertir 5'-CCGTTGTCTCATTTGCATGTTAA-3'.
Western Blot
proteínas celulares totales se extrajeron usando tampón de lisis Radio Immunoprecipition ensayo, y 50 g de proteínas totales se utilizó para el análisis de transferencia Western. Las membranas de difluoruro de polivinilideno se sondearon con anticuerpos contra β-actina (dilución 1: 1000), RBP2 (dilución 1: 1000), E-cadherina (dilución 1: 1000), N-cadherina (dilución 1: 1000), caracol (1 : 1000 dilución), p-Akt (dilución 1: 1000) o Akt (1: 1000 dilución) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.), seguido de incubación con una peroxidasa de rábano picante anti-conejo (HRP) conjugado inmunoglobulina G (IgG) (dilución 1: 2000). Las transferencias se desarrollaron posteriormente utilizando el método de quimioluminiscencia potenciada (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). La señal de β-actina se utilizó como control.
inmunofluorescencia
células A549 se cultivaron en una placa de 96 pocillos y se transfectaron con ARNsi RBP2 para 48 h. A continuación, las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100, y se incubaron con anticuerpos primarios contra RBP2 (1: 250 dilución) o E-cadherina (dilución 1: 200) durante 1 hora a 37 ° C . Las células fueron incubadas con anticuerpos secundarios conjugados con FITC (Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, CA, EE.UU.) durante 30 minutos a 37 ° C. Las imágenes fluorescentes fueron capturados utilizando un microscopio láser confocal de barrido
Transwell invasión Ensayos
membranas
Transwell (8 micras de tamaño de poro, de 6,5 mm de diámetro; Corning, Tewksbury, MA, EE.UU.). Eran pre revestido con matrigel (1 g /ml, se diluyó con medio RPMI-1640 sin suero). Después de la interferencia de ARN o tratamiento sobreexpresión de genes durante 48 h, 1,0 × 10
5 células en 200 l de medio RPMI-1640 sin FBS se colocaron en las cámaras superiores. Después, se añadieron 500 l de medio RPMI-1640 con FBS al 10% a la cámara inferior. Después de 12 h, las células en la superficie superior de las membranas transwell se retiraron mediante un hisopo de algodón. Las células que invadieron a través de la membrana a la superficie inferior se fijaron con metanol y se tiñeron con eosina. Se contaron las células bajo un microscopio óptico.
Wound Healing Ensayos
ensayos de cicatrización de la herida se realizaron como se informó anteriormente [17]. Brevemente, las células se transfectaron y se cultivaron durante 48 h y se dejaron crecer a una monocapa de células confluente. A continuación, una lineal '' herida '' fue dibujado en la monocapa de células con una punta de pipeta de plástico. Las células se incubaron a 37 ° C, y la herida fue fotografiada inmediatamente y monitorizados después de 24 h. La distancia entre los dos márgenes de la "herida" se calculó.
Los ensayos de luciferasa
A549 células fueron transfectadas con siRNA RBP2 el día 1 y con la E-cadherina promotor reportero plásmido (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) el día 2. Para controlar la transfección eficiencia, un control de Renilla luciferasa reportero plásmido controlado por el promotor de la timidina quinasa se cotransfectaron en las células. células Beas2B se cotransfectaron con el plásmido pcDNA3-HA-RBP2 y los dos plásmidos indicadores anteriores. Después de 48 h, un sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega, Madison, WI, EE.UU.) se utilizó para determinar la actividad luciferasa. El plásmido reportero de E-cadherina tenía la misma secuencia del promotor (-799 a -579) que se describió anteriormente [18].
Análisis estadísticos
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el SPSS17.0 software. Se utilizó la χ
2 de prueba para analizar la relación entre las características clínico-patológicos y la expresión RBP2. correlaciones bivariadas entre RBP2, E-cadherina, N-cadherina y el caracol también fueron analizados por la χ
2 test. Otros análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba t de Student. Los datos se muestran como la media ± SD de 3 ensayos independientes. Una diferencia estadísticamente significativa se considera cuando
P Hotel & lt; 0.05.
Resultados
Relaciones entre RBP2 y las características clinicopatológicas de NSCLC
Para estudiar el papel de los RBP2 en el cáncer de pulmón, se detectó por primera vez la expresión de RBP2 en los tejidos de NSCLC y sus tejidos normales usando inmunohistoquímica (Figura 1A) correspondiente. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Las muestras que sobreexpresan RBP2 representaron el 52,46% de las muestras de cáncer, y la mayoría de estas muestras mostraron intermedia a una fuerte tinción. Sin embargo, las muestras con sobreexpresión RBP2 representaron sólo el 29,79% de los tejidos pulmonares normales adyacentes, y la mayoría de estas muestras mostraron tinción débil para intermedio. La expresión de RBP2 fue significativamente mayor en las muestras de NSCLC que la de los tejidos pulmonares normales (Tabla 1). Los niveles de RBP2 en 10 tejidos de cáncer de pulmón y sus tejidos pulmonares normales correspondientes se detectaron más mediante Western blot y análisis en tiempo real PCR. Los resultados mostraron que tanto la proteína RBP2 y el ARNm se incrementaron en los tejidos de cáncer de pulmón (Figuras 1B y 1C amp;).
A. El análisis de Immunohistochemistrical RBP2, E-cadherina, N-cadherina y el caracol (aumento x 200). RBP2, N-cadherina y el caracol fueron fuertemente positivas en ambas muestras adenocarcinoma y carcinoma escamoso, mientras que la E-cadherina fue débilmente manchados o sin teñir. El análisis de transferencia Western B. de la proteína RBP2. N = tejido pulmonar normal, C = tejido de cáncer de pulmón. C. en tiempo real PCR análisis de RBP2 ARNm. El nivel de ARNm RBP2 fue mayor en los tejidos de cáncer de pulmón que en los tejidos pulmonares normales (
P = 0,0011)
. *
P Hotel & lt; 0,05 y **
P Hotel & lt; 0.01.
variable n
sobreexpresión * (n)
tasa sobreexpresión (%)
χ
2
P
cáncer tissue613252 . .465.5810.018Adjacent tissue471429.79Table 1. Expresión de RBP2 en los tejidos de NSCLC y sus tejidos normales adyacentes
*: tinción cuenta final ≥ 4 se definió como la sobreexpresión, y una puntuación & lt tinción final; 4 se definió como nonoverexpression. Descargar CSV CSV
A continuación, se analizó la relación entre RBP2 y "características clínico-patológicos, incluyendo los pacientes de los pacientes de edad, sexo, tipo patológico, la diferenciación y la clasificación TNM. Los resultados mostraron que no había una clara asociación entre la sobreexpresión de RBP2 y estas características (Tabla 2).
RBP2 (sobreexpresión *) guía empresas Variable Nº
de los pacientes sin
sí
P
Age0.099≤50 years321220 & gt; 50 years291712Gender0.167Male331320Female281612Pathological type0.757Squamous371720Adeno241212Differentiation0.532Well1064Moderate261313Poor251015T classification0.415T1-2411823T3-420119N classification0.533N0291514N1321418Table 2 .. la correlación de las variables clinicopatológicas con la proteína en los tejidos de NSCLC RBP2
*: tinción cuenta final ≥ 4 se definió como la sobreexpresión, y una puntuación & lt tinción final; 4 se definió como nonoverexpression. Descargar CSV CSV
Efectos de RBP2 en NSCLC migración celular
Para explorar el papel de RBP2 en la metástasis del cáncer de pulmón, se investigó si RBP2 regula la migración celular. En primer lugar, se detectó la inhibición de la RBP2 por los tres siRNAs RBP2 en las células A549 para elegir el siRNA más eficaz. El análisis de transferencia Western mostró que el nivel de proteína RBP2 fue alta en las células de control A549 y disminuyó después de la interferencia de ARN de RBP2. Es importante destacar que, el grupo RBP2 siRNA2 exhibió la expresión más baja de proteína RBP2 (Figura 2A). Además, la expresión de RBP2 en el grupo RBP2 siRNA2 fue detectada por el análisis de inmunofluorescencia. Los resultados mostraron que RBP2 fue negativa en el grupo de RBP2 siRNA2 pero positiva en el grupo de control (Figura 2B). Por lo tanto, elegimos RBP2 siRNA2 para el agotamiento de RBP2 en los siguientes experimentos. A continuación, los comportamientos migratorios celulares de las células A549 y células Beas2B fueron estudiadas a través transwell ensayo de invasión y la cicatrización de heridas ensayo. En comparación con el grupo control, un menor número de células A549 pasaron por el matrigel después de deleption RBP2 mientras más células Beas2b pasado cuando RBP2 fue hasta reguladas (Figuras 3A y 3B amp;). Consistentemente, había un menor número de células A549 que migraron desde el borde "herida" al espacio central cuando se reguló hacia abajo RBP2, pero el número de células Beas2b migrado se incrementó significativamente después de la sobreexpresión de RBP2 (Figuras 3C & amp; 3D). Estos datos indicaron que RBP2 probablemente juega un papel en la migración celular.
A. Los niveles de proteína RBP2 en las células A549 tratadas por separado con diferentes siRNAs. B. Análisis de inmunofluorescencia de RBP2 en células A549 no tratadas y células tratadas con RBP2 siRNA2 (aumento x 200).
A. análisis de invasión Transwell (aumento x 200). B. El número de células invadidas. Más células Beas2B invadieron después de la transfección con el plásmido pcDNA3-HA-RBP2 (
P
= 0,0011), mientras que el número de células A549 invadidos disminuyó significativamente cuando se tratan con RBP2 siRNA2 (
P = 0,0005
). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P Hotel & lt; 0.001. C. El número de células migradas. El número de células migradas Beas2B aumentó significativamente cuando se transfectan con el plasimid pcDNA3-HA-RBP2 (
P
= 0,0010), mientras que un menor número de células A549 migrado en el espacio central cuando transfectadas con RBP2 siRNA2 (
P
= 0,0014). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P Hotel & lt; 0.001. D. Heridas ensayos de curación (aumento x 100).
correlaciones bivariadas de RBP2 con E-cadherina, N
-
cadherina o un caracol en los tejidos de NSCLC
Para investigar el papel de los RBP2 en la metástasis del cáncer, nos estudiaron el efecto de RBP2 en EMT, como EMT está estrechamente correlacionado con la metástasis del cáncer [19]. En primer lugar, la E-cadherina, N-cadherina y el caracol se detectaron en los tejidos de cáncer de pulmón y sus tejidos pulmonares normales mediante inmunohistoquímica (Figura 1A) correspondiente. La tasa de las muestras que sobreexpresa E-cadherina se redujo en los tejidos de cáncer en comparación con sus tejidos normales adyacentes (normal vs cáncer, 80,85% vs 40,98%,
P
& lt; 0,01), pero la tasa de las muestras que sobreexpresa N-cadherina o un caracol aumentado en los tejidos de cáncer (normal vs cáncer, N-cadherina, 12,77% vs 72,13%,
P
& lt; 0,01; la normalidad vs cáncer, caracol, 17,02% vs 68,85%,
P Hotel & lt; 0,01). Posteriormente, las correlaciones bivariadas de RBP2 con cada una de estas tres proteínas fueron analizadas por el χ
2 test. Los resultados mostraron que la expresión de RBP2 fue significativamente inversamente correlacionada con la expresión de E-cadherina (Tabla 3), pero no hubo una asociación significativa entre RBP2 y N-cadherina o un caracol (Tabla 3).
RBP2 (sobreexpresión *)
Variable Nº de patients
no
yes
P
E-cadherin0.032overexpression*25169nonoverexpression*361323N-cadherin0.095overexpression*441826nonoverexpression*17116Snail0.276overexpression*421824nonoverexpression*19118Table . 3. Las correlaciones entre RBP2 y E-cadherina, N-cadherina y el caracol en los tejidos de NSCLC
*: Una última tinción puntuación ≥ 4 se definió como la sobreexpresión, y una puntuación de tinción & lt final; 4 se definió como nonoverexpression. Descargar CSV CSV
Efectos de RBP2 de EMT en líneas celulares de cáncer
Para confirmar aún más los efectos de RBP2 en la EMT, se detectó la expresión de RBP2, E-cadherina, N-cadherina y el caracol en el Beas2B las células, las células A549 y células SK-MES-1 mediante Western blot y análisis en tiempo real PCR. El análisis de transferencia Western mostró que la expresión de RBP2, N-cadherina y caracol aumentó, mientras que la expresión de E-cadherina se redujo en las células transfectadas Beas2B con el plásmido pcDNA3-HA-RBP2 (Figura 4A). Mientras tanto, tanto el A549 y las células SK-MES-1 mostraron niveles más bajos de RBP2, N-cadherina y proteínas de caracol y el nivel más alto de proteína E-cadherina cuando transfectadas con RBP2 siRNA2 (Figura 4A). Del mismo modo, en tiempo real el análisis de PCR mostró además que la RBP2, N-cadherina y caracol mRNAs aumentó y el nivel de E-cadherina mRNA disminuyó en las células Beas2B tratados con el plásmido pcDNA3-HA-RBP2 (Figura 4B). Además, se observaron niveles más bajos de RBP2, N-cadherina y ARNm de caracoles y un mayor nivel de E-cadherina ARNm tanto en el A549 y células SK-1 MES-que fueron tratados con RBP2 siRNA2 (Figura 4C).
A. Western blot de RBP2, E-cadherina, N-cadherina y caracol expresión en los Beas2B, SK-MES-1 y células A549. Cuando las células Beas2B se transfectaron con el plásmido pcDNA3-HA-RBP2, los niveles de RBP2, las proteínas N-cadherina y caracol aumentaron, y el nivel de proteína E-cadherina disminuyeron. Cuando las células SK-MES-1 y A549 fueron transfectadas con RBP2 siRNA2, los niveles de RBP2, N-cadherina y proteínas caracol se aumentaron, y el nivel de proteína E-cadherina disminuyeron. B. Análisis en tiempo real de los niveles de E-cadherina, N-cadherina y ARNm de caracoles en las células Beas2B. El nivel de E-cadherina mRNA fue mayor en las células Beas2B tratados con el plásmido pcDNA3-HA-RBP2 que en las células de control (Beas2B
P
= 0,0005), pero los niveles de N-cadherina y ARNm de caracol fueron más bajos (N-cadherina,
P = 0,0063
; caracol,
P = 0,0101
). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P Hotel & lt; 0.001. C. Análisis en tiempo real de los niveles de E-cadherina, N-cadherina y caracoles ARNm en las células A549. El nivel de E-cadherina ARNm fue menor en las células A549 tratadas con RBP2 siRNA2 que en las células de control A549 (
P = 0,0007)
, pero los niveles de N-cadherina y caracoles ARNm fueron mayores (N- cadherina,
P = 0,0037
; caracol,
P = 0,0014
). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P Hotel & lt; 0.001.
Efectos de RBP2 en el promotor de la E-cadherina
Debido a Huang et al. confirmó que RBP2 podría unirse directamente a la región del promotor (-799 a -579) de E-cadherina [18] utilizando un ensayo CHIP, se analizó la actividad de la misma región promotora E-cadherina usando un ensayo de luciferasa en el A549 y Beas2B Células. Cuando las células A549 se transfectaron con RBP2 siRNA2, la actividad del promotor de E-cadherina aumentó significativamente (Figura 5A), mientras que la actividad del promotor de E-cadherina se redujo drásticamente después de la sobreexpresión en células RBP2 Beas2B (Figura 5B).
A. la actividad del promotor de cadherina E Eelevated en las células A549 transfectadas con RBP2 siRNA2 (
P = 0,0098
). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0.01. B. La inhibición de la actividad del promotor en las células Beas2B transfectadas con el plásmido pcDNA3-HA-RBP2 (
P
= 0,0075). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0.01. C. La expresión de proteínas p-AKT y AKT en las células A549 tratadas con RBP2 siRNA2. D. Los niveles de P-Akt, proteínas N-cadherina y caracoles en las células A549. Cuando las células A549 se trataron con LY294002, se redujo la expresión de estas tres proteínas
Efectos de RBP2 en N
-.
Cadherina y caracol
Tanto N- cadherina y caracol se han demostrado para ser el de aguas abajo de la vía PI3K /Akt [20,21]. Por lo tanto, la hipótesis de que RBP2 regulada N-cadherina y caracol través de la activación de la señalización de Akt, y se examinaron los niveles de p-Akt y Akt en las células A549 utilizando el análisis de western blot. Los resultados mostraron que la proteína p-Akt fue alta en las células A549 y la disminución después del agotamiento de RBP2 (Figura 5C). La expresión de p-Akt se correlacionó positivamente con la expresión de RBP2. A continuación, para confirmar los efectos de Akt de señalización en la expresión de N-cadherina y caracol, se trataron células A549 con un inhibidor de PI3K (LY294002) durante 24 h y examinaron los niveles de la N-cadherina y proteínas caracol. LY294002 se ha demostrado que bloquear la actividad de fosforilación y la quinasa Akt dependiente de PI3K. Curiosamente, los niveles tanto de N-cadherina y el caracol se redujo (Figura 5D). Por lo tanto, la expresión de N-cadherina y el caracol se asoció positivamente con la expresión de p-Akt.
Discusión
RBP2, un desmetilasa histona recientemente identificado, pertenece a la familia Jarid y posee una áridas (Un dominio de interacción rica /T). A menudo ocupa y regula los promotores de varios genes que contienen la H3K4me3 [5,22]. Más importante aún, RBP2 se cree que participar en muchas funciones biológicas de células, sobre todo en la biología del tumor. Nuestro estudio revela una nueva visión de la fisiopatología de la EMT, y aportar pruebas de que RBP2 induce EMT en NSCLC.
RBP2 juega un papel importante en el cáncer humano. Por ejemplo, la sobreexpresión de RBP2 inhibe la senescencia de las células de cáncer gástrico [11]. El agotamiento de RBP2 deteriora la proliferación, sino que promueve la senescencia y la diferenciación en ratones que carecen Men1 y Rb1 [23]. tolerancia a las drogas de células de cáncer de pulmón requiere RBP2 [24]. Desmontables de RBP2 condujo a un aumento de los niveles de H3K4me3 a los promotores de la DAF y los genes en las células HMOX1 Beas2B [25]. RBP2 hasta regula la expresión de ciclina D1, ciclina E1 y la integrina beta 1 para mejorar la proliferación celular, la migración y la invasión [12]. En este trabajo, también se detectó la expresión de RBP2 NSCLC en los tejidos y se analizaron las relaciones entre RBP2 y cada una de las características clinicopatológicas de NSCLC. Los resultados mostraron que RBP2 se sobreexpresa en NSCLC humano, pero no hubo una relación significativa entre la sobreexpresión de RBP2 y cada rasgo clínico-patológica. Además, se estudiaron los efectos de RBP2 sobre la migración de las células de cáncer de pulmón, y se encontró que RBP2 podría mejorar CPNM la migración celular. Todos estos datos sugieren que RBP2 es un oncogén y proporcionar una guía para el tratamiento del cáncer.
EMT es un paso fundamental en la metástasis del cáncer. Durante este proceso, las células cancerosas derivadas de células epiteliales pierden sus características epiteliales, tales como la adhesión celular, pero adquieren características mesenquimales, tales como la motilidad celular, para escapar del tejido primario e invadir el estroma circundante [26-30]. Epitelial cadherina (E-cadherina), una molécula de adhesión celular, es una molécula clave de EMT. Desempeña un papel vital en el mantenimiento del fenotipo epitelial. La ausencia de E-cadherina conduce a una pérdida de la morfología epitelial [31]. Curiosamente, la reducción de la expresión de E-cadherina es a menudo acompañado por un aumento de la expresión de cadherina neural (N-cadherina) [32]. N-cadherina se ha demostrado para debilitar la adhesión celular y la promoción de la invasión de células de cáncer de mama [32,33]. Caracol es otra molécula importante de la EMT. Se ha confirmado que la sobreexpresión caracol mejora la invasión del cáncer mediante la promoción de la motilidad celular [34]. En este experimento, se demostró RBP2 hasta de regular la expresión de E-cadherina y disminuye la expresión de N-cadherina y el caracol. Estos resultados indican que RBP2 es capaz de inducir EMT. Recientemente, Teng et al. confirmó que RBP2 promueve la metástasis del cáncer mediante la activación de la integrina β1 [12]. A continuación, presentamos un nuevo mecanismo que RBP2 puede desempeñar un papel en la metástasis del cáncer mediante la inducción de la EMT.
E-cadherina ha sido bien demostrado ser un mediador clave de la EMT, y la interrupción de E-cadherina se prueba que es ser una causa de la EMT. Por ejemplo, Cheng et al. y Masszi et al. encontraron que el TGF-β1 era incapaz de inducir la EMT en presencia de contacto célula-célula [35,36]. Masszi et al. incluso llegó a la conclusión de que la ausencia de contacto célula-célula E-cadherina mediada era permisiva para la inducción de la EMT. Consistente con Masszi et al., Zheng et al. informó que el TGF-β1 no podía inducir EMT en confluentes tubular células epiteliales, pero que la sobreexpresión de E-cadherina en fibroblastos inducida transición mesenquimal-epitelial y EMT inhibida en las células epiteliales tubulares [37]. Varios factores de transcripción se ha demostrado que el control de la EMT por la supresión de la actividad del promotor de cadherina E y la represión de la expresión de E-cadherina [38,39]. En este trabajo, se investigó si RBP2 EMT inducida por la supresión de la actividad del promotor de cadherina E y la inhibición de la expresión de E-cadherina. Debido a Huang et al. confirmó que RBP2 ligado directamente a la región E-cadherina promotor (-799 a -579) [18], se analizó la actividad de la misma región del promotor de cadherina E y encontramos que RBP2 de hecho debilita la actividad del promotor de E-cadherina. Estos resultados indican que RBP2 regula a la baja la expresión de E-cadherina mediante la inhibición de la actividad del promotor de la E-cadherina.
El mecanismo por el cual se regula RBP2 N-cadherina y el caracol también se estudió en este documento. Hay mucha evidencia que apunta a un papel crítico de la señalización Akt en la EMT. Por ejemplo, la activación de la señalización de Akt promueve TGFβ- y dependiente de EGF EMT [40,41]. Akt también puede fosforilar IKK para aumentar la expresión del caracol [20]. Biflorin bloqueó la invasividad de las células por abajo de la regulación N-cadherina, más probablemente a través de Akt señalización [21]. Aquí, nuestras observaciones mostraron que RBP2 hasta reguladas la expresión de N-cadherina y caracol través de la activación de la señalización de Akt, y el inhibidor de Akt podría bloquear los efectos de RBP2 sobre la expresión de N-cadherina y caracol.
Recientemente, Teng et al. hizo un análisis de microarrays de ADNc en las células NSCLC [12]. Y encontraron que 10 genes que participan en la metástasis se cambiaron significativamente después de la depleción de RBP2, incluyendo dihidropirimidinasa-como 3, β1 integrina, la familia de portador de soluto 7 miembro 11, la familia de portador de soluto 7 miembro 5, desmogleína 2, liasa de esfingosina-1-fosfato 1 , colágeno tipo 1 α1, 1α tropomiosina, ciclo de división celular 42 y β10 protocadherin. Sin embargo, este estudio no analizó los efectos de RBP2 en la E-cadherina, N-cadherina y el caracol que son moléculas importantes implicados en la metástasis del cáncer. Nuestra investigación enriquece los mecanismos de la metástasis del cáncer RBP2 mediada.
Además, EMT se ha demostrado que resulta en la resistencia adquirida a gefitinib en células de NSCLC [42]. Mientras tanto, RBP2 es esencial para gefitinib resistencia en células de NSCLC [24]. De acuerdo con nuestros resultados, se deduce que la resistencia a gefitinib RBP2 mediada en las células NSCLC puede estar estrechamente relacionado con el efecto de RBP2 de EMT.
La terapia con medicamentos es un tratamiento importante para el cáncer de pulmón. Teniendo en cuenta la baja tasa de supervivencia actual, se necesitan urgentemente nuevas dianas terapéuticas. Se ha demostrado que RBP2 se sobreexpresa en cáncer de pulmón, y su expresión está altamente asociada con la proliferación celular del cáncer, la invasión, la migración y la tolerancia del fármaco. Nuestros experimentos mostraron que RBP2 podría inducir EMT en NSCLC. Todos estos estudios indican que RBP2 es un objetivo potencial para la terapia contra el cáncer de pulmón.
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a William G. Kaelin, Jr. (Instituto Médico Howard Hughes, Dana Instituto -Farber cáncer y el hospital Brigham y de Mujeres, Harvard Medical School, EE.UU.) para los plásmidos.