Extracto
Antecedentes
células cancerosas humanas mantienen los telómeros a proteger las células de la senescencia a través actividad de la telomerasa (TA) o alargamiento alternativo de los telómeros (ALT) en diferentes tipos de células. Por otra parte, la senescencia celular se puede eludir epitelio-mesenquimal transición (EMT) durante la progresión del cáncer en diversos tumores sólidos. Sin embargo, no ha sido dilucidado las características de mantenimiento de los telómeros y la capacidad de progresión tras cultivo a largo plazo en las células de cáncer de vejiga T24 con la disfunción de hTERT.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio, realizado por utilizando una telomerasa humana mutante dominante negativo de la transcriptasa inversa (hTERT) vectores para inhibir la TA en las células T24 del cáncer de vejiga, se observó la aparición de larga fenotipo del complejo LMP cuerpo ALT-asociado (APB) longitud de los telómeros y después de la 27
º pasaje, lo que indica la ocurrencia de la vía ALT-como en las células supervivientes T24 /DN868A con la inhibición de la telomerasa. Mientras tanto, la inhibición de la telomerasa resultó en EMT significativa como se muestra por el cambio en la morfología celular concomitante con la variación de los marcadores de EMT. Consistentemente, las células T24 /DN868A supervivientes mostraron una mayor capacidad de progresión
in vitro
y
in vivo
. Además, encontramos la torcedura se activó para mediar EMT en sobrevivir muestras T24 /DN868A.
Conclusiones /Importancia
En conjunto, nuestros resultados indican que las células de cáncer de vejiga T24 pueden someterse a la telomerasa-a -alt similar a la conversión y promover la progresión del cáncer en etapas avanzadas a través de la promoción de la EMT, proporcionando así nuevas luces sea posible en el mecanismo de resistencia a los inhibidores de la telomerasa en el tratamiento del cáncer
Visto:. Xue y, Li L, Zhang D, Wu K, Chen Y, Zeng J, et al. (2011) Twisted epitelial-mesenquimal-Transición promueve la progresión de las células supervivientes del cáncer de vejiga T24 con hTERT-disfunción. PLoS ONE 6 (11): e27748. doi: 10.1371 /journal.pone.0027748
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de julio de 2011; Aceptado: 24 Octubre 2011; Publicado: 15 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Xue et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (. SNCF NO 30772163). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la estabilización de los telómeros es crítica para la proliferación celular infinito que es necesaria para la formación de tumores [1]. Se han identificado al menos dos mecanismos para mantener la homeostasis de los telómeros en las células
in vivo
así como
in vitro
. En primer lugar, la mayoría de las células de carcinoma utilizan telomerasa, una enzima de ribonucleoproteína celular multi-subunidad (referido como una vía de la telomerasa), añadir repeticiones teloméricas en los extremos de los cromosomas [2]. La telomerasa se compone de una subunidad de ARN, la proteína asociada con la telomerasa 1, y la telomerasa catalizador transcriptasa inversa (hTERT), que es un componente limitante en la regulación de la actividad de la telomerasa [3]. En segundo lugar, las células del sarcoma utilizan un mecanismo denominado alargamiento alternativa telomerasa-independiente de los telómeros (es decir, vía ALT) para mantener termini cromosoma [4]. El inicio de la ALT se determina por la aparición de, la longitud del telómero heterogénea de largo, y la aparición de cuerpos de leucemia promielocítica ALT-asociado (APB) en aproximadamente el 10% de los núcleos en interfase [5].
Informes anteriores han indicado que la telomerasa y el mecanismo de ALT podían coexistir en algunos tumores [4], [6]. Además, una conversión reversible de la telomerasa-positivas a telomerasa-negativos células se ha informado en casos de papiloma humano tipo 16 fibroblastos inmortalizados-E6 [7]. En vista de la importancia de la telomerasa en la inmortalización celular y la falta de expresión de la telomerasa en la mayoría de las células somáticas normales, inhibidores de la telomerasa a cabo una promesa considerable para el tratamiento del cáncer en el pasado [8]. Pero la posibilidad de la activación de ALT que es resistente a inhibidores de la telomerasa complica esta situación [9]. Es bien sabido que ALT confiere propiedades diferentes de la telomerasa en la malignidad del cáncer. En el caso de glioblastoma multiforme, ALT correlaciona con un mejor pronóstico de los pacientes [10], mientras que un mal pronóstico se detectó en los pacientes con liposarcoma [11]. La razón de la diferencia de malignidad del cáncer sigue siendo difícil de alcanzar.
Además de mantenimiento de los telómeros, la adquisición de un fenotipo maligno completo también incluye el requisito de la metástasis. Epitelial-a-mesenquimal transición (EMT) juega un papel importante en la progresión de tumores primarios hacia a metástasis [12]. Observaciones recientes sugieren que EMT y la senescencia celular se cruzan en la progresión del cáncer [13]. Varios factores de transcripción distintos, que se han encontrado para ser capaz de programas EMT que inducen, como Twist and ZEB1, también puede proteger las células de la senescencia inducida por los
ras
oncogén [14], [15].
en este trabajo, hemos utilizado un mutante dominante negativo de hTERT para inactivar constitutivamente actividad de la telomerasa (TA) en las células T24 del cáncer de vejiga. Nuestros datos muestran que la longitud de los telómeros largos y complejos APB sin la sobre regulación de la asistencia técnica pueden ocurrir durante el cultivo a largo plazo en las células del cáncer de vejiga
in vitro
. Sorprendentemente, se observó un cruce entre la vía EMT y mantenimiento de los telómeros de forma concomitante con el aumento de la capacidad de progresión. Por otra parte, la torcedura se activó para inducir la EMT. En resumen, se describe un nuevo mecanismo en la adquisición de características invasivas y la homeostasis del telómero después de la inhibición de la telomerasa en las células T24 del cáncer de vejiga, proporcionando así una idea de resistencia a los medicamentos después de la inhibición de la telomerasa en el cáncer de vejiga.
Métodos
Ética Declaración
Todos los experimentos con los animales cumplen la
Directrices de Cuidado de animales de la Universidad de
Xi'an Jiaotong y aprobado por el comité Ético Review Board (ERB) (el primer hospital Afiliado del Colegio de Medicina, Universidad de Xi'an Jiaotong, china), y el ID de la aprobación de la junta ética es SCXK2007-0005.
los anticuerpos
los anticuerpos contra PML, TRF2, N-cad, vimentina , citoqueratina-18, 19 (CK-18, CK-19), metaloproteinasas de matriz-2 (MMP-2) y la torcedura eran de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).
cultivo celular
La línea humana cáncer de vejiga de células T24 y la línea celular de osteosarcoma U
2OS se cultivaron en Dulbecco modificada de Eagle (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS , Sijiqing, Hangzhou, china) a 37 ° C con 5% de CO
2 en un incubador humidificado.
Establecimiento de hTERT
células DN868A estable y transfección transitoria de la torcedura
La dominante constructo mutante negativo de hTERT (PCI-neo-hTERT
DN868A) se verificó mediante secuenciación antes de transfección en células T24 cultivadas. siRNA para twist fueron diseñados y sintetizados por Invitrogen (Shanghai, China). La secuencia de siTwist era: 5'-sentido CACCGGACAAGCUGAGCAAGAUUCACGAAUGAAUCU UGCUCAGCUUGUCC-3 '; antisentido 5'-AAAAGGACAAGCUGAGCAAGAUUCA UUCGUGAAUCUUGCUCAGCUUGUCC-3 '. La transfección se llevó a cabo utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Inc., Gaithersburg, VA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los transfectantes estables se seleccionaron con 300 ug /ml G418 (Merck, Darmstadt, Alemania).
Ensayo de actividad de la telomerasa
Actividad de la telomerasa se midió utilizando un kit de ensayo TRAP-PCR-ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (Roche, Basilea, Suiza). Brevemente, 2 x 10
5 células se suspendieron con tampón de lisis, y se utilizó una cantidad igual de sobrenadante nuclear como una plantilla TRAP para la reacción PCR. La mezcla de reacción se incubó a 25 ° C durante 30 minutos y, a continuación PCR se amplificó durante 35 ciclos a 94 ° C durante 30 s segundos y 59 ° C durante 60 segundos. A continuación, el producto se mezcló con una solución de hibridación y se incubó a 37 ° C durante 1 hora, seguido de lavado y la incubación durante 30 minutos. A continuación, se chromogenized y se detectó la absorbancia.
análisis TRF
ADN se extrajo utilizando un kit de aislamiento de ADN (Roche, Basilea, Suiza) y las alícuotas (2 g) digerido 2 horas con el enzimas de restricción
Rsa I y
Hinf
I. Los fragmentos de ADN digeridos se separan en 0.8% geles de agarosa y se transfirieron a membranas de nylon cargadas positivamente. fragmentos de restricción de los telómeros se dieron a conocer a través de la hibridación con la sonda telomérica marcada con DIG y la detección de quimioluminiscencia.
se prepararon Q-FISH para el análisis citogenético
Los cromosomas de las células de detención colcemid y siguieron una técnica Q-FISH estándar [16] utilizando el FISH telómeros PNA /FITC kit (Dako Cytomation, EE.UU.). En resumen, las células desprendidas fueron tratados con 50 mmol /L de KCl y se fijaron con ácido acético 3:01 metanol /glacial; a continuación, se prepararon diapositivas. Telomere se detectó utilizando una sonda FITC-conjugado de ácido nucleico peptídico (PNA) y contratinción con DAPI. Las imágenes digitales fueron capturados bajo microscopía confocal en 60 × 120 × o objetivos.
inmunofluorescencia doble
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio y se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA). Después de lavar con PBS, las células se permeabilizaron usando una solución de 0,1% de Triton X-100 y se bloquearon con suero de burro 10%. Después de la incubación con los anticuerpos primarios PML y TRF2, se incubaron con los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555/568 (Invitrogen). Las imágenes se recogieron bajo microscopía confocal y procesadas usando Adobe Photoshop 7.0.
Western Blot
Western Blot se llevó a cabo como se describe anteriormente [17]. Brevemente, las muestras se analizaron mediante 12% de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y se sondearon con los anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rábano picante, entonces detectado por el sistema de detección quimioluminiscente ECL (Amersham, Piscataway, NJ).
la invasión y la migración de ensayo
la capacidad de invasión y migración de las células T24 se determinó mediante el ensayo Transwell. Para el ensayo de invasión, 50 l de Matrigel (Sigma, Inc.) se aplicó a 8 micras de tamaño de poro de filtros de membrana de policarbonato (Corning, Inc., Corning, NY), la cámara inferior del aparato que contiene DMEM con 20% de FBS . 5 × 10
3 T24, T24 /PCI, y el paso 32
nd de T24 /DN868A (definido como sobrevivir T24 /DN868A en el siguiente estudio) Se sembraron las células con un medio libre de suero, y luego se incubaron durante 48 horas a 37 ° C. Después de la incubación, las células invadidas unidos a la superficie inferior de la membrana se fijaron en 4% de paraformaldehído y se tiñeron con Giemsa. El número de células se contaron en tres campos microscópicos seleccionados al azar (10 x) por membrana. El ensayo de migración se llevó a cabo como se describe para el ensayo de invasión, sin la capa de Matrigel.
ensayo de adhesión
Matrigel fue diluida con DMEM libre de suero a las 1:20 y revestido sobre el fondo de placa de 96 pocillos. 1 × 10
4 células se cosecha y se sembraron en placa de 96 pocillos con medio libre de suero y se dejó que se unieran a Matrigel. Después de 6 h, el medio con las células no unidas se eliminó y se añadieron MTT. 4 horas de incubación más tarde, se añadió DMSO para solubilizar los cristales de formazán y la absorbancia (DO) a 590 nm se midió.
de colonias en agar suave Formación Ensayo
El ensayo de formación de colonias se realizó como se descrito anteriormente [18]. Brevemente, un total de 500 células se suspendieron en 2 ml de DMEM que contiene 0,3% de agar bajo punto de fusión y que recubre la capa 2 de base ml constaba de 2 × DMEM y% de agar 1,2 (01:01 mixto) en placas de seis pocillos. Después de la incubación a 37 ° C con 5% de CO
2 en un incubador humidificado durante 14 días, se contaron las colonias de más de 50 células.
tumorigenicidad Ensayo
In Vivo
de cuatro a seis semanas de edad ratones BALB /C atímicos desnudos (Shanghai Experimental Animal Center, de Shanghai, china) fueron utilizados para el ensayo de tumorigenicidad. Se recogieron las células, se lavaron, y se resuspendieron en DMEM libre de suero a una concentración de 1 × 10
7 células /ml, y 1 × 10
se inyectaron 6 células por vía subcutánea. Los ratones fueron sacrificados después de 8 semanas para medir el peso del tumor. La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo como se describe anteriormente [19].
Análisis estadístico
Todos los análisis de datos se realizaron con el software SPSS 13.0 para Windows.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado como el valor umbral de significación estadística
Resultados
Actividad de la telomerasa en células T24 clon que expresa dominante negativo (DN) hTERT
para inactivar constitutivamente hTERT, el cáncer de vejiga línea celular T24 humano con alta TA se transfectó con un plásmido que codifica DN-hTERT o PCI vector vacío, y clones de células individuales se aislaron mediante cribado G418 durante 7 semanas. análisis TRAP-PCR-ELISA demostró que en las células /DN868A T24 en la 3
paso rd, TA se redujo drásticamente en comparación con las células parentales (Fig. 1). Tres clones con disminución de la TA fueron seleccionados y designados como T24 /DN868A (M1~3). Las células de control transfectadas con vector vacío se designaron como T24 /PCI.
Actividad de la telomerasa (TA) en células T24 transfectadas con diversas construcciones se determinó como se describe en Materiales y Métodos (*
P Hotel & lt ; 0,05) guía empresas
telómeros de longitud en la dinámica clon de células que expresan T24 DN hTERT
para visualizar longitud de los telómeros de las células /T24 DN868A diferente al pasaje de antes a después, se siguió el análisis TRF. en estos tres clones aislados. Como se muestra en la Fig. 2A, la longitud de los telómeros media fue de ~4.3 kb a las 6
º paso de T24 /DN868A-M1 y acortamiento de los telómeros continua se observó hasta el 27
º paso. Este fenómeno fue acompañada de una reducción de la tasa de proliferación de 1 paso /2.5 por día a 1 paso /6 por día. Después de la 27
º paso, el alargamiento de los telómeros se apareció de nuevo. Una longitud media de ~ 6 kb con la aparición de una banda de alto peso molecular adicional en ~21 kb se muestra en 29
º paso. Además, la tasa de proliferación de células /DN868A T24 en esta etapa se aumentó a 1 paso /3 por día.
A. análisis TRF del clon de células T24 /DN868A con diferente paso. Se extrajo el ADN y se realiza utilizando electroforesis en gel como se describe en Materiales y Métodos. análisis de longitud de los telómeros B. por Q-FISH en metafase los cromosomas individuales a partir de subclones T24 parentales y transformadas de diferentes pasajes utilizando sondas de PNA marcado con FITC telómero (verde) y contrastados con DAPI (azul). La intensidad de las señales verdes corresponde a la longitud de los telómeros. a) U
células 2os; b) T24; c) T24 /PCI; d~f) subclones T24 /DN868A de 8
ª, 24
º y 27
º pasajes, respectivamente; G y H) subclones T24 /DN868A de la 29
º y 32
nd pasaje, respectivamente (120 ×). C. TA de las células en cada punto de tiempo en que se realizó el análisis de la longitud del telómero. Los histogramas son representativos de la TA en T24 /DN868A frente a la línea celular de sus padres.
Además, teñidas los cromosomas metafásicos de células /DN868A T24 con una sonda telomérica ANP, y los comparó con los padres o el control las células en el mismo pasaje. La línea celular de osteosarcoma U
2OS se utilizó como un control ALT-positivo (Fig. 2B a) [20]. Higo. 2B muestra el análisis de Q-FISH de uno de los clones. Las señales muy intensos verdes al final del cromosoma correspondían a los largos telómeros. Una señal de los telómeros FISH detectable podría ser visto en casi cada extremo del cromosoma y en la mayoría de los núcleos en un pasaje diferente de las células T24 parentales o células de control T24 /PCI; Además, la intensidad de estas señales en ambos dos células fue consistente (Fig. 2B b~c). Después de la inhibición de la telomerasa, aunque la intensidad de la señal de verde en cada extremo del cromosoma o en los núcleos fue consistente con el paso anterior de T24 /DN868A, las señales de los telómeros disminuyeron gradualmente con cada ronda de división celular hasta el 27
º paso , momento en el cual, la intensidad global de la señal fluorescente fue más bajo (Fig. 2B d~f). Después de este paso, las señales con diferente intensidad que representa la longitud del telómero heterogénea se observaron al final de algunos cromosomas en las células /DN868A T24 (Fig. 2B g~h). Para los otros dos clones T24 /DN868A ensayados que expresan DN hTERT, ambos mostraron inhibición de la telomerasa fuerte, pero sólo uno (T24 /DN868A-M3) muestran fluctuaciones longitud de los telómeros como Fig. 2 A y B, mientras que el otro (T24 /DN868A-M2) se fue a la muerte celular y la pérdida de la cultura en la 16
º paso.
Para analizar la naturaleza de los eventos de alargamiento de los telómeros, se examinaron TA en cada punto de tiempo cuando Q-FISH se realizó en estos dos clones de células viables. La inhibición de la TA por DN hTERT era robusto y consecutiva (hasta el 32
paso sin fecha), y se observó de forma consecutiva el mismo bajo nivel de TA en las células T24 /DN868A (Fig. 2C). Por tanto, es poco probable que la telomerasa restante es la causa para el alargamiento de los telómeros observado.
estado de APB en el clon de células que expresan T24 DN hTERT
complejo
APB es un subconjunto de la leucemia promielocítica cuerpos (LMP) que contiene el ADN telomérico y las proteínas de unión a los telómeros como TRF1 y TRF2. APB puede desempeñar un papel integral en el mecanismo de ALT, y no se encuentra en las células mortales o positivas de telomerasa [21]. Por lo tanto, hemos detectado la presencia de APB por la co-localización de la LMP con TRF2 en diversas células T24 en diferentes pasajes en comparación con la línea celular de osteosarcoma U
2OS. Como se muestra en la Fig. 3, la co-localización de la LMP con TRF2 no se pudo detectar en el T24 de los padres, las células T24 /PCI, o pasajes anteriores de células /DN868A T24. Sin embargo, en la 29
º paso de células /DN868A T24, los destellos de color amarillo que representan APB se observaron claramente en algunas células T24 /DN868A. Además, se observó un aumento en el número total de APB en el 32
paso nd de células /DN868A T24. Estos resultados indican fuertemente la presencia de un mecanismo de ALT-como de la estabilización de los telómeros en el subclón de células T24 /DN868A de la 29
º paso. Para distinguir a fines del paso de las células T24 /DN868A con características de ALT-como de pasaje anterior, todas las células T24 /DN868A después de la 29
º paso se denominan como células supervivientes T24 /DN868A. Uno de cada clon de células supervivientes en la 32
ª pasaje al azar se utilizó para el siguiente estudio.
El análisis de inmunofluorescencia doble para el APB en T24 hTERT inactivado en diferentes pasajes. manchas rojas representan la LMP, puntos verdes representan TRF2, y destellos de color amarillo indican la colocalizaiton de LMP con TRF2. APB estuvo ausente en la T24, T24 /PCI, y el paso anterior de células /T24 DN868A pero presente en las células /DN868A T24 en la 29
º y 32
nd pasaje (60 ×).
la inducción de la EMT en las células T24 con la inhibición de la telomerasa
T24 es una línea celular deficiente E-cadherina que aún exhibe una morfología de tipo epitelial [22]. Durante el cultivo a largo plazo, se encontró que las células T24 con la inhibición de la telomerasa exhibieron gradualmente una morfología más alargada en forma de huso y uniones intercelulares sueltas de la 25
º paso mientras que las células T24 o T24 /PCI estaban todavía poliédrica y crecieron en un contenedor bien de manera conectada, lo que sugiere que las células pueden haber sufrido EMT (Fig. 4A). Para probar esta caracterización, detallada molecular de marcadores de EMT de T24, T24 /PCI, y diferente paso de las células T24 /DN868A (incluyendo 25
ª, 27
º y 32
nd pasaje) fueron detectados por Western blot. De hecho, se observó la pérdida de marcadores epiteliales incluyendo CK18 y CK19 y aumento de los niveles de marcadores mesenquimales y proteínas relacionadas con la invasión, tales como N-cadherina, vimentina, y MMP-2 en las células /DN868A T24 de 25
º paso (Fig . 4B).
A. la morfología celular de T24, T24 /PCI y células /DN868A T24 se observaron bajo un microscopio de contraste de fase (20 ×). La morfología celular cambió de estructura poligonal, epitelial (superior) de tipo huso, la estructura mesenquimales (hacia abajo). B. Análisis de transferencia Western de N-cadherina, vimentina, MMP-2, los niveles de CK18, CK19 y en T24, T24 /PCI, y diferente paso de células /DN868A T24. GAPDH se utilizó como control de carga.
Disminución de la adherencia, aumento de la migración, la invasión y la formación de colonias de células supervivientes T24 /DN868A
in vitro
Para investigar la posible participación de mantenimiento de los telómeros y la EMT en el desarrollo de tumores, que utiliza células supervivientes T24 /DN868A como un modelo para examinar sus comportamientos celulares después de esta conversión. los resultados del ensayo Transwell mostraron que tanto la migración y el potencial invasivo de las células supervivientes T24 /DN868A significativamente se incrementaron en comparación con las células parentales o de control (Fig. 5A).
A. Se realizó ensayo Transwell para la invasión de células y el potencial de migración. Se determinó la adhesión de ensayo B. para la capacidad adhesiva. Se realizó ensayo de formación de colonias de C. Soft agar. (*
P Hotel & lt; 0,05, en comparación con las células de control).
En ensayo de adhesión, Matrigel se utilizó para recubrir la placa de 96 pocillos para imitar la matriz extracelular (ECM) . La D.O. valor en nombre de células adhesivas demostró que la capacidad adhesiva de sobrevivir de células T24 /DN868A a Matrigel se redujo notablemente (Fig. 5B).
exploró aún más el impacto de esta conversión en la clonogenicidad de las células T24. Como era de esperar, el ensayo de agar blando demostraron que las células supervivientes T24 /DN868A prominente forman más y más grandes colonias que el T24 y el control parental T24 /células PCI (Fig. 5C).
El aumento de la tumorigénesis de células supervivientes T24 /DN868A
in vivo
se ha demostrado previamente que la vía de ALT no sustituye la telomerasa en el proceso de tumorigénesis
in vivo
[23]; Por lo tanto, se estableció el xenoinjerto de tumor mediante inyección subcutánea de 1 x 10
6 T24, T24 /PCI, o células supervivientes T24 /DN868A en 6-8 semanas de edad ratones desnudos (n = 4 ratones por grupo). Las muestras tumorales fueron analizados por H & amp; E tinción. Los tumores desarrollados en todos los ratones desnudos 3-4 semanas después de la inyección. Los ratones inyectados con células supervivientes T24 /DN868A mostró una velocidad fuertemente acelerado en la formación de tumores (Fig. 6A) con un volumen medio más grande de 383,5 ± 51,08 mm
3 después de 8 semanas después de la inyección, mientras que el volumen medio del tumor en ratones inyectados con T24 o T24 células /PCI fueron 90,3 ± 12,89 y 82,6 ± 10,07 mm
3, respectivamente (Fig. 6B).
A. ensayo de crecimiento tumoral. Las células se inyectaron s.c. en el flanco de ratones desnudos y el volumen del tumor se midió semanalmente hasta 8 semanas después de la inyección (*
P Hotel & lt; 0,001, en comparación con las células T24 y T24 /PCI). B. tumores representativos aislados de T24, T24 /PCI, y sobrevivir T24 /ratones desnudos inyectados-DN868A. C. HE y tinción inmunohistoquímica de los marcadores de EMT en los tumores derivados de T24, T24 /PCI, y sobrevivir a las células T24 /DN868A, respectivamente (40 ×).
tinción histológica mostró que los tumores derivados de sobrevivir T24 /DN868A células eran similar a un cordón y más agresivo, mientras que los tumores derivados de las células T24 o T24 /PCI fueron detenidos y menos maligno (Fig. 6C). Para confirmar aún más que los que sobreviven las células T24 /DN868A sometieron a EMT
in vivo
, el examen inmunohistoquímico se realizó en muestras de tumores de ratones desnudos. Como resultado, el aumento de los niveles de N-cadherina y vimentina en el núcleo y el citoplasma, así como niveles reducidos de CK18 y CK19 se observaron entre las interfaces de células en los tejidos derivados de células supervivientes T24 /DN868A (Fig. 6C).
torcedura se activó para mediar la EMT en las células supervivientes T24 /DN868A
a continuación nos preguntamos el mecanismo molecular por el que la conversión T24 /DN868A podría modular la EMT. Examinamos muchos factores de transcripción tales como Slug, Twist, Caracol, Smad4 y ZEB1 por RT-PCR. El primer secuencias de RT-PCR se muestran en la Tabla S1. Como resultado, sólo Slug y la torcedura se han mejorado en las células supervivientes T24 /DN868A, mientras que los otros factores de transcripción, obviamente, no mostraron cambios (Fig. S1). Desde la torcedura consiste en la promoción de la EMT [24], y es capaz de superar la senescencia inducida por oncogenes en una variedad de células humanas [25], nos centramos en su alteración en las células supervivientes T24 /DN868A. Como resultado, la torcedura se upregulated dramáticamente en estas células a los dos niveles de ARNm y de proteína (Fig. 7A y la Fig. S2). Además, la tinción inmunohistoquímica de muestras de tejidos exhibió un alto porcentaje de tinción de la torcedura en células supervivientes T24 /DN868A. Además de los puntos de color marrón que representan giro en el núcleo de la mayoría de las células, un número de células también mostró tanto citoplásmica y nuclear tinción (Fig. 7B). Para investigar más a fondo el significado de la torcedura en este proceso de EMT, derribaron la torcedura con siRNA. En particular, la regulación negativa de Twist llevó a la capacidad disminuida de la migración y la invasión de las células supervivientes T24 /DN868A (Fig. 7C y 7D). Mientras tanto, estas variaciones fueron concomitante con la elevación de CK18, CK19, y la supresión de la N-cadherina, vimentina, y MMP-2 en las células supervivientes T24 /DN868A (Fig. 7E).
A. RT-PCR y Western blot de la expresión de la torcedura en T24, T24 /PCI, y que sobreviven células /DN868A T24. B. Detección de la expresión de la torcedura por tinción inmunohistoquímica en muestras de tumores ratones desnudos. Sobrevivir a las células T24 /DN868A C y D. fueron tratados con siRNA para torcer, y se analizó la capacidad de invasión y la migración. El análisis de transferencia Western de proteínas de E. asociados-EMT.
Discusión
Durante la progresión maligna de las células cancerosas, el mantenimiento de la longitud de los telómeros es un prerrequisito crucial para su inmortalización [26], que se consigue por la actividad de la telomerasa (TA) o alargamiento alternativo de los telómeros (ALT) [27]. La inhibición de la TA es considerado como un objetivo potencial para la terapia del cáncer; sin embargo, la situación se complica por la existencia del mecanismo de ALT. La comprensión actual de la cinética de la longitud de los telómeros en ausencia de TA y posterior acoplamiento de la vía de ALT se basa principalmente en las células de cáncer de colon humano de reparación deficiente no coincidentes y línea celular de cáncer de laringe Hep-2 [28], [29]. En este trabajo, DN hTERT se utilizó para inhibir funcionalmente AT en T24 del cáncer de vejiga, 5637, y las líneas celulares 253J, y se secuencia se determinó la alteración de la longitud del telómero. Por desgracia, después de la transfección, la mayoría de estas líneas celulares de cáncer de vejiga se fue a la muerte, y no hay un solo clon de células podrían ser cultivadas y se pasaron a excepción de las células T24. Nuestros datos muestran que, aunque la tasa de proliferación de células T24 con la inhibición de la telomerasa fue retardado y la longitud de los telómeros se acortó en el paso anterior, se observaron las características asociadas con la vía ALT-como durante el cultivo a largo plazo. También vale la pena señalar que el nivel total de la LMP y complejo MRN aumentó obviamente, ya que más focos de MRE11, RAD50 y NBS1 fueron observados en el núcleo de las células supervivientes T24 /DN868A (Fig. S3). Mientras que la inhibición de la telomerasa dieron lugar a la muerte celular o la reaparición de TA como se informó anteriormente [30], [31], nuestro estudio revela no obvio de la regulación de la telomerasa en cada paso sobre la base de la Q-FISH y el ensayo TRF, lo que sugiere que es poco probable que la telomerasa restante es la causa principal para el alargamiento de los telómeros observado en células /DN868A T24. En su lugar, nuestros datos demuestran que el mecanismo de ALT-como podría ser la forma alternativa por la que las células de cáncer de vejiga escapar de inhibición de la telomerasa.
Activación de los resultados de ALT de conjuntos de cambios genéticos que son de tipo específico de tumor, y muchos factores contribuir a la selección de este mecanismo para el mantenimiento de los telómeros. T24 células expresan un mutante supresor de tumores p53 y la proteína de un nivel muy bajo de MSH6 [32], [33], que son considerados como factores que contribuyen a la activación de ALT [34], [35]. Esto puede explicar en parte por qué entre muchas líneas celulares de cáncer de vejiga, sólo el T24 se escapó de la etapa de crisis de células y continuó de estar vivo
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A pesar de ALT en los tumores no se ha estudiado ampliamente, se está convirtiendo en claro que las células de origen epitelial mantener sus telómeros a través de la vía de la telomerasa, mientras que ALT es más frecuentemente presentes en los tumores de origen mesenquimal [5]. EMT es un proceso en el que las células epiteliales pierden su fenotipo epitelial y adquieren nuevos rasgos característicos de mesénquima [36]. Curiosamente, la senescencia celular se puede omitir durante la activación de EMT que normalmente acompaña a la progresión del tumor [15]. En las células epiteliales de la lente con cataratas caninas, el proceso de EMT también implica de TERT [37]. En este estudio, hemos notado que la morfología de las células T24 hTERT inactivado mostró un cambio gradual desde mesenquimales 25
º paso durante el cultivo consistente como lo demuestra la forma de huso y la pérdida de las uniones intercelulares. marcadores epiteliales reducida y el aumento de los marcadores mesenquimales se muestran tanto en las células T24 /DN868A supervivientes antes de que el en el set de características de ALT-similares, y muestras de tumores derivados de las células supervivientes, lo que sugiere que la EMT se activó para eludir la senescencia celular como se ve en otras publicaciones (13 , 15). Sobre la base de la diferente tiempo de aparición APB y la formación de EMT, muy probablemente, las vías que conducen a estos cambios pueden ser diferentes.
telomerasa y ALT se cree que son funcionalmente desigual en que provocó la progresión tumoral, pero sigue siendo contradictorio que vía es más agresivo. Algunos estudios sugieren que la vía de ALT, al menos en algunas líneas celulares, no sustituye funcionalmente para la telomerasa con respecto a la tumorigenicidad y lesiones metastásicas [38]. En este estudio, hemos examinado la capacidad de sobrevivir a la progresión de las células T24 /DN868A. En comparación con las de las células parentales T24 o de control, la motilidad, invasión y capacidad de formación de clon
in vitro Opiniones y tumorigenicidad
in vivo Red de sobrevivir a las células T24 /DN868A se mejoraron significativamente, mientras que la capacidad adhesiva de sobreviven las células T24 /DN868A
in vitro
fue inhibida, lo que proporciona un fuerte apoyo que este fenotipo totalmente maligno se desencadenó en las células supervivientes T24 /DN868A con EMT.
La hélice-bucle-hélice básica ( bHLH) factor de transcripción Twist es un apuntador de la EMT [39], y su sobreexpresión se correlaciona significativamente con el estadio y el grado del tumor de vejiga humana [40]. En el contexto de la carcinogénesis, la torcedura puede suprimir simultáneamente la respuesta de la senescencia e inducir la EMT [41]. En el presente estudio, se encontró que la torcedura se sobreexpresa en las células supervivientes T24 /DN868A del 24
º paso, y más agregada en los tejidos tumorales de los animales de la vejiga. En consonancia, el agotamiento de Twist reduce la capacidad de sobrevivir progresión T24 /DN868A e induce mesenquimal a epitelial (MET) -como el cambio.