Extracto
Alteración de las células del cáncer hacia fenotipo mesenquimal se ha demostrado potenciar la agresividad del tumor mediante el aumento de la metástasis de células de cáncer. Aquí, se presenta el efecto de triclosán, un agente antibacteriano utilizado encuentra en muchos productos diarios, en la mejora de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) en células de cáncer de pulmón H460 humano resistentes anoikis agresivo. EMT se ha sabido por mucho tiempo para aumentar la capacidad de las células para aumentar la migración, invasión, y la supervivencia en el sistema de circulación. El presente estudio revela que el tratamiento de las células de cáncer con triclosán a las concentraciones fisiológicamente relacionados aumentó significativamente el número de colonias de las células de cáncer evaluadas por el ensayo de formación de tumores. También, se observaron la morfología mesenquimales-como y disminución de la adhesión célula a célula en células triclosán tratados. Es importante destacar que, Western blot reveló que las células tratadas con triclosán mostraron una disminución de la E-cadherina, mientras que se encontraron los niveles de marcadores de EMT, a saber, N-cadherina, vimentina, caracoles y babosas ser significativamente hasta reguladas. Además, EMT inducida por el tratamiento triclosan fue acompañada por la activación de la quinasa de adhesión focal /ATP dependiente de la tirosina quinasa (FAK /Akt) y Ras relacionados C3 sustrato de toxina botulínica 1 (Rac1), que mejora la capacidad de las células para migrar e invadir . En conclusión, hemos demostrado por primera vez que el triclosán puede potenciar la supervivencia de las células cancerosas en la condición individual y la movilidad a través del proceso de la EMT. Como se requieren capacidades mencionadas para el éxito en la metástasis, el presente estudio proporciona la novela información toxicológica y fomenta la conciencia sobre el uso de triclosán en pacientes con cáncer
Visto:. Winitthana T, S Lawanprasert, Chanvorachote P (2014) potencia la Triclosan la transición epitelio-mesenquimal transición en células resistentes a Anoikis cáncer de pulmón humano. PLoS ONE 9 (10): e110851. doi: 10.1371 /journal.pone.0110851
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de julio de 2014; Aceptado: September 24, 2014; Publicado: 16 de octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Winitthana et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Fondo de Investigación de Tailandia (para PC) (http://www.trf.or.th), Ratchadaphiseksomphot Fondo de Dotación de la Universidad de Chulalongkorn ( RES560530132-HR), el 90º Aniversario de la Universidad de Chulalongkorn Fondo (Ratchadapiseksomphot fondo de dotación), y la beca de la Universidad de Chulalongkorn Graduate para conmemorar el 72º aniversario de Su Majestad el rey Bhumibol Adulyadej (http://www.grad.chula.ac.th/eng /becas). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El conocido agente de amplio espectro triclosan anti-bacteriana (2,4,4 'tricloro-2' hidroxidifenil éter; TCS) (Figura 1A) se ha utilizado comercialmente en una variedad de productos para inhibir el crecimiento de bacterias, hongos, y moho [1], [2]. TCS ha sido utilizado bajo la regulación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (en cosméticos, desodorantes, jabones de tocador, pasta de dientes), así como la Agencia de Protección Ambiental (en materiales de conservación incorporan a los plásticos para el hogar y textiles) [2], [3]. Las concentraciones utilizadas de TCS en diferentes productos pueden variar; sin embargo, sus niveles en la mayoría de los productos de cuidado personal oscilan desde 0,1 hasta 2% [1], [3]. El hecho de que los niveles significativos de TCS son detectables en el plasma de expuesta-TCS humano en la concentración que varía de 0,02 y 20 mg /ml (0,069 y 69 mM) conduce a la posible concepción de que este agente puede posiblemente afectar la fisiología humana [4 ].
(A) La estructura química de TCS. (B) la agregación multicelular de anoikis resistentes células H460. La barra de escala es de 1.000 m. (C-D) Después del tratamiento con TCS (0-10 mM) durante 24 h, el porcentaje de viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT y el porcentaje de células apoptóticas fue detectado por tinción Hoechst33342, respectivamente. Los valores son medias de las tres muestras por triplicado independientes ± SE. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a control de no tratado. (E) Después de que el tratamiento indicado, la morfología nuclear de las células se detectó por /PI co-tinción ensayo Hoechst33342 y se visualizó con un microscopio de fluorescencia. La barra de escala es de 50 micras. (F) Las células se trataron con TCS (0-7,5 M) durante 24, 48 o 72 h. La viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT. Los datos representan las medias de las tres muestras por triplicado independientes ± SE. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a control en cada tiempo indicado no tratada. (G-H) Las células se trataron con TCS (0-7,5 M) durante 48 h. ciclo celular de las células tratadas con TCS se determinó mediante tinción con PI y citometría de flujo. *
P
. & Lt; 0,05 frente al control no tratado
Centrándose en el cáncer, hasta a la fecha de la información ha señalado que TCS tiene efectos insignificantes sobre la carcinogénesis y la mutación genética directa [2], [5], [6]. Sin embargo, teniendo en cuenta que TCS es una sustancia que las personas pueden estar expuestas a un largo período de su vida, es importante para entender completamente los posibles efectos de este agente no sólo sobre la carcinogénesis, sino también el posible impacto en los comportamientos celulares de cáncer. Estudios recientes han indicado que la transición del fenotipo celular del epitelio mesenquimal nombrado-epitelial-mesenquimal de transición (EMT) es un factor fundamental para facilitar la metástasis de muchos tipos de cáncer [7] - [9]. EMT ha recibido considerable atención en las investigaciones relacionadas con el cáncer y EMT ha sido reconocida como una característica de la troncalidad cáncer, así como la agresividad [10]. proceso EMT ha dado lugar a la alteración de los comportamientos celulares que, en la mayoría de los casos, mejora la capacidad de metástasis, incluyendo la migración potenciada de las células de su tumor primario, y el aumento de la resistencia a la apoptosis [11] - [13].
mayoría de la evidencia sugiere que la población sub de las células cancerosas que exhiben propiedad de resistencia a la anoikis es la mayoría de las células sometidas a la metástasis éxito [14] - [18]. células resistentes anoikis también se conocen como células tumorales (CTC) [19] en circulación. En la práctica clínica, las CTC se han considerado como un biomarcador potencial que refleja la agresividad del cáncer de muchos tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama, de próstata, colorrectal, vejiga, gástrico, de hígado y cáncer de pulmón [20] - [24]. La presencia y la cantidad de CTC en sangre periférica se muestran correlación con mal pronóstico en pacientes con cáncer [19], [20]. La población de las CTC exhiben fenotipos celulares heterogéneas que incluyen células epiteliales, mesenquimales, y esos fenotipos en un estado de transición entre epitelio mesenquimal [20], [24] - [27]. A medida que el proceso de EMT dio lugar a los fenotipos mesenquimales con potencias aumento de metástasis incluidos anoikis resistencia y la capacidad invasiva de las células [14], [20], [23] factores o estímulos que facilitan este EMT en CTC pueden alterar los fenotipos de la población de los CTC y las afectar a los potenciales de la metástasis de las células. Como CTC se encuentran en la circulación sistémica [19], [24], [28], las células son propensos a estar expuestos a varios productos químicos existentes en la sangre. Basado en una preocupación, varios compuestos se han investigado y descrito que tiene una propiedad de EMT-inducir tales como TGF-β [29], [30], factor de crecimiento epidérmico [31], [32], celecoxib [33] gefitinib [ ,,,0],34] y el cromo hexavalente [35].
a pesar de la presencia de ciertas concentraciones de TCS ha sido reportado en circulaciones humanos, la información relativa a los efectos de dicho agente en el proceso de EMT de la CTC sigue siendo en gran parte desconocido. El presente estudio tiene como objetivo investigar los efectos, así como los posibles efectos de este compuesto en la población agresiva de las células de cáncer de pulmón. Un mejor entendimiento obtenidos de este estudio puede contribuir a un uso más seguro de TCS y proporcionar nuevos enfoques de evaluación de la toxicidad relacionada con el cáncer.
Materiales y Métodos
1. Las células y los reactivos
NCI-H460 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Las células cancerosas se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 IU /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Life Technologies, MD, USA) en 37 ° C con 5% de CO
2 incubador humidificado. Triclosan se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). TCS se diluyó con medio estéril para conseguir las concentraciones de trabajo con 0,1% de DMSO en la solución final. En cuanto a las fuentes de reactivos, Hoechst33342, yoduro de propidio (PI), faloidina tetrametilrodamina B isotiocianato, albúmina de suero bovino (BSA) y dimetilsulfóxido (DMSO) fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) fueron adquiridos de Gibco (Life Technologies, MD, USA). Matrigel se obtuvo de BD Biosciences, Inc. (Woburn, MA, EE.UU.). kit de ensayo BCA y Supersignal quimioluminiscente pico oeste se obtuvo de Thermo Scientific, Inc. (Rockford, IL, EE.UU.). Los anticuerpos monoclonales de conejo para la E-cadherina, N-cadherina, vimentina, babosas, caracoles, Akt, Akt fosforilada (S473), quinasa de adhesión focal (FAK), fosforilados FAK (Y397), β-actina, conjugado con peroxidasa anti-IgG de conejo y conjugado con peroxidasa anti-IgG de ratón se obtuvieron de Cell Signaling (Denvers, MA, EE.UU.). anticuerpos monoclonales de ratón para Active Rac1-GTP y activa Rho-GTP se obtuvieron de Neweast Biosciences (Malvern, PA, EE.UU.). Immobilon se obtuvo sustrato de HRP quimioluminiscente Western de Millipore, Corp. (Billerica, MA, EE.UU.) y Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL, EE.UU.).
2. células resistentes anoikis
cultivo celular resistente
Anoikis se llevó a cabo de acuerdo al método de Sakuma et al. [36] y Khongmanee et al. [37] con modificaciones menores. En resumen, se tripsinizaron adjuntos H460 células cuando las células alcanzaron un 80-90% de confluencia con 0,05% de tripsina /0,02% de EDTA. A continuación, las células se cultivaron en unión ultrabaja placa de 6 pocillos (Corning Costar, MA, EE.UU.) en medio RPMI-1640, mientras que otras condiciones que las descritas para el cultivo adjunto se mantuvieron. Las células se cultivaron a una densidad de 2 x 10
5 células /ml durante 48 h. a continuación, se recogieron las células en suspensión y se prepararon en una suspensión de células individuales mediante tratamiento 1 mM de EDTA. Luego, las células se lavaron con medio RPMI-1640 completo. La viabilidad celular se midió usando un contador de células automatizado. Se utilizaron células viables para experimentos adicionales.
3. ensayo de viabilidad celular y la proliferación celular ensayo
Las células se determinó la viabilidad por el ensayo de MTT. Las células se sembraron a una densidad de 1 x 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos durante la noche. Después de que se trataron con varias concentraciones de TCS por 24 h. Después del tratamiento, el medio fue reemplazado luego con una solución de MTT (5,0 mg /ml en PBS) y se incubó a 37 ° C durante 4 h. A continuación, el medio se reemplazó con 100 l de DMSO para solubilizar el producto de formazán y la intensidad del producto de formazano se midió a 570 nm usando un lector de microplacas (Anthros, Durham, NC, EE.UU.). La viabilidad celular se expresó como el porcentaje calculado a partir de la densidad óptica de las células tratadas relativa a las células controladas. Mientras tanto, también se determinó celular proliferativo usando el ensayo MTT. Las células se sembraron a una densidad de 2 x 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Después de eso, las células se trataron con varias concentraciones de TCS de 0, 24, 48, y 72 h. La proliferación celular se midió mediante el ensayo MTT como se describe en la evaluación de la viabilidad celular.
4. ensayo de tinción nuclear
apoptótica y la muerte celular necrótica se determinaron por Hoechst33342 y PI co-tinción. Las células se sembraron a una densidad de 1 x 10
4 células /pocillo en la placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Las células se trataron luego con TCS durante 24 h. Después de los tratamientos específicos, las células se incubaron con 10 mg /ml de Hoechst33342 y 5 g /ml de PI durante 30 minutos a 37 ° C. Las células apoptóticas haber condensan la cromatina y /o núcleos fragmentados y células necróticas PI-positivo se visualizaron y se calificó con un microscopio de fluorescencia (Olympus IX51 con DP70, Olypus America Inc., Valley Center, PA, EE.UU.).
5. Análisis del ciclo celular
Después del tratamiento de las células con TCS durante 48 h, las células se tripsinizaron y se fija con 70% de etanol absoluto a -20 ° C durante la noche. a continuación, las células se lavaron con PBS frío y se incubaron en solución de PI que contiene 0,1% de Triton-X, 1 mg /ml de RNasa, y 1 mg /ml de yoduro de propidio a 37 ° C durante 30 min. ADN en células enteras fueron teñidas con PI y el perfil del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ, EE.UU.).
6. Colonia ensayo de formación de
Tras el tratamiento con TCS, el crecimiento independiente de anclaje se examinó mediante ensayo de formación de colonias de acuerdo con el método de Koleske et al. [38] con modificaciones menores. Brevemente, las células se trataron con TCS a concentraciones no tóxicas durante 24 h y luego tratados con EDTA 1 mM para preparar la suspensión de células individuales. Las células se suspendieron en medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS y 0,33% de agarosa, y luego 250 l que contenía 1 × 10
3 células fueron incorporados como una segunda capa en una placa de 24 pocillos sobre una capa 500 de base l que contiene 10% FBS y 0,5% de agarosa. Las células se alimentaron cada 3 días mediante la adición de 250 l de medio completo. Después de 7 y 10 días, las colonias resultantes fueron fotografiadas en × 4 aumentos. el número de colonias y el tamaño de las colonias se determinaron sobre la 10
º día de la cultura.
7. Filopodios caracterización
filopodios se caracterizó por el ensayo de tinción con faloidina-rodamina como se describe en Kowitdamrong et al. [39]. Las células se trataron con TCS a concentraciones no tóxicas durante 24 h en estado de desconexión y se sembraron a una densidad de 2 × 10
3 células /pocillo en la placa de 96 pocillos durante 4 h. Después, las células se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min a 37 ° C, se permeabilizaron con 0,1% Triton-X100 en PBS durante 4 min, y se bloquearon con 0,2% de BSA durante 30 min. Después de eso, las células se incubaron con faloidina 1:100-rodamina en PBS durante 15 min y se lavaron con PBS 3 veces. a continuación, filopodios fue fotografiada por un microscopio de fluorescencia (Olympus IX51 con DP70).
8. ensayo de migración
migración se determinó por el ensayo de cámara de Boyden como previamente como se describe en Kowitdamrong et al. [39]. Las células se trataron previamente con TCS a concentraciones no tóxicas durante 24 h en la condición individual. A continuación, las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
4 células /pocillo en una placa de 24-transwell superior del filtro transwell (8-M de poros) en el medio que contiene 0,1% de suero y 500 l de medio completo fue añadido a la cámara inferior. Después de 24 h, las células no migradas en la membrana lado superior se eliminaron por limpieza de algodón hisopo. Las células que migraron al lado inferior de la membrana se tiñeron con 10 mg /ml Hoechst33342 para 30 min. Después las células se visualizaron y se calificó con un microscopio de fluorescencia (Olympus IX51 con DP70).
9. Invasion ensayo
El ensayo de invasión se realizó utilizando cámaras 24-transwell como previamente como se describe en Kowitdamrong et al. [39]. Transwells se recubrieron con 50 l de 0,5% matrigel en la superficie superior de la cámara y se incubaron durante la noche a 37 ° C en un incubador humidificado. Después del tratamiento con TCS a concentraciones no tóxicas para las 24 h en la condición individual, las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
4 células /pocillo en la cámara superior en medio que contiene 0,1% de suero y 500 l de medio completo fue añadido a la cámara inferior. Después de 24 h, las células no invadidos en el lado superior de la membrana se eliminaron mediante limpieza de algodón hisopo. células invadidas en el lado basolateral de la membrana se fijaron con metanol absoluto frío durante 10 min y se tiñeron con 10 mg /ml Hoechst33342 para 30 min. Las células se visualizaron después y se calificó con un microscopio de fluorescencia (Olympus IX51 con DP70).
10. El análisis de transferencia Western
Después de tratamientos específicos, las células se incubaron en un tampón de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), X-100, cloruro de sodio 150 mM, 10% de glicerol, sodio 1 mM 1,5% de Triton ortovanadato, 50 mM de fluoruro de sodio, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, y una mezcla de inhibidores de la proteasa comercial (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.) durante 2 horas en hielo. Los lisados celulares se recogieron y se determinó el contenido de proteína utilizando el método de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Cantidades iguales de proteína de cada muestra fueron desnaturalizadas por calentamiento a 95 ° C durante 5 min con tampón de carga y posteriormente se cargaron en una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 7,5% para la detección de marcadores de EMT y la expresión de E-cadherina o 10% de SDS-poliacrilamida electroforesis en gel para la detección de la expresión de proteína relacionada con el migratoria. Después de la separación, las proteínas se transfirieron a 0,45 M membranas de nitrocelulosa. Las membranas transferidas se bloquearon en leche en polvo 5% sin grasa en TBST (25 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 125 mM, 0,05% de Tween 20) durante 1 h, y después se incubaron con un anticuerpo primario específico (1: 1000 dilución) durante la noche a 4 ° C. Las membranas se lavaron tres veces con TBST durante 5 min y se incubaron con rábano picante anticuerpos peroxidasa acoplada específicos de isotipo secundarios (1:2,000 de dilución) para 2 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron tres veces con TBST durante 5 min y los complejos inmunes se detectaron mediante la mejora con un sustrato quimioluminiscente y se cuantificaron usando software analista /PC densitometría (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.).
11. El análisis estadístico
Los datos se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes y se presentó como media ± error estándar (SE). Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA de una vía y prueba post hoc (prueba de Turquía) a un nivel de significación de
P-valores
& lt; 0,05. SPSS 17,0 se utilizó para todos los análisis estadísticos.
Resultados
1. Efectos de TCS en anoikis células H460 resistentes
Se utilizaron células de cáncer resistentes Anoikis como modelo para el estudio de las CTC [36], [37], [40]. Se generaron células de cáncer de pulmón anoikis resistentes como se describe en Materiales y Métodos. Se encontró que las células H460 separados forman espontáneamente agregados multicelulares después del cultivo durante 48 h (Figura 1B). Para elucidar el posible efecto de TCS en las células de cáncer de pulmón de CTC, efecto citotóxico del compuesto sobre las células se caracterizó primero. TCS en las concentraciones que van desde 0,069 M y 69 se encontró en el plasma de sujetos expuestos-TCS [4]. Por lo tanto, las células resistentes anoikis se incubaron con TCS en las concentraciones de 0 a 10 mM durante 24 h y la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. La Figura 1C muestra que el tratamiento TCS disminuyó significativamente la supervivencia celular a la dosis de 10 micras, con aproximadamente 80% de las células restantes viable, mientras que el tratamiento de las células con TCS en 0-7,5 M no causó ningún efecto tóxico significativo. ensayo de tinción /PI Hoechst33342 confirmó que la apoptosis y la necrosis no fueron detectables en las células tratadas con TCS en 0-7,5 M. Las células apoptóticas con núcleos fragmentados o condensados solamente se detectaron en las células tratadas con 10 mM TCS (Figuras 1D y E). Por lo tanto, se utilizaron las concentraciones de TCS en 0-7,5 M durante los experimentos siguientes.
Después de haber mostrado el efecto tóxico de TCS en anoikis células resistentes, el próximo investigó los efectos de TCS en la proliferación celular y el ciclo celular. Las células se trataron con concentraciones no tóxicas de TCS de 0-72 h y la proliferación de las células se determinó como se describe en Materiales y Métodos. respuesta de proliferación de células resistentes anoikis a TCS se muestra en la Figura 1F. las células tratadas con TCS no mostraron diferencias significativas en cuanto a la proliferación celular en comparación con las células control no tratadas. Estos resultados fueron confirmados por análisis del ciclo celular usando PI y citometría de flujo. Los resultados indicaron que el tratamiento TCS no causó efectos significativos en el ciclo celular (Figuras 1G y 1H). En conjunto, los resultados sugieren que TCS posee ningún efecto proliferativo sobre células H460 anoikis resistentes en condiciones normales de cultivo.
2. TCS promover el crecimiento celular independiente del anclaje en forma
Dado que el crecimiento independiente de anclaje de las células de cáncer se ha demostrado que aumentar la metástasis, el próximo investigó el efecto de TCS en el crecimiento de células de cáncer en tales condiciones. Al hacer esto, las células resistentes anoikis H460 fueron tratados con TCS durante 24 h antes de que se sometieron a ensayo de formación de colonias. Las células se siembran a continuación en la capa de agarosa para evitar la interacción célula-célula y el apego. número de colonias y tamaño de las colonias se obtuvieron por fotografiar y contando después de que las células se cultivaron durante 7 y 10 días. La formación de colonias se muestra en la Figura 2A. número de colonias y tamaño de las colonias de cada tratamiento se calcularon como porcentaje del grupo de control y se muestra en la Figura 2B y C, respectivamente. Los resultados indicaron que TCS a las concentraciones de 5 y 7,5 M aumentó significativamente la formación de colonias de células H460 anoikis resistentes. Sin embargo, TCS a ambas concentraciones redujo significativamente tamaño de las colonias en comparación con la del grupo de control no tratado. Estas observaciones indicaron que TCS promovió la supervivencia independiente del anclaje de las células, pero disminuyó la tasa de crecimiento de las células en la condición individual. Nuestros resultados se compone con los hallazgos anteriores de que el aumento de la supervivencia independiente del anclaje con baja capacidad proliferativa se ha observado en las células de cáncer sometidos a EMT [11], [12], [41], [42].
Las células (a) se trataron previamente con TCS (0-7,5 M) durante 24 h y se sometieron a ensayo de formación de colonias en agar blando, como se describe en "Materiales y Métodos". campos representativos de tres experimentos independientes se fotografiaron después de que las células se cultivaron durante 7 y 10 días. La barra de escala es de 1.000 m. (B-C) Número de la colonia y colonia de tamaño se determinó mediante analizador de imágenes en la 10
º día de la cultura. Los valores son medias de las tres muestras por triplicado independientes ± SE. *
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. & Lt; 0,05 frente a los no tratados de control de
3. TCS la inhibición de la interacción célula-célula
La pérdida de adhesión célula-célula se encontró en las células durante el proceso de EMT como un resultado de cadherina conmutación [7], [8]. Para examinar el efecto de TCS en la adhesión célula-célula de anoikis resistentes H460 células, se sembraron las células en 24 pocillos de baja fije la placa a una densidad de 1,5 × 10
5 células /pocillo y los trataron con concentraciones no tóxicas de TCS. Se observó la interacción célula-célula en la formación de la agregación de células y fotografió usando un microscopio de contraste de fase. tamaño de los agregados y el número se determinaron como en relación con el control no tratados, calculada. La Figura 3A muestra que el tratamiento TCS alterado de manera significativa el comportamiento agregado de las células a la suspensión de células individuales. La adición de TCS como resultado la reducción significativa del número y tamaño de los agregados multicelulares de una manera dependiente de la dosis (Figura 3B y C). Estos resultados sugieren que TCS pérdida de adhesión célula-célula de anoikis células H460 resistentes que es una característica dominante de las células sometidas a EMT promovió
.
Las células (A) se trataron con TCS (0-7,5 M) para 12 , 24 o 48 h en la interacción condición y célula-célula individual fue fotografiado. La barra de escala es de 1.000 m. (B-C) Después del tratamiento con TCS (0-7,5 M) durante 24 horas en condición individual, tamaño de agregados y el número total se determinó mediante analizador de imágenes. Los datos medios actuales de las tres muestras por triplicado independientes ± SE. *
P
. & Lt; 0,05 frente a los no tratados de control de
4. TCS aumento de la expresión de marcadores de EMT
A continuación se investigó el efecto del tratamiento sobre los marcadores de EMT TCS incluyendo N-cadherina, vimentina, caracol, y la babosa. células H460 anoikis resistentes fueron tratados con concentraciones no tóxicas de TCS durante 24 h y EMT marcadores fueron evaluados por Western Blot. Las figuras 4A y B muestran que el nivel de expresión de E-cadherina se redujo significativamente en respuesta al tratamiento TCS de una manera dependiente de la concentración. Además, TCS mejora de forma significativa el aumento de la N-cadherina, vimentina, barra, y el caracol. La expresión de caracol se mejoró significativamente por el tratamiento TCS a los 5 y 7,5 M de una manera dependiente de la dosis, mientras que la expresión de Slug se indujo únicamente significativamente por el tratamiento con TCS en 7,5 M. Estos resultados sugieren que TCS aumentó fenotipos EMT en estas células.
H460 células resistentes (A) Anoikis fueron tratados con TCS (0-7,5 M) durante 24 horas en condición individual. El nivel de N-cadherina, E-cadherina, vimentina, babosas y caracoles se determinó por Western Blot. Las transferencias se volvieron a sondar con β-actina para confirmar la igualdad de carga. (B) Las señales de inmunotransferencia se cuantificaron por densitometría y datos de la media de experimentos independientes se normalizaron a los resultados. Los datos medios actuales de las tres muestras por triplicado independientes ± SE. *
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. & Lt; 0,05 frente a los no tratados de control de
5. TCS mediada por células EMT mejora de la migración y la invasión
Una característica importante de las células cancerosas agresivas es su alta capacidad de migrar e invadir [43], [44]. EMT es reconocido como un importante factor que facilita la motilidad celular [12], [45]. Las células se trataron con TCS a concentraciones no tóxicas durante 24 h y se determinaron los comportamientos de migración y la invasión de las células como se describe en Materiales y Métodos. Figura 5A indica que las células tratadas con TCS exhiben una mayor polaridad y filopodios. Filopodios de las células tratadas con TCS se tiñó con faloidina-rodamina como se muestra en la Figura 5B. TCS-células tratadas exhibieron salientes filopodios se acumulan en la frontera de las células de una manera dependiente de la dosis. Además, la migración y la invasión de ensayo revelaron que TCS aumento de la migración celular y la invasión (Figuras 5C y D). Los resultados anteriores sugieren que la inducción de la EMT en el tratamiento TCS promovió la formación de filopodios y potenció las capacidades migratorias e invasivas de las células H460 resistentes anoikis.
Las células (A) fueron tratados con TCS en 0-7,5 M durante 24 horas y luego se adjunta en placas de cultivo convencionales para 4 h. La morfología celular se detectó mediante microscopía de contraste de fase. La barra de escala es de 25 micras. (B) Después del tratamiento indicado, filopodios y las células viables fueron detectados por faloidina-rodamina o manchas Hoechst33342, respectivamente. Las células se visualizaron bajo microscopio de fluorescencia. protuberancias filopodios de cada tratamiento se indican mediante flechas. La barra de escala es de 5 micras. (C) Las células se trataron previamente con TCS (0-7,5 M) durante 24 h. ensayo Transwell se utilizó para investigar la migración de células. Las células migratorias en el lado basolateral de la membrana se tiñeron con Hoechst33342 y visualizados bajo microscopía de fluorescencia. La barra de escala es de 50 micras. Los números medios de células migratorias en cada campo en el lado basolateral de la membrana se representaron gráficamente con respecto al grupo control. Los valores son medias de las tres muestras por triplicado independientes ± SE. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a control de no tratado. (D) Después del tratamiento con TCS (0-7,5 M) durante 24 h, se evaluó utilizando transwell revestido con matrigel como se describe en "Materiales y Métodos" invasión celular. células invadidas en el lado basolateral de la membrana se tiñeron con Hoechst33342 y visualizados bajo microscopía de fluorescencia. La barra de escala es de 50 micras. Los números medios de células invadidas en cada campo través de la membrana se representaron gráficamente en relación con el grupo control. Los valores son medias de las tres muestras por triplicado independientes ± SE. *
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Además, las proteínas efectoras corriente abajo que son responsables de la motilidad celular se determinaron utilizando el Western Blot. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de TCS durante 24 h y se sometieron a análisis de transferencia Western. Los niveles de expresión de proteínas relacionadas con migratorias incluyendo activan FAK (FAK fosforilada, Tyr 397), FAK, que se activa Akt (Akt fosforilada, Ser 473), Akt, que se activa Rac1 (Rac1-GTP), y se activa RhoA (RhoA-GTP) eran investigado. Las figuras 6A y B muestran que el tratamiento TCS aumentó significativamente el nivel de FAK fosforilada, Akt se activa, y activa Rac1-GTP. Sin embargo, TCS poseía ningún efecto significativo en el nivel de RhoA activada. Estos resultados sugieren que inducida por TCS EMT promovió la motilidad de anoikis resistentes células H460 mediante la activación de FAK /Akt vía de señalización, así como la activación de Rac1.
células H460 resistentes (A) Anoikis fueron tratados con TCS en 0 -7,5 mu M durante 24 h en la condición individual y luego adjunta en placas de cultivo convencionales durante 4 h. El nivel de pFAK (Tyr 397), FAK, pAkt (Ser 473), Akt, Rac1 activado (Rac1-GTP) y RhoA activada (RhoA-GTP) se determinó por Western Blot. Las transferencias se volvieron a sondar con β-actina para confirmar la igualdad de carga. (B) Las señales de inmunotransferencia se cuantificaron por densitometría y datos de la media de experimentos independientes se normalizaron a los resultados. Los valores son medias de las tres muestras independientes triplicados ± SE. *
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Discusión
El cáncer de pulmón se ha ganado la mayoría de las atenciones en el campo de la investigación del cáncer ya que este tipo de cáncer se considera como una causa importante de la mortalidad relacionada con el cáncer [46]. De hecho, la alta tasa de metástasis en un cáncer, hace que sea más peligrosa para la vida y en la mayoría de los casos se detecta metástasis en el momento del primer diagnóstico [47]. Debido a que la capacidad de las células cancerosas a la metástasis puede ser aumentada por el proceso de EMT [9], [12], [48], el presente estudio informar de la efecto regulador positivo de TCS en la EMT de células de cáncer humano pone de manifiesto la posible novela toxicidad causada por este compuesto.
TCS ha sido ampliamente utilizado por más de 30 años en productos de cuidado de la salud, así como en dispositivos médicos. TCS es fácil y completamente absorbido tras la administración oral. TCS se ha identificado en la orina, plasma, y la leche materna de los seres humanos con una amplia gama de niveles dependiendo de la ingesta diaria de la persona, su la concentración en los productos, así como la ruta y frecuencia de administración [2], [3]. Las concentraciones bajas y altas de TCS en el plasma humano han sido reportados en 0,02 y 20 mg /ml (0.069 m) y 69, respectivamente [4]. Anteriores estudios informaron los posibles efectos de TCS en la inducción de formaciones de adenoma y carcinoma hepatocelular en el modelo de roedores [2]. Recientemente, Ma et al. (2013) encontraron que TCS reduce la metilación del ADN mundial (DMG) en células HepG2 y se propone la reducción como el posible mecanismo de TCS promotor de tumores en roedores [49]. Desde la hipometilación del ADN global está asociada con la expresión génica aberrante, pérdida de impresión, la inestabilidad cromosómica y anomalías, se ha demostrado que desempeñan un papel clave en el control de EMT y metástasis del cáncer [50].