Extracto
Antecedentes
Casi el 20% de los cánceres humanos en todo el mundo tienen una etiología infecciosa con los ejemplos más prominentes de ser hepatitis B y carcinoma hepatocelular asociada con el virus del papiloma humano y C virus-asociado cáncer cervical. Hay una necesidad urgente de encontrar nuevos enfoques para el tratamiento y prevención de cánceres asociados a virus.
Metodología /Principales conclusiones
Los antígenos virales no han sido considerados previamente como objetivos para el tratamiento o la prevención de virus cánceres asociados. La hipótesis de que era posible tratar el cáncer experimental HPV16 asociada cervical (CC) y el carcinoma hepatocelular asociado-B Hepatitis (HCC) por la orientación antígenos virales expresados en las células cancerosas con anticuerpos radiomarcados a los antígenos virales. Tratamiento de CC experimental y los tumores de HCC con
mAbs 188Re marcado a las proteínas virales E6 y HBX, respectivamente, dio como resultado un retraso significativo y dependiente de la dosis del crecimiento del tumor en comparación con los ratones no tratados o los ratones tratados con anticuerpos no marcados.
Conclusiones /Importancia
Esta estrategia es fundamentalmente diferente de los usos anteriores de radioinmunoterapia en oncología, que dirigen los antígenos asociados a tumores humanos y promesas mayor especificidad y toxicidad mínima de tratamiento. Además, se plantea una posibilidad emocionante para prevenir cánceres asociados a virus en pacientes con infección crónica mediante la eliminación de las células infectadas con virus oncogénicos antes de que se transformen en cáncer
Visto:. Wang XG, Revskaya E, Bryan RA, Strickler HD, Burk RD, Casadevall A, et al. (2007) Tratamiento del cáncer como una enfermedad viral Infecciosas Antígenos como objetivos novedosos para el tratamiento y prevención de tumores de potencial viral Etiología. PLoS ONE 2 (10): e1114. doi: 10.1371 /journal.pone.0001114
Editor Académico: Mikhail Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Octubre, 2007; Aceptado: 10 Octubre 2007; Publicado: 31 Octubre 2007
Derechos de Autor © 2007 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. E. Dadachova es apoyado por el NIH AI60507 subvención; A. Casadevall - por las subvenciones del NIH AI33774, AI33142, AI52733, HL59842, y U54 AI157158; R. D. Burk por el NIH subvención CA078527. Este trabajo fue apoyado en parte por el Albert Einstein College of Medicine Comprehensive Cancer Center y el Centro de Investigación del SIDA en el Albert Einstein College de Medicina y Centro Médico Montefiore, financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH AI-51519).
Conflicto de intereses: la solicitud de patente para esta tecnología ha sido presentada en los Estados Unidos PTO
Introducción
se ha estimado que casi el 20% de los cánceres humanos en todo el mundo tienen una etiología infecciosa [1]. La mayoría de estos tumores son de origen viral, e incluyen asociaciones firmemente establecidos del virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC) con carcinoma hepatocelular; y del virus del papiloma humano (VPH) -con los cánceres del cuello uterino, el ano, la vulva, la vagina; así como asociaciones de virus Epstein-Barr orofaringe (EBV) con linfoma y carcinoma nasofaríngeo; T linfotrópico humano virus de tipo 1 (HTLV-1) -con adulto leucemia de células T /linfoma y virus del herpes humano 8 (HHV-8) -con el sarcoma de Kaposi [2] - [7]. En combinación, estos tumores asociados a virus representan una carga de aproximadamente 1,3 millones de casos de cáncer cada año, con el cáncer de VHB /VHC asociada hígado representando 523.000 casos, y los tumores asociados al VPH que representa 561.000 casos [8]. La necesidad de encontrar nuevos enfoques para el tratamiento y prevención de cánceres asociados a virus es obvia y urgente.
radioinmunoterapia (RIT) utiliza la unión a suministrar dosis citotóxicas de la radiación de partículas a las células tumorales [9] antígeno-anticuerpo, [10]. RIT, por ejemplo, se ha utilizado con éxito para tratar linfomas refractarios y recurrentes, con dos anticuerpos monoclonales radiomarcados (mAb) dirigidos contra CD20 (Zevalin® y Bexxar®) haber recibido aprobación de la FDA para este propósito. Es probable, de hecho, que RIT se convertirá en una primera línea de tratamiento para el linfoma folicular [11]. Este RIT cáncer objetivos antígenos "tradicionales" de "lo propio". Recientemente, hemos demostrado que RIT tiene también un amplio potencial para el tratamiento de infecciones fúngicas y bacterianas a través de la orientación de los antígenos microbianos con mAbs radiomarcados en modelos experimentales de infecciones fúngicas y bacterianas [12], [revisado en 13]. Además, encontramos que el VIH-1 en las células infectadas podrían ser eliminados in vitro e in vivo por la orientación gp120 y glicoproteínas virales gp41 expresado en la superficie de las células infectadas con mAbs específicos de proteínas virales radiomarcados [14].
la hipótesis de que RIT dirigida contra antígenos virales podría ser utilizado en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades infecciosas virales y tumores asociados a virus [15], [16]. Muchos cánceres asociados a virus expresan antígenos virales ya sea internamente o en sus superficies. Es importante tener en cuenta que incluso los antígenos virales expresados intracelularmente son objetivos potenciales para RIT, ya que es probable que resulte en la liberación de estas proteínas en el espacio intersticial del tumor renovación de las células del tumor. Este enfoque es fundamentalmente diferente de los usos descritos anteriormente de RIT que se dirigen a antígenos asociados a tumores que son (es decir, humanos), las proteínas "propias". Al dirigirse a las proteínas "propias" y no virales, se espera que los anticuerpos monoclonales radiomarcados se puede concentrar más en concreto dentro del tejido tumoral, lo que resulta en una mayor eficacia y menor toxicidad. Aquí se describen los experimentos de prueba de principio destinados a demostrar la viabilidad de tratar el cáncer experimental HPV16-asociado cervical (CC) y el carcinoma hepatocelular hepatitis B asociada (HCC) por la orientación antígenos virales expresados en las células cancerosas con anticuerpos radiomarcados a los antígenos virales .
resultados
la selección de una combinación de línea de antígeno de las células para actuar como un cáncer de cuello uterino experimental (CC) modelo
para evaluar el potencial de RIT para apuntar los antígenos virales en cánceres de etiología viral, que necesitaban identificar líneas de células tumorales que expresan el antígeno diana y también podría ser implantados en ratones desnudos. Se seleccionaron líneas HPV16 y HPV18 celulares, ya que estos dos tipos de VPH representan aproximadamente el 70% de los cánceres de cuello uterino y una fracción significativa de los tumores de cabeza y cuello [17], [18]. Las oncoproteínas E6 y E7 fueron considerados los mejores dianas antigénicas potenciales, ya que estas proteínas se expresan en esencialmente todas las células de cáncer cervical, mientras que otros genes virales se pueden perder. El análisis mutacional ha demostrado que las oncoproteínas virales E6 y E7 son necesarias y suficientes para la inmortalización de las células humanas por el VPH. Por lo tanto, se evaluó mediante Western blot la expresión de E6 y E7 en líneas celulares SiHa CasKi y tres celulares de carcinoma cervical humano líneas-HPV16-positivas y la línea celular HeLa S3 HPV18-positivas. Mientras que las células CasKi expresan ambos antígenos E6 y E7 (Fig. 1a, b), las líneas celulares SiHa y HeLa S3 no tenía expresión medible de antígeno E6 (resultados no presentados), pero hizo proteína E7 expreso (Fig 1d, e.); aunque, el nivel de expresión E7 fue baja en células SiHa
a) E6 a partir de extractos de proteínas de células CasKi tratadas con MG132 durante 3 horas (Fig 1d.).; b) E7 a partir de extractos de proteínas de células CasKi tratadas con MG132 durante 3 horas; c) E6 a partir de extractos de proteínas de células CasKi tratadas con MG132 durante 6 horas; d) E7 a partir de extractos de proteínas de células SiHa tratadas con MG132 durante 3 horas; e) E7 a partir de extractos de proteínas de células HeLa S3 tratadas con MG132 durante 3 horas; f) HBX a partir de extractos de proteínas de las células Hep 3B2.1-7 tratadas con MG132 durante 3 horas.
El inhibidor del proteasoma MG132 reduce la degradación de las proteínas ubiquitina conjugada en células de mamífero sin afectar ATPasa o isopeptidase ocupaciones. MG132 se ha informado a resultar en aumento de los niveles de las proteínas E6 y E7 en las células cervicales cáncer [19], [20]. Como mayores cantidades de antígenos diana pueden potencialmente mejorar los resultados del RIT, se investigó la influencia de pre-tratamiento de las células con CC MG132 inhibidor del proteasoma sobre los niveles de expresión de E6 y E7. Higo. 1a y b muestran que en las células CasKi pre-tratamiento con MG132 causó un aumento en la expresión de ambos E6 y E7, con el mayor nivel de expresión logrado con el uso de 2 y 5 mg /ml de MG132 que disminuyó cuando se utilizaron dosis más altas. La prolongación del período de incubación de las células con MG132 CasKi no dio lugar a una mayor expresión de E6. De hecho, se observó disminución de la expresión de E6 con la exposición prolongada a las células CasKi MG132 (Fig. 1c), lo que podría reflejar un aumento de la degradación de proteínas después de más de 3 horas de incubación. Se realizaron experimentos similares para la proteína E7 en SiHa y líneas de células HeLa S3 (Fig. 1D, E). células SiHa no demostraron un aumento apreciable de los niveles E7 (figura 2d.); mientras que, los niveles E7 aumentó ligeramente el de células HeLa S3 tratados con 1 y 2 mg /ml MG132 (Fig. 1e). Dada la expresión fiable y de alta de E6 en células CasKi, así como su capacidad para producir tumores en ratones desnudos-se seleccionaron las células CasKi y proteínas E6 para su posterior in vitro e in vivo.
a, b) de inmunofluorescencia células tumorales fijas y permeabilizadas. paneles de la izquierda muestran imágenes de microscopía de luz de las células. células muy dañadas están marcados con flechas. paneles de la derecha muestran imágenes de inmunofluorescencia de los mismos portaobjetos tratados con mAbs virales específicos de proteína seguido de anticuerpo policlonal conjugado con FTIC de IgG de ratón: las células a-CasKi y C1P5 el MAB, b-Hep-E6 3B2.1-7 células específicas y HBx- mAb 4H9 específica; c) inmunohistoquímica de tumores CasKi. El panel izquierdo muestra la unión de mAb C1P5 E6-específica. El panel derecho muestra ausencia de unión del control mAb 18B7; d) transferencia Western de tumores Hep 3B2.1-7 con HBx mAb específico 4H9.
La selección de una combinación de línea de antígeno de las células para actuar como un carcinoma hepatocelular hepatitis B asociada experimental (HCC) modelo
Se evaluaron dos proteínas virales hepatitis B asociada como posibles objetivos para RIT-HBx y PreS2. HBx se sospecha que tienen un papel en la hepatocarcinogénesis y, a diferencia de otras opciones posibles, HBx no tiene homología con proteínas del huésped. Además, el gen que codifica para HBx se retiene incluso cuando el genoma del VHB se integra en HCC, mientras que otros genes de HBV se pueden perder [21], [22]. PreS2 también se sospecha que tienen un papel en la hepatocarcinogénesis (es decir, a través de la transactivación de genes celulares importantes en el control del crecimiento) [22]. proteína HBx se detectó consistentemente por Western blot de la línea celular HCC Hep 3B2.1-7 utilizando 4H9 mAb, y su expresión fue independiente del pre-tratamiento con el inhibidor de proteasoma MG132 (Fig. 1f), mientras que no se detectó preS2 (resultados no mostrados ). Por lo tanto, se seleccionó la línea celular Hep 3B2.1-7 y proteínas HBx combinación para experimentos adicionales.
La unión de anticuerpos a los antígenos virales en las células no viables
Para averiguar si los anticuerpos para proteínas virales que fueron identificados como objetivos para RIT serán capaces de unirse a las proteínas virales en las células tumorales no viables, se realizó inmunofluorescencia de fijo y se permeabilizaron células CasKi y Hep 3B2.1-7 con mAbs C1P5 a E6 y 4H9 a las proteínas HBX , respectivamente, seguido de anticuerpo policlonal conjugado con FITC a IgG de ratón. Si bien la unión de C1P5 mAb a las células que eran casi intacta era débil, las células gravemente dañadas con membranas penetrables mostraron fluorescencia brillante que apunta a la unión de C1P5 a E6 (Fig. 2a). La fijación y permeabilización también hicieron posible que los mAb 4H9 para unirse a la proteína HBx (Fig. 2b). Sin unión de mAb control de IgG1 a fijos y permeabilized CasKi o Hep 3B2. se observó 1-7 células (resultados no mostrados).
La expresión de proteínas virales en los tumores
Para confirmar que CasKi y Hep 3B2.1-7 células continuaron expresando E6 y HBx viral antígenos, respectivamente, en los tumores inducidos en ratones desnudos, se realizó inmunohistoquímica y de inmunotransferencia para E6 y HBx, respectivamente. Western blot se eligió para los tumores inducidos por 3B2.1-7 Hep en base a las dificultades de presentación de informes literatura en la detección fiable proteína HBx en los órganos por inmunohistoquímica [23]. No hubo una tinción intensa de E6 con C1P5 mAb específico en los tumores CasKi (Fig. 2c, panel izquierdo) sin tinción observado con el control de IgG1 mAb (Fig. 2c, panel derecho). Western blot de los tumores inducidos por 3B2.1-7 Hep reveló la presencia de proteína HBx (Fig. 2d). Así, la presencia de las proteínas virales diana en CC y tumores experimentales HCC proporcionado la posibilidad de la orientación de estos antígenos in vivo con mAbs radiomarcados para formación de imágenes y terapia de centellografía.
biodistribución de mAbs radiomarcados a proteínas virales en CasKi y Hep 3B2.1-7-tumoral en ratones lampiños
realizaron experimentos de imagen y de biodistribución con
188Re-radiomarcado C1P5 y 4H9 mAb en CasKi y Hep-3B2.1-7 ratones desnudos portadores de tumores, respectivamente, para determinar la localización de los mAbs a los tumores. A las 24 h después de la inyección del tumor CasKi era visible en la imagen de gammagrafía de un ratón inyectado con
188Re-C1P5 mAb (Fig. 3a) en comparación con la imagen de un ratón inyectado con irrelevante
188Re-18B7 mAb (Fig. 3b). También se calculó el tumor al cociente del músculo a partir de los resultados de biodistribución de 48 horas, que era de 10:01
188Re-C1P5 en comparación con 3:01 para
188Re-18B7. La absorción global de
188Re-C1P5 mAb en los tumores en 48 horas después de la inyección fue de 2,0 (± 0,3)% de la dosis inyectada por gramo de tumor. Otros órganos como el hígado, el bazo y la sangre mostraron los niveles de característica absorción de IgG1 mAbs. Para Hep 3B2.1-7 se utilizó otro enfoque para demostrar la especificidad de la captación de mAb en el tumor mediante el uso de un modelo cuando un ratón lleva dos tumores de uno diferente el tumor de interés y otra irrelevante de tumor control. ratones desnudos lleva tumor melanoma metastásico humano A2058 en el flanco derecho y Hep 3B2.1-7 a la izquierda (Fig. 3c). Los ratones fueron inyectados con
188Re-4H9 MAB y la imagen centellográficamente a las 24 horas después de la inyección. El anticuerpo localizado en el tumor Hep 3B2.1-7 en comparación con el control de tumor melanoma irrelevante (Fig. 3d). La capacidad de los anticuerpos monoclonales radiomarcados a los antígenos virales para localizar a estos tumores en ratones justificada una evaluación de RIT en estos modelos de cáncer in vivo.
RIT de CasKi y Hep 3B2.1-7 portadores de tumor desnuda ratones
Para evaluar el efecto terapéutico de
188Re-C1P5 mAb en CasKi ratones portadores de tumores, los animales se inyectaron bien con 350 Ci
188Re-C1P5 mAb, o cantidades coincidentes (30 g por ratón) de marcado ( "frío") C1P5 mAb o se dejan sin tratar. Higo. 4a muestra el cambio en el volumen del tumor en los grupos tratados y de control. RIT con 350 Ci
188Re-C1P5 mAb detenido por completo el crecimiento del tumor y resultó en su reducción de volumen (Fig. 4a y b), mientras que los tumores no tratados crecieron agresivamente (Fig. 4a y c) y los ratones de control no tratados tuvieron que ser sacrificados en Día 20 después del tratamiento (P & lt; & lt; 0,01). Curiosamente, la administración de "frío" C1P5 mAb también dio lugar a un retraso significativo del crecimiento del tumor, que puede ser debido a la inducción de la inflamación y complementar cascadas por el mAb
a) los cambios en el volumen del tumor.; b) ratón tratado con 350 Ci
188Re-C1P5 mAb; c) el control del ratón (tanto en ratones se muestran en el día 20 post-tratamiento).
Para RIT de Hep 3B2.1-7 tumores en ratones desnudos que inicialmente se empleó el mismo procedimiento experimental, por tumores CasKi por utilizando 350 Ci
188Re 4H9 mAB, controles tratados con mAb "fríos" y los grupos no tratados. La administración de 350 Ci
188Re-4H9 MAB resultó en el crecimiento del tumor más lento, pero no arrestó a ella como en el caso de los tumores CasKi. "Fría" 4H9 MAB no tuvo un efecto sobre el crecimiento del tumor. Para encontrar la dosis más eficaz de mAb radiomarcado para retardar el crecimiento de muy agresivo Hep 3B2.1-7 se llevó a cabo un experimento de respuesta a la dosis. El efecto terapéutico de
188Re-4H9 mAb empezó a manifestarse en una dosis de 280 Ci y el efecto incrementado con cada aumento subsiguiente en la dosis (Fig 5a.) (P & lt; 0,02). En la terminación del experimento se analizaron histológicamente los tumores de los ratones no tratados y ratones de control en el grupo de 600 Ci más alto. El tumor de control consistió en células hepatoides moderadamente diferenciados con pequeños focos dispersos de la necrosis, trombosis de fibrina y hemorragia. Las células neoplásicas tuvieron amplia eosinofílica al finamente citoplasma vacuolado y medianas núcleos a núcleos muy grandes anaplásico y contienen múltiples nucleolos grandes eosinofílica con células multinucleadas en ocasiones evidentes. El índice mitótico fue alta y no se dispersaron las células apoptóticas (Fig. 5b). En contraste, los tumores tratados con RIT tenían significativamente más necrosis y hemorragia que se ve en los controles. El aspecto morfológico de las células tumorales a menudo tenían un citoplasma vacuolado lo que sugiere la degeneración más (figura 5c.)
a) cambios en el volumen del tumor.; b) controlar el ratón no tratado; c) de ratón tratados con 600 Ci
188Re-4H9 MAB. Tanto en ratones muestran el día 18 post-tratamiento. En los paneles inferiores byc muestran H & amp; E tumores teñidos a la finalización del experimento
Discusión
Se realizó la prueba de principio in vitro e in vivo de establecer. la viabilidad de la orientación antígenos virales en los tumores de etiología viral con anticuerpos radiomarcados para la terapia. Con este fin, hemos realizado un estudio experimental de carcinoma cervical (CC) y los modelos de carcinoma hepatocelular (HCC), ya que estos cánceres son etiológicamente relacionado con el VPH y VHB /VHC, respectivamente, y tienen importantes implicaciones para la salud pública en todo el mundo.
el primer reto fue la elección de los antígenos virales diana en CC y el CHC. En CC asociado al VPH identificamos oncoproteínas E6 y E7 como objetivos potenciales para RIT, porque se cree que se expresa en todas las células de cáncer cervical; mientras que, otros genes virales se pueden perder durante el proceso de múltiples etapas de la tumorigénesis. Del mismo modo, en HCC, se cree que la expresión HBx que ser mantenida. Hay, sin embargo, una preocupación importante en la orientación de estas tres proteínas con mAbs radiomarcados-su localización subcelular. Ambos E6 y E7 están situados dentro del núcleo, y HBx se encuentra en el núcleo y de vez en cuando en el citoplasma. Como consecuencia, los mAbs radiomarcados a estas proteínas pueden unirse sólo a sus respectivos antígenos cuando se liberan de las células muertas o cuando se permeabilizan las células tumorales. Para llevar a cabo estos experimentos, se optó por la línea de células CasKi como modelo CC, ya que lo encontramos expresó E6 y E7 en altos niveles en los tumores in vitro y creció agresivamente en ratones desnudos después del período latente. La línea celular Hep 3B2.1-7 fue elegido como modelo HCC, después se observó que se expresa en altos niveles HBx y se muestra el crecimiento tumoral en ratones rápida.
La inmunofluorescencia de las células tumorales y la inmunohistoquímica y Western blot de los tumores reveló grandes cantidades de E6 y HBX dianas antigénicas en CasKi- y tumores inducidos por 3B2.1-7 Hep, respectivamente (Fig. 2). La presencia de antígeno accesible para los mAbs radiomarcados es probablemente un resultado de la liberación de proteínas a partir de células tumorales se someten a rápida rotación. En consecuencia, los anticuerpos radiomarcados se acumulan en el tejido tumoral tal que puedan obtenerse imágenes de gammagrafía (Fig. 3). Una de las ventajas de la orientación antígenos virales en los tumores que se encuentran sólo en las células malignas. Por el contrario, Chen y sus colegas observaron diferencias en la captación tumoral para ambos anticuerpos radiomarcados específicos y no específicos en sus experimentos de biodistribución cuando se dirigen las histonas intranucleares [24].
La capacidad de los mAbs radiomarcados contra las proteínas virales a entregar radionúclido citotóxico 188-renio a las células tumorales facilitado los resultados exitosos de RIT con estos anticuerpos monoclonales en ratones portadores de tumores. La administración de dosis 350 Ci de E6 vinculante
188Re-C1P5 mAb a ratones portadores de tumores CasKi detuvo por completo el crecimiento del tumor e incluso dio lugar a su regresión (Fig. 4). También es probable que no había algún beneficio terapéutico añadido a partir del anticuerpo como anticuerpos no marcados pueden mediar reacciones inflamatorias y activar cumplido. En el futuro, será la pena investigar si el aumento de los niveles celulares de oncoproteínas E6 y E7 se podrían obtener con el uso de tratamiento previo de MG132 in vivo, y si esto se traduce en un beneficio terapéutico. Los experimentos de respuesta a la dosis en ratones portadores de la hepatitis 3B2.1-7 HCC-tumores demostraron claramente una dependencia de la dosis para el efecto terapéutico (Fig. 5). El hecho de que se necesitan dosis más altas de radiomarcado mAb para producir un efecto terapéutico en HCC que en tumor cervical podría reflejar la agresividad de Hep 3B2.1-7 y de la radioresistance conocida de tumores en el hígado en comparación con los carcinomas de cuello uterino relativamente radiosensibles [25] . También es de destacar que los beneficios terapéuticos en ambos tumores experimentales fueron obtenidos con dosis de radiactividad que están muy por debajo de la dosis máxima tolerada de aproximadamente 800 Ci para
IgG1 188Re marcado en ratones [26], y como tal, las dosis utilizadas fueron no se conocen ninguna toxicidad a corto o largo plazo.
es importante destacar que cuando el tratamiento de cánceres asociadas a virus por la orientación antígeno viral no todas las células del tumor necesita expresar antígenos virales para un efecto terapéutico . emisores de largo alcance tales como
188Re (rango de emisión en el tejido 10 mm) emiten radiación en una esfera 360 ° y por lo tanto puede eliminar células en la vecindad de la ubicación antígeno. Por otra parte, es, probablemente, no se requiere una alta concentración del antígeno viral específica para la administración de una dosis terapéutica para el tumor, de acuerdo con nuestra reciente modelo de RIT para el melanoma (dirigido contra la melanina, que es también un antígeno intracelular). Este modelo mostró que la dosis de radiación recibida por el tumor es en gran medida independiente de la melanina (antígeno) la concentración [27].
Este enfoque también mantiene la promesa para prevenir cánceres virales asociadas en individuos -por ejemplo crónicamente infectada, la persistencia de la infección por VPH en los individuos infectados por el VIH pone en riesgo significativo de desarrollar cánceres asociados al VPH. Si bien no es la inmunoterapia para VHB y VHC, muchos pacientes no logran la eliminación del virus y el tratamiento se asocia a una elevada morbilidad. También hay ninguna vacuna contra el VHC, y muchos millones de personas en todo el mundo están infectadas con el VHB a pesar de la disponibilidad de una vacuna eficaz. Las células persistentemente infectadas con el VPH, VHB, VHC u otros virus potencialmente podrían ser eliminados con RIT dirigida a los antígenos virales antes de que se transforman en fenotipo maligno.
En conclusión, hemos realizado in vitro e in vivo para evaluar una novela estrategia para el tratamiento de tumores de virus asociado utilizando anticuerpos monoclonales radiomarcados dirigidos contra las proteínas virales. Esta estrategia es fundamentalmente diferente de los usos anteriores de RIT en oncología que se dirigen a antígenos humanos asociados a tumores que resulta en una absorción importante de anticuerpo radiactivo en los tejidos normales, que conducen a la toxicidad. Los resultados de nuestro estudio sugieren que, al dirigirse proteínas propias en lugar virales y no puede ser posible para los mAbs radiomarcados para concentrarse más específicamente en el tejido tumoral, lo que resulta en una mayor eficacia y menor toxicidad. Esta estrategia también plantea una posibilidad adicional emocionante para prevenir cánceres asociados a virus en pacientes con infección crónica mediante la eliminación de las células infectadas con virus oncogénicos antes de que se transformen en cáncer.
Métodos
Los anticuerpos
Mouse mAbs de Abcam C1P5 a HPV16 E6 + HPV18 E6 y TVG 701Y a HPV16 E7 se utilizaron en experimentos de CC. Mouse mAb 4H9 al VHB HBx (Aviva, Cat#AVAMM2005) y el ratón mAb S26 a la proteína de HBV Hbs (gen Tex Inc. Cat#GTX18797), que reacciona de forma cruzada con el antígeno HBsAg preS2 se utilizaron en experimentos de HCC. Murino 18B7 MAB (IgG1) a
C. neoformans
[28] se utilizó como un control irrelevante para todos los anticuerpos específicos. anticuerpo policlonal de conejo conjugado con fosfatasa alcalina a IgG de ratón H & amp; L fue adquirido de Abcam y se utilizó como anticuerpo secundario en Western blot
Líneas celulares y cultivo celular
Tres líneas celulares de carcinoma cervical humano:. Hela S3, SiHa y CasKi se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). Las células se cultivaron de forma rutinaria en DMEM /HAM F-12K (Sigma, 01:01) que contiene 10% de FBS (Sigma) y solución de penicilina-estreptomicina al 1% (Sigma, penicilina 10.000 U y estreptomicina 10 mg /ml) a 37 ° C en 5% de CO
2 incubadora. La línea celular Hep 3B2.1-7 (
Homo sapiens
hepatatocellular carcinoma) se adquirió de ATCC. Contiene un genoma de virus de la hepatitis B integrado y se derivó del tejido de carcinoma hepatocelular de 8 años de edad muchacho negro. Las células fueron cultivadas rutinariamente en Medio de Eagle Mínimo Esencial (EMEM) (ATCC) que contiene 10% de FBS (Sigma) a 37 ° C en 5% de CO
2 incubadora. capas de células en 75 ml matraz se dispersó mediante la adición de 2 ml de 1 x solución de tripsina-EDTA (Sigma, 0,25% (w /v) de tripsina-EDTA 0,53 mM) a temperatura ambiente durante 15 minutos. línea celular A2058 derivado de una metástasis en los ganglios linfáticos de pacientes con melanoma maligno se obtuvo de la ATCC. Las células se mantuvieron como monocapas en Dulbecco medio de Eagle modificado con 4 mM L-glutamina, 4,5 g /l de glucosa, 1,5 g /bicarbonato de sodio L, suplementado con suero bovino fetal al 10% y solución de penicilina-estreptomicina al 5% a 37 ° C y 5% de CO
2, y se recogieron mediante el uso de 0,25% (w /v) de solución de tripsina-EDTA. El mantenimiento de rutina de todas las líneas celulares se realizó de acuerdo a los protocolos de ATCC.
Western blots
Los sedimentos celulares se suspendieron en el tampón de lisis (4% de SDS, 20% de glicerol, 0,5 M Tris HCl (pH 6.8), 0,002% de azul de bromofenol y 10% de β-mercaptoetanol). Las muestras de proteína se hirvieron en agua durante 15 min antes de ejecutar SDS-PAGE. Veinte cinco y media l solución de proteína se cargó en cada pocillo de gel de SDS-PAGE prefabricado 12% (Bio-Rad). SDS-PAGE se utiliza para controlar las cantidades de proteínas relativas en las muestras. El doce por ciento de gel de SDS-PAGE se utiliza para las proteínas separadas, y la electroforesis se realizó utilizando Mini-PROTEAN® 3 sistema Cell (Bio-Rad). Después de la electroforesis, el gel se transfiere en el tampón de transferencia de PVDF (Tris 25 mM, glicina 190 mM y 2,5% (v /v) de metanol) durante 5 min. Entonces, las proteínas se transfirieron desde el gel a la membrana Immun-Blot ™ de PVDF (Bio-Rad) en Semi-seco electroforética de la célula de transferencia (Bio-Rad) a 15 V durante 17 min. La membrana se empapó en el tampón de bloqueo (Tris HCl 25 mM (pH 7,6), EDTA 1 mM y NaCl 150 mM) durante 5 min, y luego se transfiere a la solución de bloqueo (leche en polvo al 5% sin grasa en el tampón de bloqueo) , agitando suavemente durante una hora. La membrana se incubó en solución de TBST (0,1% de Tween-20, Tris HCl 25 mM (pH 7,6) y NaCl 500 mM) que contiene 1:3000 anticuerpo primario diluido a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave. A continuación, la membrana se lavó con TBST tres veces (10 min por lavado). La membrana se hibridó por el anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (policlonal de conejo para IgG de ratón H & amp; L (fosfatasa alcalina)) en TBST con una dilución 1:100,000. Después de tres lavados con TBST, la membrana se incubó en CDP-Star ™ solución de sustrato quimioluminiscente (Sigma) durante 5 min, y luego se expusieron a película CL-XPosure ™ (Pierce). La película fue desarrollada según las instrucciones del fabricante.
MG132 tratamiento de las células
MG132 (Z-LLL-CHO, PM = 457,6) se adquirió de Calbiochem un proteasoma reversible y permeable a las células potente inhibidor (Ki = 4 nM). MG132 se disolvió primero en una gota de etanol al 100% seguido de medio DMEM /HAM F-12K sin adición de FBS, y la solución madre se almacenó a 4 ° C. El cultivo celular se cosechó y se transfirió a 6 tubos de ensayo estériles. Cada tubo contenía 0,5-1 ml de cultivo de células (concentración de células fue ~ 10
6 células /ml), y se dejó que las células de crecer a 37 ° C en 5% de CO
2 incubadora durante la noche. Después, se añadió solución MG132 a los tubos para las concentraciones finales de 0, 1, 2, 5, 10 o 25 g /ml (0, 2,1, 4,2, 10,5, 21 o 52 mM, respectivamente). Las células se incubaron en las mismas condiciones durante otros 3 ó 6 horas. Finalmente, las células se recogieron por centrifugación y se clarifican mediante lavado con PBS.
radioisótopos y radiomarcaje de los anticuerpos
El beta-emisor
188Re con una vida media de 16,9 horas se eluyó en la forma de perrenato de sodio Na
188ReO
4 de un
188W /
generador 188Re (Laboratorio Nacional de Oak Ridge, Oak Ridge, TN). Los anticuerpos se marcaron con
188Re directamente a través de la unión de reducido
188Re al grupo-SH generado en los anticuerpos como se describió anteriormente [11].
detección inmunofluorescente de antígenos virales en las células tumorales
las células tumorales se cultivaron en las cámaras de portaobjetos a 37 ° C durante 12 horas. El medio se retiró y las células se lavaron con PBS tres veces. Durante todo el procedimiento, las células se lavaron 3 veces con PBS después de cada tratamiento. Ellos fueron fijadas con 4% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 min seguido de permeabilización con 0,3% Triton-X100 en PBS a temperatura ambiente durante 10 min. Las células fijadas y permeabilizadas se bloquearon con 5% de BSA más un 0,1% de Triton X-100 en PBS a temperatura ambiente durante 30 min. mAbs virales antígenos específicos se diluyeron 1:200 con la BSA arriba y solución de Triton X-100 y se incubaron con las células a temperatura ambiente durante 60 min. FTIC conjugado con anticuerpo policlonal de conejo para IgG de ratón en dilución 1:300 se añadió a las células para 60 min de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad. Las diapositivas fueron vistos con un microscopio Olympus AX70 (Melville, NY) equipado con un filtro FITC.
modelos tumorales
Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Instituto de Animales los estudios en el Albert Einstein College of Medicine. líneas celulares de carcinoma cervical humano CasKi y carcinoma hepatocelular humano Hep 3B2.1-7 fueron elegidos como los modelos de tumores en base a su expresión de E6 y HBx, respectivamente, y su tumorigenecity en ratones desnudos. De seis semanas de edad ratones desnudos nu /nu CD1 comprados de Charles River se inyectaron en el flanco derecho con 10
7 CaSki o Hep 3B2.1-7 células en 0,1 ml de medio DMEM que contiene suero de ternera fetal 10%. CasKi tumores comenzaron a aparecer alrededor de 60 días después de la inyección, Hep 3B2.1-7 tumores de 10 días después de la inyección de células. Para biodistribución de HBx mAb específico, ratones desnudos fueron inoculados con 10
7 células de melanoma A2058 humanos metastásicos y 10
7 células Hep 3B2.1-7 a la derecha y los flancos izquierdo, respectivamente. Se iniciaron experimentos de biodistribución y la terapia cuando los tumores alcanzaron 0,3-0,7 cm de diámetro.
Detección inmunohistoquímica de la proteína E6 del VPH en tumores CasKi
Los tumores tomadas de ratones portadores de tumores se fijaron en CasKi