Extracto
Antecedentes y propósito
NAD (P) H: quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) reducción de quinona mediada y posteriores UDP-glucuronosiltransferasas (UGTs) catalizadas glucuronidación es la vía metabólica dominante de tanshinone IIA (TSA), un agente anti-cáncer prometedor. UGTs se expresan positivamente en diversos tejidos tumorales y desempeñan un papel importante en la eliminación metabólica de TSA. Este estudio tiene como objetivo explorar el papel de UGT1A en la determinación de la acumulación intracelular y la apoptosis efecto resultante de la TSA.
enfoque experimental
Hemos examinado TSA acumulación intracelular y glucuronidación en HT29 (UGT1A positivo) y HCT116 (UGT1A negativo) líneas celulares de cáncer de colon humano. También se examinaron las especies reactivas de oxígeno mediadas por TSA (ROS), la citotoxicidad y efecto apoptótico en HT29 y células HCT116 para investigar si los niveles de UGT1A se asocian directamente con TSA efecto anti-cáncer. UGT1A siRNA o propofol, un inhibidor competitivo UGT1A9, se utilizó para inhibir la expresión o actividad UGT1A UGT1A9.
Resultados clave
múltiples isoformas UGT1A se expresan positivamente en HT29, pero no en células HCT116. fracciones celulares S9 preparadas a partir de células HT29 exhiben fuerte actividad glucuronidación hacia TSA, que puede ser inhibida por propofol o interferencia UGT1A siRNA. TSA acumulación intracelular en las células HT29 es mucho menor que la de las células HCT116, que se correlaciona con altos niveles de expresión de UGT1A en las células HT29. Consistentemente, TSA induce menos intracelular de ROS, la citotoxicidad y efecto apoptótico en células HT29 que los de las células HCT116. El tratamiento previo de las células HT29 con UGT1A siRNA o propofol puede disminuir la glucuronidación TSA y mejorar al mismo tiempo su acumulación intracelular, así como mejorar la TSA efecto anti-cáncer.
Conclusiones e implicaciones
UGT1A puede comprometer TSA citotoxicidad a través de la reducción de su exposición intracelular y el cambio del ciclo redox NQO1 disparado a la eliminación metabólica. Nuestro estudio puede arrojar una luz en la comprensión de la farmacocinética celular y el mecanismo molecular por el que UGT Determinar los efectos de la quimioterapia de fármacos que son sustratos UGT '
Visto:. Liu M, Wang Q, F Liu, Cheng X, Wu X, Wang H, et al. (2013) UDP-1A glucuronosyltransferase compromisos intracelular de acumulación y de Lucha contra el Cáncer Efecto de Tanshinona IIA en células de cáncer de colon humano. PLoS ONE 8 (11): e79172. doi: 10.1371 /journal.pone.0079172
Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 27 de mayo de 2013; Aceptado: September 20, 2013; Publicado: 14 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio contó con el apoyo financiero de la Fundación para el autor de Nacional Excelente Tesis de Doctorado de China (subvención 200979), Fundación de Ciencias Naturales de China (Subvenciones 91029746 y 81273586), Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (Subvenciones BK2011065 y BK2012026), y el Programa de New Century talentos excelentes en la Universidad de Grant (NCET-09-0770). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
UDP-glucuronosyltransferases (UGT) catalizan la glucuronidación de muchos sustratos endógenos lipofílicas tales como la bilirrubina y las hormonas esteroides y xenobióticos, incluyendo carcinógenos y fármacos clínicos [1], [2], [3]. En la mayoría de los casos, el metabolismo mediado por UGT promueve la eliminación metabólica y disminuye las eficacias biológicas de los sustratos, aunque se han observado varios casos de bioactivación [4], [5]. UGTs son por lo tanto consideradas como un sistema de desintoxicación importante. Los polimorfismos genéticos de UGTs que causan actividad enzimática reducida se han asociado con el riesgo de cáncer, tal como cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer del tracto digestivo proximal, carcinoma hepatocelular y cáncer de próstata [6], [7]. Por otra parte, las actividades enzimáticas mejoradas de UGT pueden representar un importante contribuyente a quimioterapéutico resistencia de muchos fármacos que son sustratos UGT ', como irinotecán, metotrexato, epirubicina, y el tamoxifeno [8], [9], [10], [11] , lo que implica un papel crucial de UGT en la terapia contra el cáncer. UGTs se expresan positivamente en diversos tipos de tejidos tumorales y las células, aunque a un nivel relativamente más bajo en comparación con los tejidos normales correspondientes [12], [13], [14], [15]. Aunque UGT han reclamado como una causa importante de la resistencia a quimioterápicos, se sabe poco acerca de la influencia directa de UGT en relación con la acumulación intracelular en las células cancerosas diana y la eficacia de los fármacos quimioterapéuticos.
Tanshinona IIA (TSA) es una compuesto diterpeno fenantrenquinona aislado de la raíz seca de la salvia miltiorrhiza (Dan Shen en chino), que es un medicamento a base de hierbas ampliamente utilizado con eficacias cardiovasculares y cerebrovasculares bien probados [16], [17], [18]. En particular, la acumulación de evidencia apoya que la TSA es un agente prometedor contra el cáncer [19], [20], [21], [22]. Anteriormente hemos aclarado que la TSA se elimina predominantemente a través de NAD (P) H secuencial: quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) y UGT catalizada metabolismo [23], [24]. NQO1 cataliza una reducción de dos electrones de TSA la producción de un metabolito catecol muy inestable que se puede glucuronizado rápidamente si UGTs están presentes. Sin embargo, cuando UGTs están ausentes, el catecol altamente reactivo intermedio puede someterse a un ciclo redox de la reducción de quinona y de auto-oxidación, un proceso que produce una cantidad excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS). Basándose en este hallazgo, hemos validado recientemente que NQO1 es un objetivo importante intracelular de TSA que provoca la muerte apoptótica de cáncer humano no pequeñas de pulmón de células células (NSCLC) [25].
Sobre la base de nuestra reciente hallazgo de que múltiples isoformas UGT1A están involucrados en TSA glucuronidación [24], el presente estudio se centra en la aclaración de la función de estos UGTs en la determinación de la acumulación intracelular y efecto apoptótico de TSA en células de cáncer de colon humano. Aquí mostramos que la TSA glucuronidación en células de cáncer de UGT-positivos disminuye la acumulación intracelular de TSA, se rompió el ciclo redox NOQ1 desencadenada, y por consiguiente reducir el TSA inducida por la formación de ROS y su efecto contra el cáncer.
Materiales y Métodos
líneas celulares y líneas celulares de cáncer de colon humano Cultura y
HT29 y HCT116 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, EE.UU.). Las células crecieron en 5a de McCoy (Gibco, EE.UU.) medio con 10% de suero fetal bovino (Hyclone, EE.UU.), 100 ml T
-1 penicilina, y 100 mg ml
-1 estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada atmósfera con 5% de CO
2. Para diferentes fines, las células se cultivaron durante 24-72 horas en el medio y después se añadieron los fármacos. se utilizó tripsina (2,5%) para la cosecha de células. Todas las células estaban libres de micoplasma.
Productos químicos y Reactivos
TSA se adquirió en el Instituto Nacional para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos (Pekín, China), y preparado en dispersión sólida con PEG6000 como se describe [26]. Propofol, 4-metilumbeliferona (4-MU), ácido micofenólico (MPA), N-acetil cisteína (NAC), dicumarol (DIC), glucosa 6-fosfato, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) , uridina ácido 5'-difosfato-glucurónico (UDPGA), D-sacárico ácido 1,4-lactona, β-D-glucuronidasa (Escherichia coli), clorzoxazona, 2 ', 7'-diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA), y 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) se obtuvieron todos de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Anexina V-FITC Kit de Detección de Apoptosis se adquirió de Bipec Biopharma Corporation (EE.UU.). Los cebadores de PCR en tiempo real para la detección de las transcripciones de UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9, y UGT1A10 se compraron de Invitrogen (CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra UGT1A (Abcam, EE.UU.), UGT1A9 (Abcam, EE.UU.), y GAPDH (Boster Biología, China) fueron utilizados en el análisis de Western blot. Alto rendimiento acetonitrilo cromatografía (HPLC) de grado líquido se obtuvo de Fisher Scientific (Toronto, Canadá). Todos los demás productos químicos eran de grado HPLC o el mejor grado que estaba disponible comercialmente.
transfección transitoria de UGT1A siRNA
La transfección transitoria se realizó utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, la cautela de ARNi de ARNsi (Invitrogen, EE.UU.) para UGT1A silencio o un control negativo se mezclaron con Lipofectamine RNAiMAX Reactivo en Opti-MEM I (Gibco, EE.UU.) a una concentración florón de 20 nm, y se añadió la mezcla de siRNA a una placa de cultivo apropiado a temperatura ambiente. Células en crecimiento exponencial se sembraron posteriormente en la placa que contiene la mezcla de la transfección. Las células se incubaron en una incubadora (5% CO
2) a 37 ° C durante 24-72 horas.
cuantificación de los niveles de ARNm de
ARNm total fue extraído a partir de células, y cDNA se sintetizó mediante el kit de reactivos PrimeScrip RT (Takara Biotecnología, Dalian, china). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó mediante SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara Biotecnología, Dalian, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias de cebadores usados en PCR en tiempo real se enumeran en la información de apoyo 1 (Tabla S1). condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 1 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 30 segundos, y 72 ° C durante 30 segundos.
Western Blot Analysis
se recogieron las células y se extrajo la proteína total. A continuación, la concentración de proteína se determinó utilizando el BCA Protein Assay Kit (Beyotime, China). Igual cantidad de proteínas (50 g) se cargaron y se separaron por electroforesis en SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (PALL, EE.UU.). Las transferencias se bloquearon con leche desnatada 5% en un tampón de TBST y se incubaron durante 24 horas a 4 ° C con anticuerpos primarios específicos. La membrana se lavó 3 veces con TBST y luego incubadas con anticuerpo secundario conjugado con HRP (KeyGen, Nanjing, China) durante 1 hora a 37 ° C. La señal se visualizó mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL, Millipore). Los niveles de expresión de proteínas fueron normalizados con GAPDH.
UGT Ensayo de actividad
actividad UGT fue presentado por la actividad de glucuronidación del sustrato con células fracciones S9. Se recogieron las células por 2,5% de tripsina y se lavaron en PBS helado, se homogeneizaron en PBS, y se centrifugaron a 9000 g durante 20 min a 4 ° C para obtener células fracciones S9. El contenido de proteína de las fracciones S9 se determinó usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime, China). De acuerdo con los informes anteriores [27], [28], el sustrato UGT1A no específica 4-MU se utilizó para determinar la actividad general de UGT1A, y MPA, que se glucuronizado principalmente por UGT1A9 se utilizó para determinar la actividad UGT1A9. Brevemente, 4-MU o MPA (0,5 mM) se incubó en una mezcla de reacción que contiene 200 l 0,1 mg (0,2 mg de MPA) de células fracciones S9, UDPGA 2 mM, 1 mM sacárico ácido 1,4-lactona, mM MgCl 5
2, y 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 7,4) a 37 ° C durante 15 min (30 min para MPA). Las fracciones S9 se pretrataron con alameticina a una concentración de 25 mg mg
-1 en hielo durante 20 min. Después de pre-incubación de 5 min a 37 ° C, la reacción se inició mediante la adición de UDPGA. Las reacciones se detuvieron por la adición de 400 l de acetonitrilo enfriado con hielo y se centrifugaron las muestras durante 10 minutos a 20.000 g. muestras de sobrenadante (100 l) se analizaron mediante un Shimadzu (Kyoto, Japón) sistema de HPLC LC-2010C equipado con una bomba cuaternaria, automuestreador, horno de columna y detector UV. La separación se realizó usando una columna de Lunar-C18 (250 x 4,6 mm de diámetro interno, 5 m, Phenomenex Inc., China) con una columna de seguridad (Phenomenex Inc., China). Para 4-Mu, la fase móvil fue acetonitrilo (A) y agua con 25 mM de K
2HPO
3 (B) a una velocidad de flujo de 1 ml min
-1; la elución se llevó a cabo con el siguiente gradiente: 15% A (0-2 min), gradiente lineal de 15% a 60% A (2-5 min), 60% a 40% A (5-8 min), y 15% a para 8-10 min, y luego durante otros 5 min de equilibrado con una temperatura de columna de 40 ° C y detección UV a 322 nm. Para MPA, la fase móvil fue acetonitrilo (A) y agua con 0,1% (v /v) de ácido acético (B) a una velocidad de flujo de 1 ml min
-1; elución se realizó con el siguiente gradiente: 45% (0-2 min), gradiente lineal de 45% a 80% A (2-8 min), 80% de A durante otra 1 min, y 45% de A durante 9-10min y a continuación, durante otras 4 min de equilibrado con una temperatura de columna de 40 ° C y detección UV a 250 nm. La cuantificación exacta de los glucurónidos de nueva formación se logró mediante la calibración con patrones auténticos (Sigma, EE.UU.).
glucuronidación Ensayo de TSA en S9 fracciones
La fracción S9 (0,25 mg) se incubó con indicado concentraciones de TSA en una mezcla de reacción que consta de UDPGA 2 mM, 1 mM sacárico ácido 1,4-lactona, mM MgCl 5
2, y un sistema de NADPH-regeneración que contiene NADP 0,2 mM, glucosa 1,9 mM 6-fosfato, 1,2 U ml
-1 de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 7,4) en un volumen final de 200 microlitros. La fracción S9 se trató previamente con alameticina a una concentración de 25 mg mg
-1 en hielo durante 20 min para disminuir la latencia de la actividad de UGT. Para el ensayo de cinética enzimática, después de la pre-incubación de 5 min a 37 ° C, la reacción se inició mediante la adición de UDPGA y se incubó a 37 ° C durante 60 min. Para el estudio de inhibición de propofol, propofol (0-400 mM) fue co-incubaron con TSA (20 mM) a 37 ° C durante 20 min. Todas las reacciones se terminaron mediante acetonitrilo enfriado con hielo, seguido de centrifugación a 20.000 g durante 10 min para obtener los sobrenadantes, y luego analizado por el sistema de HPLC de la misma como se describió anteriormente con el método basado en nuestro informe anterior [24].
TSA intracelular y la acumulación en las células vivas glucuronidación
células que crecían exponencialmente con el 70% de confluencia fueron expuestos a 20 M TSA durante 0,5, 2, 6, 24 y 48 horas. Las células y el medio de cultivo se recogieron por separado en los puntos de tiempo indicados. Las células se lavaron tres veces por PBS enfriado con hielo. Se añadió agua ultrapura (300 l) a cada muestra de células y la congelación /descongelación tres veces para romper las células. se añadió De cualquier célula o muestra de medio de cultivo (100 l) con acetonitrilo enfriado con hielo (300 l) y mezclado por vórtice fuerte durante 5 min, seguido de centrifugación a 20.000 g durante 10 minutos para obtener el sobrenadante, después se analizaron por el método de HPLC basado en nuestro informe anterior [24]. Las concentraciones de fármaco se normalizaron mediante la determinación de la concentración de proteína de las muestras de células utilizando el BCA Protein Assay Kit (Beyotime, China).
ROS Ensayo
concentración indicada de TSA se administró a las células a 70% confluencia durante 1 hora. Luego, las células se trataron con DCFH-DA durante 30 minutos y se lavaron por PBS enfriado con hielo por tres veces. ROS celular puede conversar no fluorescente DCFH-DA a su derivado fluorescente DCF. la formación de ROS se analizó midiendo la intensidad de fluorescencia de DCF en 535 nm (con 488 nm de excitación) en Sinergia-H1 fluorímetro (Bio-Tek Instruments).
Ensayo de citotoxicidad
Las células se sembraron a 7.000 células por pocillo a una placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Las células se expusieron posteriormente a las concentraciones indicadas de TSA. Después de 48 horas (para HCT116) o 72 horas (por HT29), se añadió MTT (5 mg ml
-1) a cada pocillo, y la placa se incubó a 37 ° C durante otras 4 horas. a continuación, se separó la solución MTT y se añadió 150 l de DMSO por pocillo. La absorbancia a 570 nm se midió mediante un lector de microplacas.
Apoptosis Ensayo
Las células se sembraron por 2 × 10
5 /pocillo en una placa de 6 pocillos y se alcanzó 60% de confluencia después de 72 horas de cultivo. Luego, las células fueron expuestas a la concentración indicada de TSA durante 48 horas (HCT116) o 72 horas (HT29) y se recogieron por 0,25% de tripsina sin EDTA y se lavaron por PBS enfriado con hielo. Se utilizó la anexina V-FITC Kit de Detección de Apoptosis (Bipec Biopharma Corporation, EE.UU.) para teñir las células de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron analizadas utilizando un citómetro de flujo (BD FACSCalibur, EE.UU.).
Análisis estadístico
Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Se evaluaron las diferencias estadísticas entre los dos grupos utilizando la prueba t de Student; para comparaciones múltiples, se aplicó análisis de varianza de una sola vía seguido de la prueba de Dunnet. La diferencia fue considerada significativa en * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, o *** P & lt; 0,001
Resultados
UGT1A múltiples isoformas se expresan positivamente en HT29 pero no en HCT116. las células
en primer lugar, evaluamos los niveles de expresión de isoformas UGT1A que participaron en TSA glucuronidación por PCR en tiempo real en ambas líneas celulares HT29 y HCT116. La Figura 1A muestra el patrón de expresión de genes de las isoformas de UGT1A en las células HT29. Por el contrario, no se detectó expresión de genes en las células HCT116 UGT1A (datos no mostrados). Para investigar más a fondo el papel de UGTs, se utilizó siRNA específico para silenciar genes UGT1A en las células HT29. Tres pares de siRNAs dirigidos contra la secuencia de UGT1A fueron diseñados, y el mejor par con los efectos de silenciamiento más altos junto con no específica siRNA como se examinó un control negativo. Después de las transfecciones de ARNsi, los niveles de mRNA se evaluaron en células HT29. Los niveles de ARNm de UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9, y UGT1A10 se redujeron en un 85,8%, 31,4%, 87,5%, 66,5% y 68,2%, respectivamente, mientras que los ARNsi de control negativo tuvieron poco efecto (Figura 1A). ensayo de transferencia Western apoyó un alto nivel de expresión de UGT1A en células HT29, mientras que no se observó proteína UGT1A detectable en las células HCT116 (Figura 1B). La expresión de la proteína de UGT1A total y UGT1A9 específica se disminuyó considerablemente por UGT1A siRNA en células HT29 (Figura 1B y 1C). Los resultados de ensayo de actividad de UGT mostraron que las células HT29 poseen alta capacidad hacia la glucuronidación de 4-MU, un sustrato UGT1A general y MPA, una sonda de UGT1A9 relativamente específico. 4-MU actividades de glucuronidación y AMP se redujeron con UGT1A siRNA transfección por 85.6% y 57%, respectivamente (Figura 1B y 1C). De acuerdo con el ARNm y el examen los niveles de proteína, no se detectó UGT1A actividad enzimática específica en las células HCT116 (Figura 1B).
Las células se trataron previamente con UGT1A siRNA, no específica siRNA (control negativo) o vehículo durante 48 horas. niveles (A) de ARNm de UGT1A isoformas en las células HT29. nivel UGT1A1 mRNA de las células con vehículo se tomó como 1; (B) los niveles de proteína y actividades enzimáticas de UGT1A; (C) los niveles de proteína y actividades enzimáticas de UGT1A9. La actividad total UGT1A se determinó mediante la detección de la velocidad de 4-Mu glucuronidación, y la actividad específica UGT1A9 se determinó mediante la detección de la velocidad del MPA glucuronidación. La actividad enzimática se expresó como nmoles por minuto por mg de proteína. Una actividad UGT1A & lt; 0,1 nmol min
-1 mg
-1 fue considerado no detectable (ND). Los resultados se presentan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes.
La inhibición de la expresión UGT1A o UGT1A9 Actividad Reduce TSA Glucuronidación en HT29 celulares S9 fracciones
Para obtener la comprensión de la TSA glucuronidación por las células de cáncer de colon, se realizó el ensayo de cinética enzimática usando fracciones S9 preparadas a partir de células HT29 con o sin tratamiento UGT1A siRNA. De acuerdo con nuestro estudio anterior [24], M1 y M2, un par de regioisómeros de glucurónidos de catecol TSA, se detectaron a partir de HT29, pero no de células HCT116 fracciones S9. TSA glucuronidación muestra una típica cinética de Michaelis-Menten (Figura 2A y 2B). Los parámetros cinéticos, incluyendo la aparente K
m, la velocidad máxima (V
max), aclaramiento intrínseco (CL
int, V
max /K
m) para M1 y M2, y la suma CL
int (M1 + M2) se resumen en la Tabla 1. el silenciamiento de las isoformas de UGT1A por UGT1A siRNA dirigido a una disminución de 10 veces de V
valores máximos para la producción tanto de M1 y M2, mientras que tenía poca influencia en K
m valores. En consecuencia, la CL
int para M1 y M2 y la suma CL
int (M1 + M2) del grupo de silencio UGT1A fueron aproximadamente 10 veces más bajos que los del grupo control negativo.
la cinética enzimática para la formación de glucurónidos TSA (M1 y M2) se examinó en las fracciones (a) de células S9 preparadas a partir de las células HT29 tratadas previamente con ARNsi de control negativo, y las fracciones S9 (B) de células preparados a partir de las células HT29 tratadas previamente con UGT1A siRNA. (C) efecto inhibidor de propofol (0-400 mM) en TSA glucuronidación en células HT29 fracciones S9. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
El efecto inhibidor de propofol en TSA glucuronidación en fracciones de células HT29 también fue examinado. Como un sustrato específico UGT1A9 [8], propofol mostró una inhibición aproximada del 25% de ambos M1 y M2 a 100 mM, y alrededor de 40% de inhibición a 400 mM (Figura 2C).
UGT1A Determinantes TSA acumulación en el cáncer de colon las células
Para probar si UGT1A puede influir en la disposición de la TSA en las células vivas, se realizó un estudio farmacocinético celular. Se determinó la acumulación intracelular dinámica de TSA y sus metabolitos (M1 y M2). De interés, el nivel intracelular de TSA aumentó continuamente durante el transcurso de 48 horas después del tratamiento TSA en células HCT116. Sin embargo, la concentración de TSA en células HT29 alcanzó su punto máximo a las 6 horas y luego se redujo drásticamente (Figura 3A). El área bajo la curva de 0 a 48 horas (AUC
0-48 h) y la concentración máxima (C
max) de TSA en HCT116 eran mucho más alta que en las células HT29 (Tabla 2). El tratamiento previo de las células HT29 con propofol resultó en un aumento significativo acumulación intracelular de TSA. Del mismo modo, UGT1A siRNA transfección también aumentó la acumulación TSA en las células HT29 (Figura 3A, Tabla 2). Tanto M1 y M2 fueron detectables en las células HT29 en 0,5 horas después del tratamiento TSA, lo que sugiere una rápida producción intracelular de glucurónidos. Los niveles intracelulares de M1 y M2 alcanzó su punto máximo a las 6 h y luego disminuyó (Figura 3B y 3C), mientras que los niveles de glucurónidos de TSA en medio de cultivo acumulan continuamente durante el curso de la detección (Figura 3D y 3E). La formación de M2, pero no M1, se redujo en cualquiera de propofol o transfección UGT1A siRNA en células HT29 (Figura 3B y 3C, la Tabla 2). Tanto propofol y UGT1A siRNA disminuyeron significativamente la formación de glucurónidos TSA M1 y M2 en el medio de cultivo (Figura 3D y 3E, la Tabla 2).
HT29 células fueron pretratadas con UGT1A siRNA o vehículo durante 48 horas, o pretratadas con propofol (100 mM) durante 1 hora. Luego, las células fueron expuestas a TSA (20 mM) durante 0,5, 2, se recogieron y se prepararon para el análisis HPLC 6, 24, y 48 horas y muestras de tanto el medio de cultivo y las células. TSA y sus glucurónidos (M1 y M2) se detectaron con el método basado en nuestro informe anterior [24]. (A) TSA intracelular de HT29 o células HCT116; (B) intracelular M1 de células HT29; (C) intracelular M2 de células HT29; (D) M1 en medio de cultivo de células HT29; medio de cultivo celular (E) M2 en HT29. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes.
UGT1A Disminuye TSA inducida por la formación de ROS
Hemos demostrado anteriormente que la TSA se metaboliza para producir NQO1 un catecol intermedio altamente inestable que podría ser o bien conjugado por UGTs o espontáneamente volvió de nuevo a TSA padre para formar un ciclo redox inútil con cantidades excesivas de la producción de ROS [23]. Por otra parte, se encontró que la TSA produjo un importante nivel de ROS en las células NSCLC, una línea de NQO1 positivo y negativo UGT celular [25]. así razonó que, en presencia de UGT1A, el ciclo redox provocado por la TSA se puede cambiar a la eliminación metabólica y reduciendo de este modo la producción de ROS. Para examinar esta hipótesis, el ensayo de tinción con DCF se llevó a cabo para controlar la formación de ROS inducida por la TSA. TSA induce la formación dependiente de la dosis de ROS en células HCT116 (Figuras 4A). Sin embargo, estos cambios en la formación de ROS no se observaron en las células HT29 (Figura 4B). Cuando se utilizó propofol para inhibir la actividad UGT1A9 en células HT29, el nivel de ROS inducida por TSA aumentó significativamente en aproximadamente 3,6 veces en 40 mM TSA, y este aumento fue revertida por NAC (Figura 4B). Por el contrario, el propofol no cambió el nivel de ROS inducida por la TSA en las células HCT116, pero la combinación de NAC todavía disminuyó el nivel de ROS inducida por la TSA (Figuras 4A). Además, UGT1A siRNA transfección también mejora de forma significativa los niveles de ROS por 2,0 veces en 40 mM en células HT29 (Figura 4C).
Las células se trataron previamente con UGT1A siRNA o siRNA no específica (control negativo) durante 48 horas o pretratados con propofol (100 M) /NAC (5 mM) durante 1 hora. Luego, las células fueron expuestas a TSA (5, 20, 40 M) durante 1 hora y posteriormente se trataron con DCFH-DA. La intensidad de fluorescencia se midió mediante un fluorímetro. células HCT116 (A); (B) y las células HT29 (C). Los resultados se presentan como la media ± SD de al menos cuatro experimentos independientes (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, el tratamiento TSA vs células de control;
#P & lt; 0,05,
## P & lt; 0,01,
### P. & lt; 0,001, propofol /NAC tratamiento previo vs TSA solamente, o UGT1A siRNA tratamiento previo frente al control negativo siRNA tratamiento previo) guía empresas
UGT1A Hace que la resistencia del cáncer de colon Las células a la citotoxicidad inducida por TSA
El exceso de ROS pueden inducir la interrupción de la homeostasis redox intracelular, y modificaciones oxidativas irreversibles de lípido, proteína, o ADN, posteriormente promover la muerte celular apoptótica a través tanto del receptor de muerte y las vías de mitocondrias mediada [29 ]. Hemos validado recientemente que la citotoxicidad inducida por la TSA es dependiente de ROS [25]. Dado que la presencia de UGT1A en células HT29 en peligro la producción de ROS, se propone que la expresión de genes UGT1A aumentaría la resistencia de las células cancerosas a la citotoxicidad inducida por TSA. Con este fin, el ensayo de MTT se realizó tanto en células HCT116 y HT29. Los resultados mostraron que TSA produjo citotoxicidad dramático en células HCT116 que expresan no UGT1A con una CI
50 valor en 4,5 ± 0,4 M (Figura 5A). En contraste, las células HT29, que expresan enzimas UGT1A abundantes, se encontraron muy resistente a la citotoxicidad TSA con un IC
50 valor en 54,3 ± 4,7 mM (Figura 5B). El pretratamiento con propofol para inhibir la actividad UGT1A9 aumentó significativamente TSA citotoxicidad en células HT29 con una CI
50 valor de 29,9 ± 4,5 M (Figura 5B), que fue revertida por la combinación de NAC (IC
50 & gt; 80 M) . En las células HCT116, no se observó propofol-aumentada su citotoxicidad TSA, pero combinación NAC causada alta resistencia TSA (Figura 5A). En conjunto, estos resultados sugieren que el efecto del propofol en las células HT29 es de la inhibición de la UGT1A9 y promover así el ciclo redox inútil de TSA. Consistentemente, transfecciones UGT1A siRNA también aumentó el efecto citotóxico de la TSA en las células HT29 y redujo significativamente el IC
50 valor de 25,9 ± 5,6 M (Figura 5C).
Las células fueron pretratadas con UGT1A siRNA o no siRNA (control negativo) durante 24 horas, o pretratados con propofol (100 M) /NAC (5 mM) durante 1 hora. Luego, las células fueron expuestas a concentraciones de gradiente de TSA (2,5 a 80 micras para HT29; 0,5-40 micras para HCT116) durante el tiempo indicado y el ensayo de MTT se realizó. células HCT116 (A); (B) y las células HT29 (C). Los resultados se presentan como media ± desviación estándar de al menos cuatro experimentos independientes (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001) guía empresas
La apoptosis inducida por la TSA UGT1A compromisos de Colón. las células cancerosas
Para explorar más a fondo el papel de UGT1A total y UGT1A9 en la actividad anticancerígena mediada por la TSA, célula muerte apoptótica fue examinado por la V-FITC ensayo de tinción con anexina /PI. Cuando las células HT29 fueron expuestos a la concentración indicada de TSA durante 72 horas, había pocas células apoptóticas detectables (Figura 6B). Sin embargo, se observó la muerte apoptótica en las células HCT116 después de 48 horas de exposición a TSA en una forma dependiente de la dosis. La muerte celular apoptótica fue 20,7 ± 1,7%, 30,8 ± 2,4% y 48,7 ± 3,0% con concentraciones de TSA de 5, 20, y 40 mM, respectivamente (Figura 6A). Propofol (100 M) restauró significativamente la susceptibilidad de las células HT29 de la muerte apoptótica inducida por TSA, de los niveles de apoptosis basales a una relación apoptótica de 27,8 ± 4,5%, 45,0 ± 3,5%, y 53,5 ± 14,7% a los 5, 20, y 40 M TSA, respectivamente (Figura 6B). apoptosis Propofol mejorada no se observó en las células HCT116 (Figura 6A). Del mismo modo, UGT1A siRNA transfección aumento de la apoptosis celular inducida por TSA en células HT29, caracterizando con 16,2 ± 1,4%, 40,3 ± 4,3% y 48,5 ± 3,2% de células apoptóticas en concentraciones de TSA de 5, 20 y 40 mM, respectivamente (Figura 6C ).
Las células se trataron previamente con UGT1A siRNA o siRNA no específica (control negativo) durante 72 horas, o pretratadas con propofol (100 mM) durante 1 hora. Luego, las células fueron expuestas a TSA (5, 20, 40 M) durante el tiempo indicado y se recoge. Las células se tiñeron por Anexina V-FITC /PI y examinados por una citometría de flujo. células HCT116 (A); (B) y las células HT29 (C). Los resultados se presentan como la media ± SD de al menos tres experimentos independientes (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, el tratamiento TSA vs células de control;
#P & lt; 0,05,
## P & lt; 0,01,
### P. & lt; 0,001, propofol pretratamiento vs TSA solamente, o UGT1A siRNA tratamiento previo frente al control negativo siRNA tratamiento previo) guía empresas
Discusión
Muchas contra agentes CANCER son sustratos de UGTs, y por esta razón, el significado funcional de UGTs en la causa de la resistencia quimioterapéutico se ha convertido en una preocupación importante. A pesar de los esfuerzos anteriores para abordar esta cuestión importante, se sabe poco sobre el efecto directo de UGTs expresadas en tejidos /células tumorales en la determinación de la acumulación intracelular y el efecto contra el cáncer resultante de tales agentes que son sustratos UGTs. Mostramos en el presente estudio que el nivel de expresión de UGT1A y, en particular UGT1A9, es un factor importante en la determinación de la acumulación intracelular y el efecto apoptótico de TSA en células de cáncer de colon humano
.
Nuestro estudio anterior identificó que isoformas UGT1A, incluyendo UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A10 y, en particular UGT1A9, son las enzimas dominantes implicados en la glucuronidación de TSA siguientes su reducción por NQO1. Aunque UGT2B7 puede estar implicada en la producción de M1 y contribuir a la glucuronidación total de TSA, la CL
int (M1 + M2) valor de UGT1A9 fue mucho mayor que la de UGT2B7 [24]. Y en células HT29, la expresión basal de UGT2B7 es mucho menor que UGT1A9 (Figura S1). Basándose en este hallazgo, el silenciamiento de UGT1A por UGT1A siRNA y la inhibición de UGT1A9 por propofol se examinaron en el metabolismo de TSA y la toxicidad en el presente estudio.
Células
HT29 poseen suficiente actividad de la enzima UGT a glucuronidate TSA tanto en el fracciones S9 y células vivas (Figura 1, 2, 3).