Extracto

macrófagos asociados a tumores se ha demostrado que promover el crecimiento del tumor. Pueden tener una función obligatoria en la angiogénesis, la invasión y la metástasis a través de la liberación de mediadores inflamatorios. Su presencia en el cáncer de ovario se ha correlacionado con mal pronóstico en estos pacientes. La proteína-18 humana catiónico antimicrobiano (hCAP18) /LL-37 se identificó originalmente como una molécula efectora del sistema inmune innato. Es liberado por las células inmunes innatas, como los macrófagos, a los microorganismos de combate. Estudios previos han caracterizado el hCAP18 /LL-37 como factor de crecimiento que se ha demostrado para promover la progresión del tumor de ovario. Sin embargo, el papel hCAP18 /LL-37 tiene en el desarrollo de tumores de ovario macrófagos promovido y cómo su expresión está controlada en este contexto sigue siendo poco conocida. A continuación, se demuestra en experimentos de co-cultivo de macrófagos y las células de cáncer de ovario un aumento significativo en el
in vitro
proliferación y la invasividad de las células tumorales se observa. Estas propiedades de crecimiento y la invasión mejoradas correlacionados con hCAP18 /LL-37 de inducción. HCAP18 /LL-37 expresión se vio disminuida por la adición de dos anticuerpos neutralizantes, TLR2 o TLR6, así como inhibidores de CYP27B1 o VDR. Por otra parte, ya sea el TLR2 o anticuerpo TLR6 reducen la señalización de la vitamina D3 y la progresión tumoral de células
in vitro
. La adición de inhibidores de CYP27B1 o VDR abrogada TLR2 /6 expresión inducida por activación de hCAP18 /LL-37 en los macrófagos. Desmontables de V1 versicano tumor de producción de RNAi en estas células tumorales llevado a una disminución de la inducción de hCAP18 /LL-37 en macrófagos. Versicano V1 caída también inhibe la señalización de TLR2 y vitamina D3, así como el crecimiento y la invasividad de estas células tumorales en el
in vitro
co-cultivo. En resumen, hemos encontrado que V1 versican mejora hCAP18 /LL-37 expresión en los macrófagos a través de la activación de TLR2 y posteriores mecanismos de vitamina D dependiente que promueven la progresión del tumor de ovario
in vitro
.

Visto : Li D, Wang X, Wu JL, Quan WQ, Ma L, Yang F, et al. Tumor de producción (2013) El VS V1 Mejora hCAP18 /LL-37 Expresión en macrófagos mediante la activación de TLR2 y vitamina D3 señalización para promover la progresión del cáncer de ovario
in vitro
. PLoS ONE 8 (2): e56616. doi: 10.1371 /journal.pone.0056616

Editor: Qiang Wang, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 3 Julio, 2012; Aceptado 15 de enero de 2013; Publicado: 12 de febrero 2013

Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China Subvenciones (81272603); Programa de Investigación de la Comisión de Ciencia y Tecnología de Putuo (PTKW09-B02). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

un microambiente tumoral juega un papel crítico en la iniciación del tumor y la promoción. Este microentorno único contiene células inmunes innatas, linfocitos y tejido conjuntivo, así como células malignas [1]. células inmunitarias innatas (también conocidas como células mieloides), incluyen macrófagos, liberación de citoquinas y quimioquinas, así como influencia tumorigénesis [1] - [3]. macrófagos asociados a tumores (TAM) son un componente importante de los infiltrados inflamatorios en los tumores. TAM se derivan de circulación de precursores de monocitos por quimioatrayentes, secretada por las células tumorales y del estroma [4], [5]. Los estudios clínicos siguen demostrando una correlación entre una alta población de TAM un mal pronóstico en el ovario, mama, próstata, pulmón y cánceres de cuello uterino [6] - [8]. Hay una creciente evidencia de que varios factores pro-inflamatorias producidas por los macrófagos, promueven el crecimiento tumoral, la angiogénesis, invasión y metástasis [1], [5], [9]. Sin embargo, el papel real de una serie de moléculas pro-inflamatorias clave tiene en la promoción de tumores y sus mecanismos de expresión y la función sigue siendo poco conocida.

El humano catiónico antimicrobiano proteína-18 (hCAP18) /LL-37 es el sólo se conoce péptido catelicidina en los seres humanos [10]. HCAP18 /LL-37 se produce constitutivamente en numerosos tipos de células incluyendo los macrófagos, neutrófilos, células epiteliales de la piel de la piel, el tracto gastrointestinal y el tracto urinario, por el epidídimo y por las células epiteliales de las vías respiratorias [11], [12]. El gen HCAP18 consiste en 3 dominios: la región N-terminal del péptido señal, el dominio de catalina-como altamente conservada y la región C-terminal denominado el péptido LL-37 [13]. El péptido LL-37 se mantiene en su forma pro-péptido hasta que la escisión por la proteasa 3 justo antes de la secreción [14], [15]. El péptido LL-37 cumple varias funciones en diferentes reacciones inmunes, incluyendo la modulación inmune, respuesta inflamatoria, la proliferación celular, la angiogénesis y la actividad antiapoptótica [16]. LL-37 se ha establecido como un contribuyente a la tumorigénesis y progresión tumoral [16], [17]. Los estudios han demostrado en cánceres de ovario LL-37 contribuye a la proliferación celular, la invasión y la progresión del cáncer a través de la estimulación directa de las células tumorales, la iniciación de la angiogénesis y el reclutamiento de células inmunes [14], [18], [19]. El tratamiento con un sintético, biológicamente activa péptido LL-37 o la expresión transgénica LL-37 aumenta significativamente la proliferación de células tumorales de pulmón. Esta investigación sugiere que LL-37 actúa como factor de crecimiento para el cáncer de pulmón humano [20]. Además, LL-37 también se considera para aumentar la proliferación y la metástasis en tumores de mama y melanomas malignos [21], [22]. Tomados en conjunto estos resultados apoyan la hipótesis de que LL-37 funciones de un factor de crecimiento en las células transformadas.

Una variedad de estímulos, incluyendo moléculas pro-inflamatorias, factores de crecimiento, nutrientes, productos bacterianos, y sobre todo la inflamación y el daño hasta expresión -regulate de hCAP18 /LL-37 [16]. En los seres humanos la 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25D3) regula al alza la expresión de hCAP18 /LL-37 a través del receptor de vitamina D (VDR) en monocitos, macrófagos, kerationocytes en la epidermis [23], [24]. La investigación anterior que se centró en intracelular
Mycobacterium tuberculosis
demostrado la activación de TLR2 en macrófagos humanos hasta reguladas expresión de genes VDR y CYP27B1. Esta cascada de acontecimientos que aumenta la producción de 1,25D3, que a su vez conduce a la inducción de hCAP18 /LL-37 [24]. Estudios recientes del microambiente tumoral han demostrado factores de carcinoma pulmonar de Lewis células (LLC) produjeron, como versicano, son necesarios para el crecimiento de tumores de pulmón y metástasis. Además, este proceso depende de la activación de células mieloides mediada por TLR2 [25], lo que resulta en la activación de NF-kappa B de factores inflamatorios TNFa, IL-6 de producción [26], [27].

El objetivo de este estudio es investigar los mecanismos de regulación de hCAP18 /LL-37 en el microambiente tumoral. Aquí se presenta la V1 versican derivado de las células tumorales aumenta hCAP18 /LL-37 expresión en los macrófagos a través de la activación de TLR2 y posteriores mecanismos de vitamina D-dependiente. Además, es esta cadena de eventos de señalización celular que promueve la proliferación de células tumorales de ovario y la invasión. Los resultados permiten proponer nuevo mecanismo para hCAP18 /regulación LL-37 en el microambiente tumoral. Además se proporciona una visión de los factores críticos implicados en la progresión del cáncer.

Materiales y Métodos

Líneas celulares y reactivos

Las líneas celulares de cáncer de ovario humano OV-90 y SKOV3 se obtuvieron células de la American Type Culture Collection, y otras líneas celulares de cáncer de ovario humano HO-8910, 3AO células fueron adquiridos de Shanghai Instituto de Biología celular de la Academia china de Ciencias. Estas células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (laboratorios Hyclone. Inc, Sur, Utah, EE.UU.) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.), 100 U /ml de penicilina y 100 U /ml de estreptomicina (Hyclone laboratorios. Inc). Los cultivos celulares se realizaron a 37 ° C en aire humidificado con 5% de CO
2. FCS fue reemplazado con un 10% de suero de complemento inactivado humana (SA) (obtenida del banco de sangre del Hospital Tongji de la Universidad de Tongji. Aprobación institucional de los comités de ética de investigación local (Revisión interna y las Juntas de Ética del Hospital de Tongji, Universidad de Tongji ) se obtuvo antes de la realización de este estudio) 24 horas antes de experimento. La neutralización de anticuerpos anti-hCAP18 /LL-37 (2 g /ml, Clon#mAb 3D11, HyCult biotecnológicos, Holanda), anti-TLR2 (10 g /ml, Clon#mAb 383 936, R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU. ), anti-TLR6 (10 g /ml, Clon#mAb C5C8, Invivogen, San Diego, CA, EE.UU.) y el itraconazol inhibidor CYP27B1 (10
-7 M, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) o antagonista de VDR ZK159222 (10
-7 M, un regalo de Schering AG, Berlín, Alemania) se añadieron como se indica a 2 horas antes de co-cultivo u otro estímulo. TLR2 /6 ligando Pam2CSK4 se obtuvo de Invivogen. 25D3 (la 25-hidroxivitamina D3, el precursor 1,25D3) se adquirió (Biomol, Plymouth Meeting, PA, EE.UU.) y se volvió a suspender en etanol a 10
-2 M en tubos de color ámbar y se almacena a -80 ° C en pequeña alícuotas.

Generación de macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica humana

se obtuvo la aprobación institucional de los comités de ética de investigación local (Revisión interna y las Juntas de ética del hospital de Tongji, Tongji University) antes de la la realización del estudio. macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica humana se generaron como se describe anteriormente [28]. Brevemente, se aislaron células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes de sangre sanos desde el banco de sangre del Hospital Tongji de la Universidad Tongji de capas leucocitarias por Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) centrifugación de densidad. PBMC se les permitió adherirse a frascos de cultivo durante 1 hora a 37 ° C en DMEM suplementado con suero humano al 1%, después de lo cual las células no adherentes se eliminaron por lavado vigoroso con PBS. Las células adherentes se cultivaron en 20 ml de DMEM (10% FCS) suplementado con 50 ng /ml factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.) durante 7 días para permitir la diferenciación de los macrófagos.

cocultivo de células de cáncer de ovario y macrófagos

Para los estudios de cocultivo con las células cancerosas y los macrófagos, las células cancerosas fueron sembradas en la parte inferior de las placas y los macrófagos de múltiples pocillos de cultivo de células se colocaron en insertos Transwell (0,4 M, Corning Incorporated, Corning, NY, EE.UU.) con una membrana permeable para los líquidos, pero no para las células. Las células se incubaron durante la noche en DMEM suplementado con suero humano al 10%. Los cultivos polarizados se insertaron en el pozo de la placa de cultivo de múltiples pocillos y se cultivaron durante el tiempo indicado.

El número de células recuento

macrófagos derivados de monocitos (1 x 10
4 células) y el cáncer células (1 × 10
4 células) se sembraron en placas de 24 pocillos trans pocillos o de cultivo de células y se incubaron durante la noche. Las células se cocultivaron durante 4 días y luego Transwell inserciones (contener macrófagos) se eliminan, las células cancerosas se recogieron por tripsinización y se contaron con un hemocitómetro (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.).

BrdU ELISA ensayo de proliferación celular

proliferación de células cancerosas de ovario se determinó mediante el uso de la proliferación de células disponible en el mercado ELISA, BrdU (colorimétrico) Kit (Roche, Mannheim, Alemania). Después de 4 días de co-cultivo con macrófagos, Transwell inserciones (contienen macrófagos) fueron eliminados, y los sobrenadantes de las células tumorales se aspiraron y se añadieron 400 l /pocillo medio de cultivo conteniendo 10 mM BrdU. Las células se incubaron durante 2 h adicionales a 37 ° C. Etiquetado medio se eliminó tocando y las células se fijaron mediante la adición de 200 FixDenat l. solución FixDenat se eliminó completamente golpeando. Se añadió solución de trabajo /pocillo anti-BrdU-POD 400 l y se incubaron las células durante 90 min a TA. El conjugado de anticuerpo se eliminó con un movimiento rápido y de pocillos se lavaron 3 veces con PBS. Después de eso, se añadieron 400 l /pocillo de una solución de sustrato y la solución se incubó a temperatura ambiente durante 5 a 30 min. 200 l 3N H
2SO se añadió
4 a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 min en el agitador. La absorbancia se midió utilizando un lector de ELISA a 450 nm.

ensayo de invasión

ensayo de invasión se realizó con un Matrigel Cámara BD BioCoat Invasion (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.) con un 8 micras tamaño de poro de membrana de PET, uniformemente recubierto con Matrigel BD Matrix como se describe [18], [29]. Se añadieron células cancerosas privadas de suero a la cámara superior a una densidad de 1 × 10
4 células por pocillo. 1 × 10
4 macrófagos se colocaron en la cámara inferior. Cámara se llenó con DMEM más 10% del SA. A la hora indicada, las células adherentes en la parte inferior de la membrana se retiraron y se sedimentaron por centrifugación. El sedimento celular se resuelve en 100 l de PBS y se centrifugó en las diapositivas. Después de secar al aire, los cytospins se tiñeron con 5 l DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Las células migradas por campo de gran se determinaron por microscopía de fluorescencia.

SKOV3 o macrófagos medio condicionado

El medio condicionado se recogió de las células SKOV3 o macrófagos humanos derivados de monocitos de sangre periférica incubadas en DMEM libre de suero durante 24 h, y se filtró a través de un filtro de 0,2 micras. muestras SKOV3 medio acondicionado (SKOV3-CM) se añadieron a los macrófagos primarios humanos durante 24 h, después de lo cual se ensayaron diversos genes de expresión. Macrófagos medio acondicionado (M-CM) se añadieron a líneas celulares de cáncer de ovario humano durante 24 h, y los sobrenadantes celulares se midieron por ELISA para V1 versican.

transducción de la célula

Entrar células SKOV3 de crecimiento eran se lavó 1 vez con PBS y se resuspendieron a 2 x 10
7 células /ml en 1 ml de reactivo de tampón de electroporación gene Pulser (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), se mezclan con 20 g de plásmidos V1 RNAi de VS o simulacro plásmidos RNAi (ambos de OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD, EE.UU.). Electroporaciones se realizaron con un gen generador de impulsos (Bio-Rad) a 280 V y 960 mF en 0,4 cm cubeta (Bio-Rad). Las muestras se transfirieron a matraces de cultivo que contienen DMEM completo with10 medio% de FCS en 25 cm
2 y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2. 48 horas más tarde, el medio de crecimiento se cambió y se añadió puromicina (Invitrogen) a una concentración de 5 mg /ml. El medio de cultivo se cambió cada 4 días usando medio de crecimiento fresco (que contiene 5 mg /ml de puromicina). Después de 4 semanas, se identificaron las poblaciones policlonales positivos (agrupaciones) en base a análisis de Western blot para la expresión V1 versicano. clones positivos individuales fueron finalmente aislaron por análisis de dilución limitante en placas de 96 pocillos.

se realizó Western blotting

análisis de transferencia Western como se describió anteriormente [30]. En resumen, 30 g de proteína total extractos fueron cargados en un 10% en geles de SDS-poliacrilamida, sometidos a electroforesis y se transfirieron a Hybond-C membranas extra (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, Reino Unido). Los sobrenadantes de células se concentran primero a 1/10 de su volumen original mediante centrifugación al vacío y después se sometieron a geles de gradiente NU /PAGE al 4-12% (Invitrogen). Los anticuerpos primarios fueron: conejo anti-V1 versicano (1:1000; Abcam, Cambridge, Reino Unido) y de conejo anti-hCAP18 /LL-37 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-ratón β-actina (1:10000; Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania). HRP-conjugado de cabra anti-conejo (1:5000; Santa Cruz Biotechnology) o conejo anti-ratón (1:1000; Dako, Glostrup, Dinamarca) se utilizaron como anticuerpo secundario

aislamiento de ARN y en tiempo real. PCR

celulares ARN totales se prepararon con RNeasy mini kit plus (Qiagen, Santa Clarita, CA, EE.UU.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. tiempo real mezclas de reacción PCR se han descrito anteriormente [28]. Brevemente, el ADNc fue sintetizado por reacción de transcripción inversa utilizando el kit de síntesis de primera cadena de ADNc (Invitrogen). PCR en tiempo real se realizó utilizando el QPCR SYBR Green Mix (Bio-Rad) en una máquina en tiempo real sistema de PCR AB 7300 (Applied Biosystems AB, Singapur). Se utilizaron los siguientes cebadores de PCR: β-actina, 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 'y 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3'; hCAP18 /LL-37, 5'-TGGGCCTGGTGATGCCT-3 'y 5'-CGATGTTCCTTCGACAGGAAGC-3'; VDR, 5'-AAGGACAACCGACGC CACT-3 'y 5'-ACACACCTGTAGCCGTACTA-3'; CYP27B1, 5'-ACCCGACAC GGAGACCTTC-3 'y 5'-CACAGGTGCGACAACTGGTA-3'; Cpy24, 5'-CGCAG CGGCTGGAGAT-3 'y 5'-ATGGCGTTTCTTCCGATGCC-3'; TLR1, 5'-AACCC ATTCCGCAGTACTCCA-3 'y 5'-AAGGCCACGTTTGCTCTTTTC-3'; TLR2, 5'-CAATGATGCTGCCATTCTCAT-3 'y 5'-ATTATCTTCCGCAGCTTGC A-3'; TLR3, 5'-ACAACTTTAGCACGGCTCTGGA-3 'y 5'-ACCTCAACTGGGATC TCGTCA-3'; TLR4, 5'-AGTTTCCTGCAATGGATCAAGG-3 'y 5'-CTGCTT ATCTGAAGGTGTTGCAC-3'; TLR6, CCCATTCCACAGAACAGCAT-3 'y 5'-A TAAGTCCGCTGCGTCATGA-3'; CD14, 5'-TGTGAGCTGGACGATGAAGAT-3 'y 5'-CAGACACACACTGGAAGGCTT-3'. La especificidad de RT-PCR se controla mediante controles sin transcripción inversa 'y análisis de la curva de fusión. Cuantitativos resultados de la PCR se obtuvieron usando el método ΔΔCT (umbral de ciclo). Los datos se normalizaron a los niveles de ß-actina en cada muestra.

ensayo ELISA para versicano

Las muestras de sobrenadantes de cultivo de células se analizaron por ELISA ciencias de la vida (USCN versicano humana, INC. Houston, TX, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El límite de detección del ensayo fue de 0,107 ng /ml.

El análisis estadístico

Los valores se muestran como media ± SEM. Las comparaciones entre grupos se analizaron mediante la prueba de t (a dos caras). Los resultados se consideraron estadísticamente significativos los valores de p inferior a 0,05.

Resultados

La expresión de hCAP18 /LL-37 en macrófagos promueven la proliferación y la invasividad de las células de cáncer de ovario

TAM sustituido con macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica para
in vitro
experimento de co-cultivo in habían sido reportados por varios grupos. Estos informes muestran que los macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica tienen una función equivalente a TAM [27], [31]. Para determinar el efecto de los macrófagos en ovario proliferación células cancerosas, transwell insertos se utilizan como modelo de co-cultivo. macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica humana se colocaron en insertos Transwell y varias líneas celulares de cáncer de ovario se sembraron en la parte inferior de las placas de 24 pocillos. células de co-cultivo se hicieron crecer durante 4 días de co-cultivo en DMEM que contenía 10% del SA o de tratamiento con EGF, como control positivo. El crecimiento de HO-8910, OV-90, se incrementaron significativamente las células SKOV3, y 3AO cuando se co-cultivaron con macrófagos humanos derivados de monocitos de sangre periférica (Fig. 1A). Para evitar hCAP18 /LL-37 células de monocitos de función se trataron previamente con un anticuerpo neutralizante hCAP18 /LL-37 antes de co-cultivo con células de cáncer de ovario. En los experimentos en los monocitos se trataron previamente con el anticuerpo neutralizante hCAP18 /LL-37 una inhibición significativa de HO-8910 de co-cultivo, OV-90, se observó SKOV3, y 3AO células de crecimiento (Fig. 1A). No inhibición del crecimiento celular se observó en los experimentos de anticuerpo co-cultivo de control de IgG1 (Fig. 1A). Para evaluar el crecimiento de ovario células cancerosas inducida por macrófagos de la incorporación de BrdU en las hebras de ADN recién sintetizadas medidos utilizando anticuerpos anti-BrdU en un ensayo ELISA. Consistente el aumento observado en la proliferación celular, la síntesis de ADN en HO-8910, OV-90, las células SKOV3, y 3AO se aumentó notablemente cuando las células fueron co-cultivadas con los macrófagos (Fig. 1B). Como se esperaba, la adición del anticuerpo neutralizante hCAP18 /LL-37 reduce el efecto de los macrófagos en la proliferación de células de cáncer de ovario (Fig. 1B). A continuación, se investigó de ovario células de cáncer de invasión. la capacidad de estas células para invadir insertos recubiertos con Matrigel también fue significativamente mayor de macrófagos (Fig. 1C, D). Después de los medios de co-cultivo se trató con el anticuerpo neutralizante hCAP /LL-37, que invasión de células tumorales significativamente atenuada (Fig. 1C, D). Estos resultados sugieren un papel directo para hCAP /LL-37 en la promoción de la invasión de células tumorales. Un anticuerpo de control IgG no interfirió con la invasión de células de cáncer de ovario (Fig. 1C, D). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que se requiere hCAP18 /LL-37 para la proliferación inducida por macrófagos y la invasión en las células de cáncer de ovario.

Para los experimentos de co-cultivo de células de cáncer de ovario con macrófagos, derivados de monocitos de sangre periférica humana macrófagos (1 × 10
4 células) se colocaron en insertos Transwell y células de cáncer de ovario (1 × 10
4 células) se sembraron en la parte inferior de las placas de 24 pocillos. Las células se preincubaron con 2 g /ml anti-hCAP18 /LL-37 o un control de isotipo IgG1 Ab (2 mg /ml) durante 2 h. se co-cultivaron las células en DMEM (10% HS) durante 4 días. 100 ng /ml EGF (Sigma, Steinheim, Alemania) se utilizó como control. (A) La proliferación de células de cáncer de ovario se midió por recuento del número de células. proliferación (B) de la célula se midió por ELISA (etiquetado BrdU) análisis. ensayo (C) Invasión. ensayos de invasión se llevó a cabo utilizando un BioCoat Matrigel Invasión Cámara BD con una membrana de tamaño de poro PET 8 micras, uniformemente recubierto con BD Matrigel matriz. Los resultados son medias ± SEM, diferencia significativa, n = 3, * p & lt; 0,05. ensayo de invasión (D) de Matrigel SKOV3. DAPI tinción de las células tumorales migrados. secciones representativos se muestran (a) SKOV3 ningún tratamiento. (B) los macrófagos SKOV3 +. (C) SKOV3 + macrófagos + neutralizantes anti-hCAP18 /LL-37 (2 g /ml). (D) SKOV3 + macrófagos + control de isotipo IgG1 Ab (2 mg /ml). (E) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).

Las células tumorales desencadenan la activación de la vitamina D3 y la señalización de TLR2 y hasta la regulación de hCAP18 /LL-37 en macrófagos

Para investigar el patrón de expresión de hCAP18 /LL-37, los macrófagos humanos fueron co-cultivadas con células SKOV3. La inducción de hCAP18 /LL-37 mRNA (Fig. 2A) y proteína (de larga duración hCAP18 /LL-37 y se escindió LL-37, Fig. 2B) aumentó los niveles en los macrófagos. Por el contrario, no hubo diferencias significativas en hCAP18 LL-37 mRNA /o los niveles de pro-péptidos observados en las células SKOV3 (Fig. 2A, B). No, maduro LL-37 no se detectó en las células SKOV3 (Fig. 2B). Estos resultados indican que los macrófagos y no las células SKOV3 contribuyen a la liberación del péptido LL-37. Para evaluar el nivel de hCAP18 /LL-37 y se escindió LL-37 en el medio de células, se realizó el Western Blot en sobrenadantes de células después de 24 h de co-cultivo. Un aumento significativo en los niveles de precursor y péptido escindido se observaron en comparación con los macrófagos o células SKOV3 (Fig. 2C).

macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica humana y células SKOV3 se coincubaron como se describe en la Figura 1 . total de ARN y las proteínas de las células SKOV3 y macrófagos se aislaron 24 h después de co-cultivo. (A) La expresión de hCAP18 /LL-37 mRNA se midió por PCR en tiempo real. (B) La expresión de la proteína hCAP18 /LL-37 se analizó por transferencia de western. β-actina sirvió como control de carga. (C) de transferencia Western de sobrenadantes de células de las células SKOV3, macrófagos y co-cultivo a 24 h. (D, E) La inducción de la VDR, CYP24, CYP27B1, TLRs y ARNm de CD14 en macrófagos se midió por PCR en tiempo real. Los resultados son veces el cambio promedio ± SEM, diferencia significativa, n = 3, * p & lt; 0,05; ns: no significativo.

Dada la VDR ha informado de mediar la expresión de /[23], [24] investigamos si se induce la expresión de genes relacionados con la VDR y hCAP18 LL-37 durante co-cultivo. De hecho, se observó un aumento en los niveles de ARNm de VDR cuando los macrófagos fueron co-cultivadas con células SKOV3 (Fig. 2D). Por otra parte, el 1,25 D3 enzima catabólica CYP24 (también conocido como CYP24A1) fue inducida en macrófagos cuando se co-cultivaron con células tumorales. CYP27B1, que cataliza la conversión de la hormona inactiva provitamina D3 (25D3) en la forma bioactiva (1,25D3) [24], los niveles de mRNA fueron también hasta reguladas en el modelo de co-cultivo (Fig. 2D). Se ha informado de que la activación de TLR2 conduce a la inducción de vitamina D dependiente de hCAP18 /LL-37 en macrófagos [32]. TLR2, 6 y CD14 mRNA niveles todos mostraron el aumento esperado en los macrófagos co-cultivadas. Los niveles de expresión de TLR1, TLR3, TLR4 y no se modificaron en estas células macrófagos (Fig. 2E).

cáncer de la inducción mediada por células de ovario de hCAP18 /LL-37, VDR, CYP24, y CYP27B1 en los macrófagos es dependiente de TLR2 y TLR6

a continuación trató de determinar si la inducción de hCAP18 /LL-37 era dependiente de la inducción de TLR2. Los macrófagos humanos derivados de monocitos de sangre periférica se incubaron durante 2 h con un anticuerpo TLR2 neutralizante o un anticuerpo de control de isotipo IgG1, a continuación, se estimularon durante 24 h en células SKOV3 medio acondicionado (SKOV3-CM) con 10% del SA. En las células de macrófagos tratados con el anticuerpo neutralizante TLR2 se observó una reducción significativa en hCAP18 /LL-37 de inducción, no se observó efecto significativo en la inducción de genes en las muestras tratadas anticuerpo de control (Fig. 3A). Para determinar si la inducción de VDR, CYP24, y CYP27B1 también fue influenciado por la exposición al anticuerpo neutralizante TLR2, se midieron los niveles de ARNm. Las muestras expuestas al anticuerpo sameTLR2 no demostraron la inducción de VDR, CYP24, o CYP27B1, de nuevo afecta no se observaron inhibidor en las muestras de control de anticuerpo de IgG (Fig. 3B-D). Estos experimentos se repitieron utilizando un anticuerpo TLR6 neutralización, se observó el mismo patrón de inhibición, con la inducción de hCAP18 /LL-37, VDR, CYP24, y CYP27B1 siendo bloqueado en las muestras de anticuerpo TLR6, pero no el grupo de control (Fig. 3A -RE). La combinación de TLR2 y TLR6 anticuerpos neutralizantes ofrecen la posibilidad de un efecto sinérgico inactivación de estos genes (Fig. 3A-D). Estos datos indican mediada por la inducción de tumores de hCAP18 /LL-37 requiere la actividad TLR2 /6 en macrófagos. Se cree que este mecanismo de inducción de estar involucrados en la señalización de la vitamina D3. En apoyo adicional de nuestro modelo, la adición de anticuerpos neutralizantes contra TLR2 o TLR6 suprimió significativamente la proliferación de células SKOV3 y de invasión (Fig. 4A, B). La combinación de TLR2 y TLR6 anticuerpos neutralizantes como resultado un efecto sinérgico sobre la inhibición de la progresión de células SKOV3 (4A. Fig, B). Estos resultados indican que se requiere la activación de TLR2 o TLR6 para la progresión de células tumorales.

macrófagos humanos se preincubaron con 10 mg /ml anti-TLR2, 10 mg /ml anti-TLR6 o un anticuerpo de control de isotipo IgG1 (10 g /ml) durante 2 h. A continuación, los macrófagos fueron cultivo con DMEM (10% HS) o SKOV3-CM (10% HS) durante 24 h, y el ARN totales se extrajeron para el ensayo de PCR en tiempo real. (A) hCAP18 /LL-37 ARNm. (B) ARNm VDR. (C) mRNA CYP24. (D) mRNA CYP27B1. La media veces el cambio ± SEM, n = 3, * p & lt;.
0,05
macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica humana y células SKOV3 se preincubaron con 10 mg /ml de anti-TLR2, 10 mg /ml de anti -TLR6 o un control de isotipo IgG1 Ab (10 mg /ml) durante 2 h. se co-cultivaron las células en DMEM (10% HS) durante 4 días. 100 ng /ml de EGF se utilizó como control. Se midieron (A) El número de células, la proliferación e invasión de células SKOV3. La media veces el cambio ± SEM, n = 3, * p & lt; 0,05. ensayo de invasión (B) de Matrigel SKOV3. DAPI tinción de las células tumorales migrados. secciones representativos se muestran como se indica. (A) SKOV3 ningún tratamiento. (B) los macrófagos SKOV3 +. (C) SKOV3 + macrófagos + neutralizantes anti-TLR2. (D) SKOV3 + macrófagos + neutralizantes anti-TLR6. (E) SKOV3 + macrófagos + neutralizantes anti-TLR2 y anti-TLR6. (F) SKOV3 + macrófagos + IgG1 de control de isotipo Ab. (G) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).

mediada por la expresión de TLR2 /6 de hCAP18 /LL-37 a través de la activación CYP27B1 y VDR

La bioconversión depende CYP27B1 de 25D3 a 1,25D3 es una característica clave de la vitamina hCAP18 /LL-37 D mediado por la expresión [33]. Para determinar si la activación inducida por tumor de TLR2 /6 bioactividad mejorada de CYP27B1, lo que conduce a hCAP18 /LL-37 expresión, los macrófagos fueron expuestos a la TLR2-TLR6 ligando Pam2CSK4, en presencia y en ausencia de medios de comunicación 25D3 (DMEM sin suero ). Expresión de hCAP18 /LL-37 no fue influenciado cuando se expone a 25D3 o Pam2CSK4 independientes entre sí. Sin embargo, se indujo hCAP18 /LL-37expression después de la exposición simultánea (Fig. 5A). Por otra parte, la inhibición de CYP27B1 por itraconazol bloqueado TLR2 /6 de activación y un posterior aumento de los niveles de inhCAP18 /LL-37 mRNA (Fig. 5A). Además de la VDR antagonista ZK159222 también inhibió la inducción de hCAP18 /expresión LL-37 según lo determinado por los niveles de mRNA (Fig. 5A). A continuación, co-cultivadas macrófagos primarios y SKOV3-CM (sin suero) en presencia de una gama de concentración de 25D3, y niveles de hCAP18 /LL-37 mRNA se midieron por qPCR. En otro experimento de macrófagos /SKOV3-CM co-cultivo de la adición de 25D3 aumentó significativamente los niveles de hCAP18 /LL-37 ARNm de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5B). Es de destacar que SKOV3-CM sin SA no indujo la expresión de hCAP18 /LL-37 (Fig. 5B) a causa de insuficiencia de vitamina D en medios de cultivo [24], [33]. Por tanto, estos resultados sugieren que la activación inducida por tumor de TLR2 /6 en los macrófagos humanos desencadena hCAP18 /LL-37 expresión. Por otra parte los datos apoyan esto regulación depende de la CYP27B1 y VDR mediada por la producción endógena de 1,25D3
.
(A) Los macrófagos humanos fueron pretratadas con el antagonista de VDR ZK159222 (10
-7 M) o el itraconazol antagonista CYP27B1 (10
-7 M) durante 2 h y después se estimularon con TLR2 /6 ligando Pam2CSK4 (100 ng /ml) en presencia o ausencia de 25D3 (10
-6 M) (DMEM sin suero) durante 24 h. Se determinó la expresión de hCAP18 /LL-37 ARNm como se describe en la Figura 3. (B) Regulación de hCAP18 gen /LL-37 en la estimulación con 25D3 en DMEM (sin suero) o SKOV3-CM (sin suero). La media veces el cambio ± SEM, n = 3, * p & lt;. 0,05

V1 versicano Tumor-secretada activa TLR2 y TLR6 para inducir hCAP18 /LL-37 expresión en macrófagos

indicado anteriormente, co-cultivo de macrófagos /células SKOV3 activan TLR2 /6 y por lo tanto aumentó hCAP18 /LL-37 expresión en macrófagos. Estos resultados sugieren factores solubles indeterminados producidos por las células SKOV3 median este proceso. Kim et al. demostró que V1 versicano, un activador de los macrófagos que actúa a través de TLR2 y TLR6 sus correceptores y CD14, está regulada hasta en muchos tumores humanos, incluyendo el cáncer de ovario y cáncer de pulmón, tumor de pulmón y aumenta el crecimiento metastásico [25]. Para determinar si V1 versican podría ser el factor soluble responsable de la TLR2 /6 activación observada aquí examinamos versicano niveles de expresión V1 en las células tumorales co-cultivadas con macrófagos. Figura 6A mostró expresión de la proteína V1 versican se incrementó en el total de los lisados ​​de células de SKOV3, HO-8910, OV-90, y las células 3AO cuando se co-cultivaron durante 24 h. Para investigar el nivel de secreción de V1 versican a partir de células tumorales de ovario se incubaron SKOV3, HO-8910, OV-90, y las células 3AO con medio condicionado de macrófagos (M-CM) durante 24 h. Se realizaron ensayos de ELISA para determinar la presencia de V1 versican secretada en medio de células.