Extracto
Recientemente, la medicina y hierbas medicinales chinas tradicionales han atraído más atención en todo el mundo por su eficacia anti-tumoral. Celastrol y Triptolida, dos componentes activos extraídos de la hierba china
tripterygium wilfordii Hook F
(conocida como Lei Gong Teng o trueno de Dios Parra), han mostrado efectos antitumorales. Celastrol fue identificado como un 26 s naturales inhibidor del proteasoma que promueve la apoptosis de las células e inhibe el crecimiento del tumor. El efecto y el mecanismo de triptólido sobre el cáncer de próstata (CaP) ha sido poco estudiada. Aquí hemos demostrado que triptólido, más potente que celastrol, inhibe el crecimiento celular y la muerte celular inducida en LNCaP y PC-3 líneas celulares. Triptólido también inhibió significativamente el crecimiento del tumor PC-3 xenoinjertado en ratones desnudos. Por otra parte, triptólido indujo apoptosis de las células CaP través de la activación de caspasas y la escisión de PARP. Desequilibrio entre Sumoylation y desumoylation se informó a desempeñar un papel importante en la progresión del CaP. proteasa de SUMO-1 específica (SENP1) fue pensado para ser un marcador potencial y objetivo terapéutico de CaP. Es importante destacar que se observó que triptólido el regulado expresión SENP1 tanto en los niveles de proteína y ARNm de maneras dependientes de la dosis y dependientes del tiempo, resultando en un Sumoylation celular mejorada en células de CaP. Mientras tanto, Triptolida disminuyó AR y la expresión de c-Jun a las maneras similares, y suprime la actividad de transcripción c-Jun y AR. Además, SENP1 knockdown o ectópico, AR expresión en células de CaP c-Jun e inhibió los efectos de triptólido anti-CaP. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que Triptolida es un compuesto natural con potencial valor terapéutico para el CP. Su actividad anti-tumor se puede atribuir a mecanismos que implican la regulación por disminución de SENP1 que restaura Sumoylation y deSUMOyaltion equilibrio y la regulación negativa de la expresión de AR y c-Jun que inhibe la transcripción AR y c-Jun mediada en CaP.
Visto: Huang W, T Él, Chai C, Yang Y, Zheng Y, Zhou P, et al. (2012) Triptolida inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata y regula a la baja la proteasa de SUMO-1 Expresión específica. PLoS ONE 7 (5): e37693. doi: 10.1371 /journal.pone.0037693
Editor: Mateo Bogyo, Universidad de Stanford, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Abril, 2011; Aceptado: April 26, 2012; Publicado: 30 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por el Proyecto de Investigación de la Industria Forestal Nacional de Bienestar público (201204603), Programa para el Nuevo siglo talentos excelentes en la Universidad (NCET-08 a 0467) y 100 talentos Programa de la provincia de Shaanxi de China para Lei Ming. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia, aunque dos co-autores son de una empresa comercial (Corporación Bio-farmacéutica) que han contribuido algunos reactivos o herramientas de análisis para los experimentos que participan en este documento. La compañía también tiene intereses financieros no existen o no financieras que compiten. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El aumento constante de las tasas de incidencia y mortalidad de cáncer insta a los investigadores a realizar un gran esfuerzo en la búsqueda de nuevos fármacos antitumorales o terapias. compuestos extraídos de hierbas naturales, tales como Taxol, han sido ampliamente utilizados en la terapia del cáncer. La medicina tradicional china promete una alternativa importante y útil en el tratamiento del cáncer. Muchos compuestos activos extraídos de las hierbas chinas han demostrado la eficacia antitumoral. Triptólido y celastrol, dos componentes activos extraídos de la hierba china
tripterygium wilfordii Hook F
(conocida como Lei Gong Teng o trueno de Dios Parra) utilizado para la terapia de la artritis reumatoide, han demostrado efecto anti-tumoral y apoptosis de inducción [ ,,,0],1], [2]. Celastrol ha sido identificado como un inhibidor del proteasoma natural que hace que la acumulación de proteínas ubiquitinated y sustratos del proteasoma I? B-a, Bax y p27. Celastrol también induce la apoptosis en células de CaP y reduce el tumor xenoinjertado en ratones [1]. Triptólido es una lactona diterpeno con potentes efectos inmunosupresores y las propiedades anti-tumorales en diferentes tipos de cáncer, incluyendo melanoma [2], el cáncer [3] de mama, cáncer de páncreas [4], cáncer de próstata (CaP) [5] y otros. Triptólido induce apoptosis de las células a través de la inhibición de HSP70 en células de cáncer de páncreas [4], [6], e interrumpe la vía IL6R-JAK /STAT en células de cáncer de colon [7]. En células de carcinoma anaplásico de tiroides humanos, triptólido reduce significativamente la expresión de los genes diana NF-kappa B ciclina D1, vascular factor de crecimiento endotelial (VEGF), y de tipo activador del plasminógeno uroquinasa [8]. Triptólido actúa ya sea independientemente de, o en parte dependiente de p53 para inhibir el crecimiento de tumores sólidos xenoinjertados en ratones [9], [10]. Sin embargo, el mecanismo molecular de eficacia y Triptolida en CaP son menos estudiado.
Sumoylation es una novela de tipo ubiquitina modificación postraduccional. Cuatro proteínas diferentes SUMO, SUMO-1, SUMO-2, SUMO-3 y SUMO-4, se han identificado [11]. Similar a la ubiquitinación, SUMOyaltion implica una serie de procesos enzimáticos. El SUMO madura se activa por conjugación a la enzima E1 (SAE1 /SAE2), se transfirió a la enzima E2 (Ubc9) y se ligó al residuo de lisina específico de las proteínas diana por una enzima E3 [11]. Sumoylation modula múltiples procesos biológicos celulares tales como el transporte nuclear, ciclo celular, remodelación de la cromatina, regulación de la transcripción, la reparación del ADN, y la modificación de proteínas de ubiquitinación y la degradación de [12]. Hay amplia evidencia que muestra que Sumoylation participa en el desarrollo de enfermedades humanas incluyendo cáncer.
Sumoylation es un proceso reversible. Las moléculas SUMO conjugados pueden ser escindidos por proteasas-SUMO específica (SENPs). Seis proteínas SENP se han identificado que las proteínas diana deSUMOylate de diferentes maneras. SENP1 y SENP2 pueden quitar los 3 sumos de proteínas diana, mientras que otros SENPs muestran especificidad para SUMO-2 y SUMO-3 [13]. Desumoylation se ha demostrado que involucrar en la progresión de enfermedades humanas [14], tales como CaP [15] y el cáncer de mama [16]. Anteriormente, Cheng et al [15] informaron de que desumoylation juega un papel importante en el desarrollo del CaP. Encontraron que SENP1 fue sobre-expresa en muestras de CaP humanos pero no en células de la próstata humanos normales. la inhibición de siRNA redujo SENP1 CaP crecimiento celular. Además, sus resultados iniciales
in vivo en ratones transgénicos
indicaron que la sobreexpresión de SENP1 conduce al desarrollo de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) en una edad temprana. Además, SENP1 mejora notablemente la actividad de transcripción AR dependiente por desumoylation de HDAC1 [17] y la transcripción de c-Jun-dependiente por deSUMOylating el dominio CRD1 de p300 [18], que todos los implicados en la tumorigénesis de CaP. En conjunto, estos datos sugieren SENP1 juegan un papel importante en la progresión del CaP y podría ser una novela CaP marcador y dianas terapéuticas.
En el presente estudio, hemos demostrado que la proliferación triptolida inhibió significativamente el CaP celular
in vitro
y xenoinjerto PC-3 progresión tumoral
in vivo
, triptolida la apoptosis inducida también en células de CaP. La eficacia anti-tumor de triptolida fue más potente que celastrol. Mientras tanto, nos encontramos Triptolida significativamente reducido regulado la expresión SENP1 tanto en mRNA y los niveles de proteína, lo que resulta en una mayor Sumoylation celular en células de CaP. Por otra parte, también Triptolida regulada negativamente AR y la expresión de c-Jun y suprimió AR y transcripción c-jun. En general, nuestros resultados experimentales sugieren que Triptolida es un compuesto potencial natural para la terapia de CaP.
Resultados
Triptolida la proliferación de células de CaP, inhibió
in vitro
tanto triptolida (Fig. 1A) y celastrol (Fig. 1B) pertenecen a terpenos y son dos componentes activos extraídos de la hierba china
Tripterygium wilfordii Hook F
[1], [19]. Celastrol, como un inhibidor del proteasoma potente, inhibe la proliferación celular e induce la apoptosis CaP celular [1]. Triptólido se ha informado para suprimir la proliferación celular en muchos tipos de cáncer, pero su eficacia en las moléculas de CaP y de destino no han sido claramente estudiado. Para determinar la actividad anti-tumor de triptolida en células de CaP y comparar con celastrol, se realizó ensayo de ensayo de la curva de crecimiento y la viabilidad celular usando dos líneas celulares de CaP, LNCaP (dependiente de andrógenos) y las células PC-3 (independientes de andrógenos). Se confirmó que tanto triptólido y celastrol causaron una inhibición significativa de la proliferación en las células LNCaP y PC-3. En el ensayo de curva de crecimiento, triptólido inhibió significativamente la proliferación de células de CaP incluso a dosis de 5 nM en células LNCaP (Fig. 1C) y 10 nM en células PC-3 (Fig. 1E). Por el contrario, celastrol solamente suprimida CaP crecimiento celular a dosis altas como 1 M en células LNCaP (Fig. 1D) y 0,5 M en la célula PC-3 (Fig. 1F). Estos resultados mostraron que triptólido puede suprimir de manera eficiente la proliferación de células de CaP. A fin de determinar el efecto citotóxico de triptólido en células CaP y comparar con celastrol, se llevó a cabo el ensayo de viabilidad celular mediante el método MTT. Ambas líneas celulares de CaP se trataron con amplias dosis de triptólido o celastrol, de 0,01 M a 5 M, durante 48 h. Como se muestra en la Figura 1G, a baja dosis (por ejemplo, 0,02 M), triptólido era suficiente para matar las células LNCaP mayoría, sino proporción residual de células viables persistió incluso en presencia de concentraciones más altas de triptólido. Fue en contraste con el efecto citotóxico dependiente de la dosis de celastrol. Sin embargo, se requiere una dosis mucho mayor de celastrol para alcanzar un efecto citotóxico similar con 0,02 M de triptólido. patrón similar se observó en el ensayo de viabilidad celular de células PC-3 (Fig. 1H). Para cuantificar la eficacia de dos compuestos sobre células CaP, se calculó la IC
50 valor de acuerdo con los datos de viabilidad celular. Triptólido tenía una IC mucho menor
50 valores para las dos líneas celulares en comparación con celastrol (Tabla 1). Estos datos demostraron que triptólido es un agente eficaz para inhibir la proliferación de células de CaP y para inducir la muerte celular.
(A) y (B) La estructura química de triptólido (A) y celastrol (B), respectivamente. las células (C), (D), (E) y (F) CaP fueron tratados con dosis indicadas de triptólido o celastrol, el número de células viables se contaron todos los días durante 6 días. Todos los ensayos se realizaron por triplicado, y los datos mostrados son la media ± SD de tres experimentos independientes. * Indica P & lt; 0,05 (en comparación con el control). (C) Efecto de triptolida en las células LNCaP. (D) Efecto de celastrol en las células LNCaP. (E) Efecto de triptólido en células PC-3. (F) Efecto de celastrol en células PC-3. (G) y (H) CaP células se trataron con las concentraciones indicadas de triptolida o celastrol y células La viabilidad se determinó mediante el ensayo de MTT. Todos los ensayos se realizaron por triplicado, y los datos mostrados son la media ± SD de cuatro experimentos independientes. (G) Efecto de triptólido y celastrol en células LNCaP. (H) Efecto de triptólido y celastrol en células PC-3.
apoptosis inducida en células de CaP Triptolida
in vitro
A continuación evaluó si Triptolide- y la muerte celular inducida por celastrol correspondían a una respuesta apoptótica. LNCaP y células PC-3 fueron tratados con 1 mM de triptólido y celastrol durante 24 h, respectivamente, se tiñeron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anexina V (AV) y 50 mg /ml de yoduro de propidio (PI), después se analizaron por microscopía de fluorescencia y por citometría de flujo. La detección simultánea de externalización de fosfatidilserina y la pérdida de integridad de la membrana con AV-FITC y PI, respectivamente, discrimina entre apoptosis temprana (AV +), apoptosis tardía llevando eventualmente a la necrosis secundaria (AV + /PI +) y la necrosis primaria (PI +). Como se muestra en la Figura 2A y la Figura 2B, el tratamiento con triptólido y celastrol dado lugar a una mayor proporción de células con AV positivo y /o tinción con PI. Análisis de citometría de flujo mostró que el tratamiento con triptólido y celastrol causada respectivamente 40% y 30% de las células LNCaP a ser AV + /PI-, mientras que sólo & lt; 6% de vehículo (DMSO) células tratadas mostraron una respuesta apoptótica. Los dos compuestos tenían efecto relativamente moderado en la inducción de apoptosis en células PC-3, 8,77% y 15,2%, respectivamente, frente al 4% en vehículo (DMSO) células tratadas (Fig. 2C y Fig. S1). Estos resultados mostraron que tanto triptólido y celastrol inducen la apoptosis en células de CaP. Además, las células LNCaP fueron más sensibles a triptólido y celastrol que las células PC-3. Se ha informado de que triptólido induce la apoptosis a través de cascada de caspasas [4] - [6]. A fin de determinar si la caspasa está implicado en la apoptosis inducida por triptólido en células de CaP, se investigó el estado de la caspasa-3 en células de CaP tratados con varias dosis de triptólido o celastrol durante 24 h o con 1 M de triptólido y celastrol para tiempos deseados. La activación de las caspasas-3 se monitorizó mediante Western blot utilizando un anticuerpo policlonal que reconoce tanto sus fragmentos de escisión activos procaspasa-3 y, p17 y p12. Como se muestra en la Figura 2D-2E, la escisión de la procaspasa-3 se mejoró en células LNCaP tratadas con triptólido, y, en menor grado, en células LNCaP tratadas con celastrol. Sólo niveles muy bajos de la caspasa-3 fragmentos fueron detectables en celastrol o células PC-3 tratados con triptólido. Luego seguimos el estado de enzima poli nuclear (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) que es uno de los principales objetivos de escisión de la caspasa-3. la escisión de PARP se ha mejorado en las células LNCaP tratadas con triptólido, y, en menor grado, en células LNCaP tratadas con celastrol (Fig. 2F). Una vez más, los niveles más bajos de fragmentos de PARP fueron detectables en celastrol o triptólido tratos células PC-3 (Fig. 2G). En conjunto, estos datos demuestran que triptólido, y, en menor grado, celastrol, inducen la apoptosis en células de CaP asociados con la activación de la caspasa-3 y la escisión de PARP.
(A) y (B) la observación Microscopía de fluorescencia de Triptolide- y Celastrol- indujeron apoptosis en LNCaP (a) y las células PC-3 (B). Después del tratamiento con 1 mM celastrol o triptolida durante 24 h, LNCaP y PC-3 células se incubaron con AV-FITC (verde) y PI (rojo). Representante de campo brillante y las imágenes fluorescentes se muestran. detección (C) de citometría de flujo de la apoptosis en LNCaP y células PC-3 tratados como los anteriores. Porcentaje de células intactas (AV /PI), (AV + /PI), se presentan células apoptóticas tempranas células apoptóticas /necróticas finales (AV + /PI +) y células necróticas (AV /PI +). (D) y (E) Análisis de transferencia Western de la proteína caspasa-3 en células PC-3 (E) Triptolide- o LNCaP tratadas con celastrol (D) y. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de triptolida o celastrol durante 24 h y se sometieron a análisis. No escindida de caspasa-3 y productos escindidos se indican. α-tubulina se utilizó como control de carga. (F) y (G) Análisis de transferencia Western de PARP y caspasa 3-proteínas en células PC-3 (G) Triptolide- o LNCaP tratadas con celastrol (F) y. Las células fueron tratadas con 1 mM de triptólido o celastrol para tiempos deseados. Sin escindir PARP y la caspasa-3 y sus productos escindidos se indican. α-tubulina se utilizó como control de carga.
Triptolida suprimió el crecimiento del tumor xenoinjertado PC-3
in vivo
Hemos observado que Triptolida puede inhibir la proliferación de células de CaP e inducir la apoptosis de las células
in vitro
. Para determinar la eficacia de triptólido
in vivo
, se llevó a cabo un estudio de xenoinjerto. las células PC-3 se implantaron subcutáneamente en ratones desnudos. Cuando los tumores se hicieron palpables (~ 100 mm
3), los ratones fueron tratados intraperitonneally ya sea con un control del vehículo o de triptólido en 0,4 mg /kg al día durante 15 días. tamaños de los tumores y el peso corporal se midieron cada tres días. Como se muestra en la Figura 3, el volumen (Fig. 3A) y de peso (Fig. 3C) de los tumores de xenoinjertos tratados con triptólido fueron significativamente más pequeños que los del grupo de control (Fig. 3D), lo que indica que triptólido tiene efecto anti-tumor potente
in vivo
. Mientras tanto, no había diferencia significativa en el peso corporal entre el (Fig. 3B) tratado y el grupo control, lo que sugiere que dosis administrada de triptólido no tiene toxicidad significativa para ratones.
células PC-3 (2 × 10
6 por ratón) se inyectaron en ratones desnudos 5 semanas de edad. Cuando crecieron los tumores sólidos a aproximadamente 100 mm
3, los ratones fueron tratados intraperitonneally ya sea con un control del vehículo o de triptólido en 0,4 mg /kg al día durante 15 días. tamaños de los tumores y el peso corporal se midieron cada tres días. (A) Efecto de triptólido en el volumen de tumor de xenoinjerto. (B) Efecto de triptólido en el peso corporal de ratones desnudos. (C) Efecto de triptólido en el peso del tumor de xenotrasplante. . (D) Imagen de xenoinjertos de tumores tratados con o sin Triptolida * indica P & lt;. 0,05 (en comparación con el control)
Triptolida expresión SENP1 las reguladas en células de CaP
Desde Triptolida la proliferación de células CaP inhibida y la apoptosis inducida por las células
in vitro
, y el crecimiento del tumor xenoinjertado suprimido
in vivo
, estábamos interesados en los mecanismos subyacentes a estos efectos antitumorales. Estudios anteriores demostraron que es SENP1-sobreexpresado en células de CaP y muestras de tumores [15]. SENP1 sobreexpresión en ratones transgénicos promueve el desarrollo de lesiones malignas en la glándula de la próstata [15]. Estos datos sugieren que la sobre-expresión de SENP1 media en el desarrollo del CaP y SENP1 podría ser un objetivo potencial para la terapia CaP.
Para investigar si Triptolida regula la expresión SENP1, en primer lugar se analizó el nivel de ARNm SENP1 por PCR en tiempo real en LNCaP y células PC-3 tratados con varias dosis de triptólido o celastrol durante 24 h, o se trataron con 0,1 mM de triptólido o celastrol para tiempos deseados. Como se muestra en la figura 4A y 4B, triptólido disminuyó significativamente los niveles de ARNm de SENP1 en tanto LNCaP y células PC-3 de maneras dependientes de la dosis y dependientes del tiempo. Mientras tanto, celastrol también redujo nivel SENP1 mRNA después de un breve tratamiento a dosis bajas. Por el contrario, a dosis altas y con el tiempo de tratamiento más largo, celastrol mejorado nivel de ARNm SENP1 en ambas líneas celulares de CaP tratados. Para evaluar la eficacia de triptólido inducida por la baja regulación de la expresión SENP1, se determinó la dosis de triptólido necesaria para inducir la disminución del 50% en SENP1 ARNm (IC
50). Ambos LNCaP y PC-3 células se trataron con más de 6 dosis triptolida durante 24 h, como se muestra en la Figura 4C, triptólido indujo eficazmente la disminución del nivel de SENP1 ARNm con IC
50 valor 0,07579 M y 0,07071 M para LNCaP y PC células -3 respectivamente. Medimos aún más el nivel de proteínas en células de CaP SENP1 tratados con triptólido o celastrol. Triptólido fue capaz de disminuir el nivel de proteína SENP1 en (4F Fig.) Modales tanto dependiente de la dosis (Fig. 4D, 4E) y dependiente del tiempo. Por el contrario, celastrol no redujo significativamente el nivel de proteína SENP1 en células de CaP tratados. Estos resultados son consistentes con nuestros resultados QRT-PCR e indican que triptólido suprime la expresión SENP1 en células de CaP, tanto en los niveles de proteína y mRNA.
(A) de triptólido disminución del nivel SENP1 mRNA tanto en LNCaP y células PC-3 en de una manera dependiente de la dosis. Las células fueron tratadas con dosis indicadas de triptólido o celastrol durante 24 h antes del análisis. QRT-PCR se realizaron usando los cebadores específicos para SENP1 y β-actina (utilizado como control interno). (B) Triptolida disminuyó SENP1 nivel de ARNm tanto en células LNCaP y PC-3 de una manera dependiente del tiempo. Las células se trataron con 0,1 mM de triptólido o celastrol durante los tiempos indicados, SENP1 y los niveles de ARNm de ß-actina se determinaron mediante qRT-PCR. (C) Efecto de triptólido en SENP1 nivel de ARNm en células de CaP. IC
50 se muestra como se calcula por Prism 5.04. (D) y (E) de triptólido disminución del nivel de proteína SENP1 en LNCaP (D) y PC-3 (E) de una manera dependiente de la dosis. Las células fueron tratadas con dosis indicadas de triptólido o celastrol durante 24 h antes del análisis de transferencia de Western. α-tubulina se utilizó como control de carga. (F) Triptolida disminución del nivel de proteínas en células de CaP SENP1 de una manera dependiente del tiempo. las células PC-3 fueron tratados con 1 mM de triptólido de tiempo indicado antes de análisis de transferencia de Western. β-actina se utilizó como control de carga. (G) de triptólido mejorada Sumoylation celular en células PC-3. las células PC-3 fueron tratados con 1 mM de triptólido o celastrol de 24 h antes del análisis de transferencia Western utilizando SUMO-1 anticuerpo. NEM se utilizó como control positivo para un inhibidor de proteasa de SUMO.
SENP1 juega un papel importante en los procesos de sumoilación. Como isopeptidase, SENP1 deconjugates SUMO de la proteína sumoylated. Una expresión de SENP1 reducida en células de CaP tratados con triptólido resultaría en un Sumoylation celular mejorada. Para verificar esta expectativa, el nivel Sumoylation celular en células PC-3 se trató con 1 M Triptolida o celastrol durante 24 h se detectó por Western blot utilizando anticuerpos SUMO-1. Las células sin tratamiento, pero se lisaron en tampón de lisis en presencia de 20 mM de N-etilmaleimida (NEM), un potente inhibidor de las enzimas deubiquitinating y de la actividad hidrolasa SUMO, se utilizó un control positivo [20]. Como se muestra en la Figura 4G, comparar para controlar el nivel total de Sumoylation, el tratamiento de triptólido mejora de forma significativa. Curiosamente, también se ha mejorado el nivel celastrol Sumoylation total, pero con menos eficiencia en comparación con Triptolida, lo que podría ser el resultado de su actividad de supresión del proteasoma. Se informó de que Sumoylation de algunas proteínas, tales como HIF1 [12] y PML [21], promueve la degradación de estas proteínas dependiente de ubiquitina. Como un inhibidor del proteasoma, celastrol podría suprimir la degradación de estas proteínas sumoylated e inducir su acumulación. Para confirmar este resultado, hemos realizado experimentos similares utilizando otro anticuerpo monoclonal SUMO-1. Los resultados de transferencia Western mostraron que los niveles de SUMO-1 heterodímeros se incrementaron en triptólido muestras tratadas (Fig. S2A, S2B). También se encontró que el nivel de SUMO-1 monómero se redujo en triptólido muestras tratadas (Fig. S2C). Esto podría ser el resultado de cualquiera de las expresiones SENP1 regulados hacia abajo, o el aumento de SUMO-1 heterodímeros. En general, triptólido es capaz de regular negativamente la expresión SENP1 tanto a nivel de mRNA y de proteínas, lo que resulta en un nivel Sumoylation celular mejorada en células de CaP.
triptólido suprimida del receptor de andrógenos (AR) la expresión en células LNCaP
AR desempeña un papel importante en el desarrollo normal de la próstata y de mantenimiento, y en la progresión del cáncer de próstata. Celastrol se informó para suprimir la expresión AR en las células LNCaP [1]. Hemos planteado la cuestión de si Triptolida inhibe la expresión del RA y la transcripción mediada por AR en células de CaP. Se analizaron nivel AR ARNm en las células LNCaP tratadas con varias dosis de triptólido y celastrol durante 24 h o con 0,1 M de triptólido y celastrol para tiempos deseados por PCR en tiempo real. Como se muestra en la Figura 5A y 5B, triptólido redujo significativamente el nivel de mRNA AR de maneras dependientes de la dosis y dependientes del tiempo. Además, se analizó el nivel de proteína de AR en células LNCaP tratadas con triptólido, con las células tratadas con celastrol como control positivo. Como se muestra en la Figura 5C y 5D, triptólido reduce la expresión de proteínas AR en la misma manera que el nivel de ARNm. Dado que las funciones de AR a través de la unión a andrógenos-respuesta-elementos (Ares) en la región promotora de los genes diana y regula estos andrógenos transcripción genes de respuesta para inducir la proliferación celular [22], la supresión inducida por triptólido de expresión AR podría inhibir la transcripción AR mediada. Para verificar esta hipótesis, la expresión de varios genes objetivos AR en las células LNCaP AR-positivo tratados con varias dosis de triptólido de 24 h se detectó mediante qRT-PCR (Fig. 5E). La expresión de PSA, BARD1, Cdk1, Cdk2 y FKBP51, que se sabe están regulados positivamente por AR, fueron efectivamente suprimida. Estos datos sugieren que triptólido inhibió la actividad de transcripción AR al suprimir la expresión de AR. Además de los genes diana de AR, antígeno prostático específico (PSA) es un marcador importante biológica para el diagnóstico clínico de cáncer de próstata humano [23], [24]. Por lo tanto, hemos detectado aún más el nivel de proteína PSA en el lisado de células LNCaP y medio de cultivo mediante inmunoensayo de quimioluminiscencia (CLIA). nivel de proteína PSA en las células LNCaP y que secretada en el medio se redujo después de 1 tratamiento mu M triptólido (Fig. 5F), mientras que la misma concentración de celastrol mostró efecto menos supresor sobre PSA. En general, estos resultados indican que triptólido suprime la expresión AR e induce la inhibición de la transcripción AR mediada.
(A) de triptólido disminución del nivel AR ARNm en las células LNCaP de una manera dependiente de la dosis. células LNCaP se trataron con las dosis indicadas de triptolida durante 24 h antes del análisis. QRT-PCR se realizó usando los cebadores específicos para la AR y β-actina. (B) Triptolida disminución del nivel de ARNm de AR en células LNCaP de una manera dependiente del tiempo. células LNCaP se trataron con 0,1 mM de triptólido durante los tiempos indicados antes del análisis. (C) de triptólido y celastrol disminuyeron el nivel de proteína de AR en las células LNCaP de una manera dependiente de la dosis. células LNCaP se trataron con dosis indicadas de triptólido o celastrol durante 24 h antes del análisis de transferencia de Western. α-tubulina se utilizó como control de carga. (D) Triptolida disminución del nivel de proteínas en las células LNCaP AR de una manera dependiente del tiempo. células LNCaP se trataron con 0,1 mM de triptólido de tiempos indicados antes del análisis de transferencia de Western. α-tubulina se utilizó como control de carga. (E) de triptólido disminuyó AR genes diana expresión en células LNCaP. células LNCaP se trataron con las dosis indicadas de triptolida durante 24 h antes del análisis qRT-PCR utilizando cebadores específicos respectivos. (F) Triptolida inhibe el nivel de proteína PSA en células LNCaP. células LNCaP fueron tratados con triptólido o celastrol durante 24 h o 48 h. Las alícuotas de medio y lisis celular de las células tratadas se recogieron y el nivel de PSA total se midió por CLIA.
Triptolida las reguladas expresión de c-Jun en células de CaP
oncoproteína c -jun que a menudo se expresa sobre-en las células cancerosas está involucrado en CaP transformación [25]. c-Jun es un componente importante del factor de transcripción AP-1 [26], [27]. Además, c-Jun se activa co-AR actividades de la transcripción, y SENP1 suprime la expresión de c-Jun [18]. Con el fin de determinar si triptólido regula c-Jun expresión, se trataron células de CaP con diversas dosis de triptólido o celastrol durante 24 h, o con 0,1 M de triptólido o celastrol para tiempos deseados. Como se muestra en la figura 6A-6D, la expresión de c-Jun, en los niveles de ARNm y de la proteína, fue suprimida por triptólido de maneras dependientes de la dosis y dependientes del tiempo. Por el contrario, celastrol no tuvo ningún efecto sobre la expresión de c-jun. Para estudiar más a fondo el efecto de triptólido sobre la actividad de c-Jun, analizamos la expresión de genes diana c-Jun mediante qRT-PCR. c-Jun objetivo genes ciclina A2, ciclina D1, ETV1 y p21, que son conocidos por ser de hasta reguladas por c-Jun fueron suprimidos después del tratamiento de triptólido (Fig. 6F). Estos datos indican que Triptolida suprime la expresión de c-Jun a nivel de ARNm y proteínas y resultes en la inhibición de la transcripción mediada por c-jun.
(A) Triptolida disminución del nivel de c-Jun mRNA en células LNCaP y PC-3 en una de manera dosis-dependiente. Las células se trataron con la dosis indicada de triptólido durante 24 h antes de la extracción de RNA y QRT-PCR utilizando los cebadores específicos para c-Jun y β-actina. (B) Triptolida disminución del nivel de ARNm c-Jun en las células LNCaP y PC-3 de una manera dependiente del tiempo. Las células se trataron con 0,1 mM de triptólido de tiempo indicado antes de la extracción de ARN y QRT-PCR. (C) y (D) de triptólido disminuyeron el nivel de proteína c-Jun en LNCaP (C) y PC-3 (D) células de una manera dependiente de la dosis. Las células se trataron con la dosis indicada de triptólido o celastrol durante 24 h antes del análisis de transferencia de Western. α-tubulina se utilizó como control de carga. (E) Triptolida disminuyó c-Jun nivel de proteínas en células LNCaP de una manera dependiente del tiempo. células LNCaP se trataron con 0,1 mM de triptólido de tiempo indicado antes de análisis de transferencia de Western. α-tubulina se utilizó como control de carga. (F) de triptólido inhibida c-Jun genes diana expresión en células LNCaP. LNCaP células fueron tratadas con la concentración indicada de triptolida durante 24 h antes de QRT-PCR análisis de c-Jun genes diana utilizando cebadores específicos respectivos.
El descenso de regulación o sobre-expresión de SENP1, c-Jun o AR inhibe triptolida anti-CP eficacia
Desde que se observó que triptolida suprimió la expresión SENP1, Sumoylation celular mejorada, AR inhibida y la expresión de c-Jun y suprime la transcripción AR /c-Jun-mediada, nos preguntamos si el anti triptolida -PCa eficacia se basa en SENP1, c-Jun o AR expresión en células LNCaP y PC-3. Para responder a esta pregunta, en primer lugar derribaron SENP1, c-Jun o AR expresión de siRNA específico en LNCaP (con siRNA de SENP1, c-Jun o AR) y PC-3 (con siRNA de SENP1 o c-Jun) células. Veinticuatro horas después de siRNA transfección, las células fueron tratadas con 100 nM de triptólido o control del vehículo durante 48 h, el número de células viables se contó entonces. Eficiencia de siRNA Againt SENP1, c-Jun y AR se evaluaron por Western blot (Fig. 7C). Curiosamente, en ausencia de tratamiento de triptólido, silenciamiento de SENP1, c-Jun o AR en las células LNCaP reducción de la viabilidad celular (Fig. 7A). Del mismo modo, el silenciamiento de SENP1 o c-Jun en las células PC-3 también disminuyó la viabilidad celular (Fig. 7B). Esta observación puede indicar que la citotoxicidad de las células de CaP en Triptolida podría resultar de la regulación a la baja inducida por Triptolida de SENP1, AR o c-jun. Con el fin de revelar el efecto de triptolida en la SENP1, Ar o c-Jun células silenciadas, hemos introducido el valor de 'la relación de viabilidad ", que se obtiene dividiendo el número de células viables del grupo tratado con triptólido por la del control triptolida grupo sin tratamiento. Curiosamente, desmontables de SENP1, c-Jun o AR pareció aumentar células coeficiente de viabilidad en tratamiento triptólido (Fig. 7A, 7B), lo que sugiere una mayor resistencia triptólido. Se verificaron adicionalmente el efecto de SENP1, c-Jun o AR sobre-expresión en la eficacia anti-triptólido CaP. células de CaP se transfectaron o co-transfectadas con SENP1, c-Jun y plásmidos de expresión de AR (Fig. 7F). Una proteína irrelevante EGFP se utilizó como control negativo y una proteína de unión de triptólido XPB se utilizó como control positivo. 48 h después de la transfección, las células se trataron con triptólido para otro 48 h y se contó el número de células viables. La expresión ectópica de estas proteínas se evaluaron mediante transferencia Western (Fig. 7F). Como se muestra en la Fig. 7D-7E, la expresión ectópica de SENP1, c-Jun o AR aumentó significativamente CaP relación de células viabilidad bajo tratamiento Triptolida, lo que indica que el rescate de estos tres Triptolie abajo-regulación de la expresión de proteínas podrían inhibir la toxicidad celular Triptolida. Además, la co-expresión de estas proteínas confirió relación de células de viabilidad superior a respectivo expresión individual, lo que sugiere que todas estas proteínas están involucradas en triptólido citotoxicidad.