Extracto
expresión de proteínas del ciclo celular juega un papel importante en la fisiopatología del cáncer de cuello uterino. Sin embargo, pocos estudios han intentado correlacionar el uso de estos biomarcadores con la progresión clínica del tumor.
Objetivos
1) Para analizar la expresión de Ki-67, p53 y p16
INK4a en el cáncer cervical, 2) para correlacionar la expresión relativa de estas proteínas, así como los parámetros clínicos con la etapa de la enfermedad, y 3) para determinar la distribución de la prevalencia de ADN del VPH y subtipo.
Métodos
se analizaron Tejido micro-arrays (TMA) de los pacientes con cáncer invasivo de cuello uterino (ICC) y los controles. la detección del ADN del virus se utilizó PCR e hibridación in situ. Ki-67, p53 y p16
INK4a se analizaron por inmunohistoquímica; datos clínicos se deriva de la revisión de las historias
Resultados
estadio tumoral avanzado (III y IV) se asoció fuertemente (p & lt; 0,005). con la edad avanzada (& gt; 55 años), con más de cuatro embarazos y con la falta de educación formal. ADN de VPH se encontró en 94.3% de los casos con los tipos más frecuentes de ser HPV16 (67,5%), seguido de HPV33 (12,0%) y HPV35 (3,6%). Alta expresión de Ki-67 y p16 fue más frecuente en las etapas avanzadas de la FIGO (p = 0,023). Las mujeres con VPH16 tendían a ser más jóvenes (50,9 años; SE 1,9) en comparación con las mujeres con otros tipos (59,9 años; SE 2.8).
Conclusión
encontró que Ki-67 y p16 expresión se asociaron de forma independiente con el estadio del tumor. También hemos observado que aproximadamente 1/3 de los cánceres de cuello uterino en esta cohorte de Brasil no estaban asociados con los tipos de VPH directamente afectados por las vacunas actuales contra el VPH
Visto:. Amaro Filho-SM, Golub JE, Nuovo GJ, Cunha CB, Levi JE, Villa LL, et al. (2013) Análisis comparativo de los factores clínicos y moleculares con la etapa del cáncer de cuello uterino en una cohorte de Brasil. PLoS ONE 8 (3): e57810. doi: 10.1371 /journal.pone.0057810
Editor: Valli De Re, Centro di Riferimento Oncológico, Instituto Nacional del Cáncer IRCCS, Italia |
Recibido: 7 Septiembre, 2012; Aceptado: 26 Enero 2013; Publicado: 7 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Amaro-Filho et al. . Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Conceder una ayuda : AFN y SAF eran eruditos en el Programa de Investigación del SIDA y Capacitación, apoyados por el Centro Internacional Fogarty de los Institutos nacionales de Salud (NIH) Beca de Investigación 2 D-43 TW000010-23 AITRP. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de LIPMED-IOCFiocruz, RJ, Brasil y la Fundación Lewis (del Dr. Gerard J Laboratorio Nuovo). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de los prometedores resultados obtenidos en las últimas décadas con la proyección de las mujeres asintomáticas mediante la prueba de Papanicolaou y más recientemente con el advenimiento de las vacunas contra el VPH, el cáncer de cuello uterino sigue siendo una enfermedad común con cerca de 530.000 nuevos casos y 275.000 muertes por año [1]. La gestión clásica de cáncer cervical invasivo (CCI) consiste en la evaluación de la extensión del tumor que incluye el tamaño del tumor, profundidad de la invasión, invasión tumoral microvascular espacio, diseminado a los ganglios linfáticos regionales, y el grado de diferenciación. El tratamiento del cáncer de cuello uterino se basa en la evaluación de la etapa clínica del tumor según la clasificación de la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO). Para los primeros estadios (FIGO I-IIA) la cirugía o la radioterapia (RT), se emplea, en tanto que para finales de etapas (FIGO IIB-IV) de la quimioterapia está indicada [2]. Sin embargo, la estadificación clínica tiene ciertas limitaciones debido a variables tales como la variabilidad entre observadores. Las discrepancias se han reportado hasta en el 25% de los casos de la enfermedad en estadio temprano y 65-90% en avanzada (≥IIB) enfermedad [3], [4].
tecnologías de imagen, como la tomografía computarizada y la ecografía , se han adoptado para mejorar la precisión de la estadificación clínica del cáncer de cuello uterino. Sin embargo, algunos estudios han reportado una baja sensibilidad y resultados altos falsos negativos con estas [2] métodos. Por lo tanto, se necesitan nuevos marcadores predictivos para identificar pacientes con alto riesgo de recaída, peor pronóstico, y para optimizar la gestión de la enfermedad, especialmente en el cáncer cervical invasivo temprano (CPI).
La infección persistente con ciertos tipos de papilomavirus humanos (especialmente Los tipos 16 y 18) ha sido bien documentado como un co-factor necesario para el desarrollo del cáncer cervical. Los tipos de VPH de alto riesgo son capaces de accionar los complejos vías que en última instancia conduce a un cáncer invasivo, en parte, debido a la capacidad de las oncoproteínas E6 y E7 virales para conducir las células en la fase S [5]. E7 asociados con la proteína retinoblastoma (pRb), que es una proteína supresora de tumores relacionados con varios tipos de cáncer más importantes. pRb evita que la célula se replique el ADN dañado mediante la prevención de su progresión a lo largo del ciclo celular a través de G1 (primera fase de separación) en S (fase de síntesis) [6] - [9] y está involucrado en la prevención de crecimiento celular excesivo mediante la inhibición de la progresión del ciclo celular hasta la célula está lista para dividir cuando pRb se une e inhibe la familia E2F de factores de transcripción [10], [11]. Después de E7 y pRb asociación, las proteínas E2F son capaces de posteriormente transactiva quinasas celulares de ciclina (CDKs dependet proteínas), necesarias para la replicación de ADN viral, que pueden conducir a cáncer [6]. Futhermore, E7 también es capaz de interactuar con otras proteínas implicadas en la proliferación celular, tales como histona desacetilasas, los componentes del complejo de transcripción AP1 y los inhibidores de quinasa dependientes de ciclina, incluyendo p21 y p27 [12]. E6 es capaz de mediar la ubiquitinación y la degradación de p53. Esto, a su vez, reduce la eficacia de la respuesta al daño del ADN celular y permite la acumulación de mutaciones secundarias que, a su vez, aumenta el riesgo de la formación de cáncer [5].
antígeno Ki-67, también conocido como Ki -67 o MKI67 es una proteína nuclear que en los humanos está codificada por el gen MKI67 y está estrictamente asociada con la proliferación celular. proteína Ki-67 está presente durante todas las fases activas del ciclo celular (G1, S, G2, y mitosis), pero está ausente de las células en reposo. Se ha encontrado que es un factor predictivo fiable para el desarrollo de tumores. Por lo tanto, el índice de proliferación Ki-67, lo que refleja el porcentaje de células tumorales que proliferan activamente, es un marcador de uso común en la patología de diagnóstico para diferenciar entre tumores benignos y malignos [13] - [15]. P16
INK4a es un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, que actúa como un supresor de tumor mediante la unión a las quinasas dependientes de ciclina como CDK4 y CDK6, la prevención de la fosforilación y la posterior inactivación de la proteína retinoblastoma (pRb), en los humanos está codificada por el gen CDKN2A y juega un papel importante en la regulación del ciclo celular. Este gen genera varias variantes de la transcripción que difieren en sus primeros exones. Recientemente un estudio encontró varios nuevos genes que se expresan diferencialmente en el cáncer de cuello uterino y se sobreexpresa en los cánceres de cuello uterino, confirmado por inmunohistoquímica como MMP 3, UBE2C y la proteína p16 [16]. p16 difusa
INK4a expresión se ha relacionado con el VPH de alto riesgo (HR-HPV), la infección, especialmente en la neoplasia intraepitelial cervical de alto grado y el cáncer [17] - [19].
La proteína P53, conocida como la proteína 53 o proteína de tumor 53, es una proteína supresora de tumores donde se regula el ciclo celular y, por lo tanto, funciona como un supresor tumoral que está implicada en la prevención del cáncer. P53 tiene un papel importante en la conservación de la estabilidad mediante la prevención de las mutaciones del genoma. En los seres humanos, p53 está codificada por el gen TP53 situado en el brazo corto del cromosoma 17. En las células no estresadas, los niveles de p53 se mantienen bajos a través de una degradación continua de p53 Sin embargo si el gen TP53 está dañado, la supresión de tumores se reduce severamente [20] . El gen TP53 también puede ser dañado en las células por mutágenos que aumentan la probabilidad de que la célula comenzará división descontrolado. Más de 50 por ciento de los tumores humanos contiene una mutación o deleción del gen TP53. En el cáncer cervical, el HPV E6 se une a la oncoproteína p53 y promueve su degradación por la vía ubiquitina proteólisis [21] - [24]. Algunos agentes patógenos, como el VPH también pueden afectar la expresión proteínas p53. Los resultados contradictorios se han publicado en relación con la expresión de p53, algunos estudios han mostrando una correlación positiva de p53 con lesiones de alto grado y cáncer cervical, mientras que otros declaran asociaciones significativas [21], [25].
El presente estudio fue realizado para examinar la hipótesis de que las proteínas implicadas en el ciclo celular Ki-67, p53 y p16
INK4a se sobreexpresa en el cuello uterino de los pacientes con cáncer de cuello uterino y, más específicamente, para evaluar la correlación entre estos biomarcadores con la etapa FIGO y el genotipo de VPH. Por otra parte, también se analizaron las características socio-demográficas, clínicas y de comportamiento de la población de estudio, por lo tanto, nuestros objetivos principales fueron: 1) Para analizar la expresión de Ki-67, p53 y p16
INK4a en el cáncer de cuello de útero 2) para buscar una la expresión diferencial que puede ayudar en la evaluación de la estadificación clínica del tumor según la clasificación de la FIGO, y 3) para determinar la distribución de los genotipos de ADN del VPH en esta población.
Materiales y Métodos
las muestras de tejido y los datos colección
el material de estudio consistió en 130 muestras seleccionadas al azar de los archivos del Instituto Fernandes Figueira, Fundación Oswaldo Cruz, Río de Janeiro, Brasil. Las muestras de 87 pacientes obtenidas por biopsia cervical o conización entre 2003 y 2008 fueron confirmados histopatológicamente por un patólogo quirúrgico como el cáncer cervical invasivo. Cuarenta y tres pacientes sometidos a histerectomía por enfermedad benigna leiomiomas utilizaron como controles.
Los datos sociodemográficos y de salud se obtuvieron de tablas individuales de cada paciente. Se recogieron los siguientes datos: edad, historia y del pack años de fumar tabaco, la historia de consumo de alcohol, anticonceptivos (hormonales), la edad de la primera relación sexual, el número de embarazos, nivel de educación, el VIH-1 serología y estadio FIGO. La Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Fundación Oswaldo Cruz (Fiocruz), (CAE 0024.0.011.000-09-, Río de Janeiro, Brasil) aprobó el uso de consentimiento por escrito en este estudio.
Tejido Micro-Array (TMA) de construcción de edificios.
El Tejido bloques de micromatrices se construyeron como se describe por Pires y otros, 2006 [26]. En resumen, todas las diapositivas hematoxilina-eosina (HE) fueron re-examinadas por un segundo patólogo con experiencia y dos campos representativos morfológicas de cáncer de cuello uterino invasivo fueron elegidos y rodearon con un rotulador. Dos núcleos de cada caso fueron perforados hacia fuera de los bloques donantes. El correspondiente H & amp; E diapositivas se cubrieron con un calibre de 16 Becton-Dickinson PrecisionGlide® aguja hipodérmica hecha a la medida (1,1 mm
2 de área). Después, los núcleos se añadieron mediante la cinta adhesiva de doble lado en una cuadrícula de papel generada por ordenador proporcionando de alineación en el molde de bloque, que después se llena de parafina líquida. Tres micras de espesor secciones se obtuvieron de un microtomo estándar rotador óptico (Leica, Bensheim, Alemania). Cada bloque proporciona 40-50 diapositivas; sólo se utilizaron muestras que muestran la lesión original. Un total de dos bloques TMA se construyeron, uno con biopsias de cáncer cervical y el otro con controles en los que la ausencia de neoplasia intraepitelial cervical (CIN) se confirmó mediante examen de la hematoxilina y eosina portaobjetos teñido.
extracción de ADN .
A partir de cada una biopsia de cuello uterino se incluyeron en parafina, se cortaron 4 rebanadas de 5 micras. En resumen, después de desparafinado con xileno a 48 ° C durante 2 horas, etanol (100%, 70% y 50%) se añadió para eliminar el xileno residual, seguido de la rehidratación y la centrifugación a 12000 rpm por 15 min en cada paso. El sedimento se resuspendió en solución con 300 l de proteinasa K (100 mg /ml) y 10% de SDS durante 48 horas a 48 ° C. Se añadieron cinco microlitros de proteinasa K (200 mg /mL) después de 24 horas. Se aisló el ADN por una extracción con fenol que contiene 300 l de fenol /cloroformo /alcohol isoamílico (25/24/1) seguido de centrifugación (12.000 rpm por 10 min) para obtener la fase acuosa. Después de repetir estas etapas de purificación dos veces, el ADN se precipitó a 20 ° C durante 24 horas con acetato de 100 l de sodio (concentración final 7,5 M) y dos veces el volumen de la fase acuosa de etanol al 100%. El sedimento de ADN se recogió por centrifugación durante 15 min a 12.000 rpm a 4 ° C, se lavó con 70% de etanol y se resuspendió en 50 l de tampón TE (Tris base 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). La cantidad y calidad del ADN se analizó por NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EE.UU.).
amplificación por PCR y genotipado de HPV.
La amplificación de la región consenso HPV L1 se realizó con genérico cebadores GP5 + y GP6 + (sintetizados por Invitrogen, Sao Paulo, SP, Brasil) para generar un producto de PCR de aproximadamente 150 pb como se ha descrito anteriormente (sintetizado por Invitroge
n
, Sao Paulo, SP, Brasil; secuencia de cebador : GP5 +
TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
; revertir secuencia del cebador GP6 +
GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
) [27], [28]. Las muestras negativas con estos cebadores fueron sometidas a PCR anidada utilizando una primera ronda de amplificación con los cebadores PGMY09 y PGMY11, previamente descrito (sintetizados por Invitrogen, Sao Paulo, SP, Brasil; secuencia del cebador hacia adelante: PGMY11A
GCACAGGGACATAACAATGG
, PGMY11B
GCGCAGGGCCACAATAATGG
, PGMY11C
GCACAGGGACATAATAATGG
, PGMY11D
GCCCAGGGCCACAACAATGG
, PGMY11E
GCTCAGGGTTTAAACAATGG
; revertir la secuencia del cebador: PGMY09F
CGTCCCAAAGGAAACTGATC
, PGMY09G
CGACCTAAAGGAAACTGATC
, PGMY09H
CGTCCAAAAGGAAACTGATC
, PGMY09I
GCCAAGGGGAAACTGATC
, PGMY09J
CGTCCCAAAGGATACTGATC
, PGMY09K
CGTCCAAGGGGATACTGATC
, PGMY09L
CGACCTAAAGGGAATTGATC
, PGMY09M
CGACCTAGTGGAAATTGATC
, PGMY09N
CGACCAAGGGGATATTGATC
, PGMY09P
GCCCAACGGAAACTGATC
, PGMY09Q
CGACCCAAGGGAAACTGGTC
, PGMY09R
CGTCCTAAAGGAAACTGGTC
, HMB01
GCGACCCAATGCAAATTGGT
) [29]. Cada ensayo de PCR incluyó como control positivo de ADN Hela celular (ADN HPV18) y un control negativo plantilla. La integridad de la muestra de ADN se verificó mediante amplificación de 110 bp fragmento del gen β-globina con cebadores PC03 y PC04. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador 9700 GeneAmp PCR System (Applied Biosystems), y se analizaron todos los productos de PCR por electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
Un volumen final de reacción de 75 l se purificó por el GF -1 Kit de recuperación de ADN (Vivantis, Oceanside, CA, EE.UU.), con el fin de determinar el genotipo. Para la secuenciación de una solución que contiene 3,2 pmol de cada cebador (GP5 + o GP6 +), 5-10 ng del producto de PCR, 2,5 l Big Dye Terminator v 3.1 Ciclo de Secuenciación Kit (número de pieza 4337455; Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y se preparó MilliQ agua para completar el volumen final de 10 mL. Las mezclas fueron analizados en un ABI Prism 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) disponibles en el ADN PDTIS /Plataforma Fiocruz [30]. Alineaciones se obtienen directamente de la línea en el servidor Blastn o filogenéticamente analizados por el MEGA5 de software [31]. Los casos no amplificadas por PCR o no pueden ser secuenciados donde comprobado para el ADN del VPH por medio de la INNO-LiPA HPV Genotipado v2 (Innogenetics, Gante, Bélgica). Tres casos dudosos también fueron analizados por el Kit de PapilloCheck (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania).
La inmunohistoquímica (IHC).
IHC reacciones se realizaron en TMA silano revestido con diapositivas (Sigma , St. Louis, MO, EE.UU.), como se describe anteriormente [32]. Brevemente, los portaobjetos se desparafinaron en xileno, se rehidrataron a través de una serie de etanol, se lavaron con agua destilada y después se trataron en solución con metanol que contiene 0,3% de peróxido de hidrógeno durante 10 min para eliminar la actividad peroxidasa endógena. la recuperación de antígeno para todos inmunohistoquímica se realizó por ebullición de los tejidos con la solución de recuperación de Target (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.). La unión de anticuerpo no específica fue inhibida por la incubación de las secciones con el bloque de proteína sin suero (1% de BSA). Las secciones de tejido se incubaron secuencialmente durante la noche en una cámara humidificada a 4 ° C de temperatura con los anticuerpos específicos primarios (diluciones): anticuerpo monoclonal anti-Ki67 (listo para usar - Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.), el anticuerpo monoclonal anti-p53 (1 /10 - Santa Cruz Biotechnology, Inc-CA-EE.UU.) y el anticuerpo monoclonal anti-p16
INK4a (1/250 - Santa Cruz Biotechnology, Inc-CA-EE.UU.). Un anticuerpo secundario biotinilado multilink se aplicó durante 30 min, seguido de estreptavidina-peroxidasa durante 30 min. La reacción enzimática se desarrolló en una solución de 3,3 'diaminobencidina (DAKO, Glostrup, Dinamarca) de exposición para los 5 min, a excepción de p53, donde se utilizó el cromógeno Fastred (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina durante 1 min, se lavaron en agua destilada, se deshidrataron en etanol clasificado, limpiado con xileno y permanentemente montado en Entellan® (Merck, Darmstadt, Alemania).
Evaluación de diapositivas IHC y el recuento de células
Dos observadores independientes revisaron y se cuantificaron la expresión de todas las tinciones inmunohistoquímicas. El Ki-67 y p53 mancha incluye sólo la tinción nuclear. Dos áreas representativas de cada núcleo se contaron manualmente por los observadores y para Ki-67, clasificadas como: negativo, menos del 25% de núcleos celulares de cáncer positivo, 25-50% positivas o más del 50% positivos. Para p53 el sistema de puntuación fue el siguiente: negativo, menor o igual a los núcleos celulares de cáncer positivo 5%, 5-25% positivos y superiores a 25%. expresión inmunohistoquímica para p16
INK4a se cuantificó de acuerdo con la presencia (positivo o negativo), localización celular (nuclear y citoplásmico), intensidad de la tinción (débil, moderada y fuerte) y patrón de dispersión (difusa o focal).
Análisis estadístico.
los datos fueron analizados mediante el software STATA /sE 10.1. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba paramétrica t de Student para variables continuas, así como la prueba de chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher para las variables categóricas. Una prueba de tendencia través de grupos ordenados (nptrend) se constituyó para observar si los biomarcadores estaban siguiendo una expresión de tendencia lineal para la etapa FIGO. La regresión logística univariado se aplicó para verificar la asociación entre los factores demográficos, clínicos y de comportamiento con los grupos ICC y control. La sensibilidad (probabilidad de un verdadero positivo), especificidad (probabilidad de un verdadero negativo) y el índice de Youden (YI) (YI = sensibilidad especificidad +-1), como una medida de la eficacia diagnóstica global, se calcularon para diagnósticos de consenso de la FIGO III- IV y II-IV. Todos los valores de p son dos caras; los valores de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
características de la población de estudio el análisis
Este estudio incluyó a 130 mujeres (edad media de 51,1 ± 13,1 años de edad;. rango 24- 88). Con el fin de comparar las variables clínicas y estadio FIGO, características socio-demográficas, clínicas y de comportamiento fueron obtenidos de las cartas individuales de cada paciente. Sin embargo, algunos datos no estaban disponibles para todos los pacientes de la siguiente manera (N -%): edad (6-4,6%), nivel de educación (41-31,5%), tabaco (41-31,5%), el consumo de alcohol (43-33,1 %), los anticonceptivos (48 a 36,9), la primera relación sexual (53-40,8%), los números de embarazos (33-25,4%), el VIH-1 estado (86-66,2%) y el estadio de la FIGO (17-19,5%).
Asociaciones de histopatología y estadio FIGO con características socio-demográficas y clínicas
En esta población, mediante el análisis de regresión logística univariado, se observó que el consumo de tabaco, consumo de alcohol, anticonceptivos orales (píldoras anticonceptivas ), la edad de la primera relación sexual y estatus de VIH-1 no estaban relacionados con el cáncer de cuello uterino. Sin embargo, hubo una correlación estadísticamente significativa entre los grupos de cáncer y de control de cuello uterino en las siguientes categorías: pacientes mayores de 55 años (OR = 16,6; IC95% = 3,5 a 79,2; p & lt; 0,001), las mujeres sin educación formal (OR = 8,0; IC95% = 1,5 a 43,4; p = 0,016) y las mujeres con más de cuatro embarazos (OR = 7,2; IC 95% = 2,4-21,5; p = 0,001) (tabla 1). Además, entre los pacientes con cáncer de cuello uterino, hubo una asociación estadísticamente significativa entre el aumento del número de embarazos (3 o más), así como la falta de educación formal al comparar estadio I FIGO de FIGO estadios II-IV (p = 0,005).
prevalencia y distribución de VPH
Dos de las muestras de control 43 dieron resultados poco satisfactorios para la extracción de ADN y fueron excluidos del análisis de la prevalencia de ADN del VPH. Tres muestras negativas por PCR con GP5 + /6 + fueron positivas para el ADN viral mediante una PCR anidada utilizando PGMY09 /11 cebadores. La prevalencia total de ADN de VPH en los grupos de control y de cuello uterino fue del 29,3% (12/41) y 95,4% (83/87), respectivamente. La distribución de los genotipos de VPH en el control y en los grupos de cáncer de cuello uterino se muestra en la tabla 2. Las infecciones con más de dos tipos de VPH en una sola muestra eran raros; 2/92 muestras de VPH positivos presentaron múltiples infecciones. En el grupo control, el VPH tipo 16 reveló la prevalencia más alta (72,7%), seguido por los tipos 35, 67 y 6 (9,1% para cada uno). En las mujeres con cáncer de cuello uterino, HPV tipo 16 fue también el más prevalente (67,5%), seguido de tipo 33 (12,0%) y tipo 35 (3,6%). VPH tipo 58 y 6 fueron encontrados en dos casos (2,4%), mientras que el VPH 18, 31, 52, 67, 70, 69 y 30, fueron hallados sólo en 1 caso (1,2%). Las mujeres infectadas con VPH 16 mostraron una asociación estadísticamente significativa (p = 0,012) con la media más joven (50,9; 1,9 SE) en comparación con las mujeres con otros tipos (59,9; 2,8 SE).
análisis de la expresión de proteínas
el grado relativo de expresión de la proteína tal como se determina mediante técnicas de inmunohistoquímica se correlacionó con el estadio de la FIGO y para el genotipo de VPH en los casos de cáncer cervical por VPH positivas.
Ki-67 expresión de evaluación
la Ki-67 tinción fue nuclear y presente en 34 (82,9%) de los controles y 82 (94,3%) de los casos de cáncer cervical. Sin embargo, había una marcada diferencia en el patrón de distribución de Ki-67 en el cáncer de cuello uterino en comparación con el epitelio cervical normal. Específicamente, las células positivas Ki-67 se limitaron a la capa epitelial basal en el tejido cervical normal, mientras que, en los especímenes de cáncer de cuello uterino, Ki-67 expresión era difusa y presente en la mayoría de las células cancerosas desde el aspecto basal a la superficie de el tumor maligno. Con el fin de diferenciar y cuantificar el patrón de expresión entre las muestras de cáncer de cuello uterino y el control, Ki-67 expresión se asigna letras (A, B, C, D y F). "A" se refiere no hay señal Ki-67, "B" células positivas denota presente exclusivamente en el epitelio basal /parabasales, "C" representa la evidencia de células positivas en el basal /parabasales y el epitelio intermedia, "D" se refiere a una señal procedente la base a la superficie de los epitelios con menos de 25% de núcleo positivo, "e" se refiere a una señal desde la base hasta la superficie de los epitelios con 25% a 50% de núcleo positivo y "F" se asoció a una señal desde la base hasta la superficie de los epitelios con mayor que 50% de núcleo positivo (Figura 1). Como es evidente en la Tabla 3, se produjo un aumento significativo de tendencia Ki-67 expresión con un aumento del estadio FIGO (np
tendencia = 0,008) (tabla 3)
A, B y C:. Control epitelio; D, E y F: epitelio invasivo cáncer de cuello uterino. (Un negativo; (B) tinción positiva terminante en la capa basal; (C) tinción positiva en el basal y la capa intermedia; (D) menos de 25% de células positivas de todo el epitelio; (E) 25-50% de células positivas de todo el epitelio; (F) más del 50% de células positivas en todo el epitelio (DAB, mancha marrón; Mag. 40 ×).
P16
INK4a evaluación de la expresión
Los diferentes patrones de p16
se observaron señales INK4a basado en localización celular (nuclear y citoplasmática), intensidad de la tinción (débil, moderada y fuerte) y la dispersión patrón (difusa o focal). Sólo 5 (11,6%) de los controles eran p16
INK4a positivo, por el contrario, 83 (95,4%) de los tejidos de cáncer de cuello uterino fueron positivos (Figura 2). El patrón difuso de la expresión de p16 fue estadísticamente (p & lt; 0,001) asociados en general con el cáncer cervical (85,5%) casos frente a los controles. Los casos que presenten una expresión de p16 INK4a moderada
fueron más comunes en la avanzada de la FIGO estadios III-IV (56,5%), mientras que la debilidad de expresión se asoció con principios estadio I FIGO (66,7%) (p = 0,023) (Tabla 4). No se observó ninguna asociación entre el patrón de localización celular de p16
tinción INK4a y, o bien el grado del tumor o el estadio de la FIGO (p = 0,152 yp = 0,183, respectivamente)
A:. epitelio de control; B, C, D, E y F: epitelio invasivo cáncer de cuello uterino. (Un negativo; (B) nuclear moderada focal y la expresión citoplasmática; (C) difusa nuclear débil y la expresión citoplasmática; (D) difusa expresión citoplasmática moderada; (E) difusa nuclear fuerte y la expresión citoplasmática; (F) Negativo (DAB, mancha marrón; Mag. 40 ×).
P53 evaluación de la expresión
Se detectó la expresión de p53 positiva en 43 de los 87 (49,4% ) casos de cáncer de cuello uterino y negativos en todos los casos de control. p53 se expresa exclusivamente en el compartimiento nuclear en todos los casos positivos. se observó inmunotinción de menos de 5%, 5-25% y mayor que 25% de los núcleos de células de cáncer positivo en 26 (29,9%), 15 (17,2%) y 2 (2,3%), respectivamente de los cánceres de cuello uterino (Figura 3) .
A, B, C y D: el epitelio invasivo cáncer de cuello uterino. (Un negativo; (B) de menos de 5% de positividad mancha nuclear; (C) 5% a 25% mancha nuclear positividad; (D) superior al 25% (Fastred, mancha roja; Mag × 40, Fig A Mag.20 ×) guía empresas
Ki-67, p16
INK4a y p53 rendimiento clínico
.
también se examinó el rendimiento clínico (sensibilidad, especificidad y el índice de Youden) de diferentes puntos finales positivos para p16
INK4a, Ki-67 y la tinción de p53, y los marcadores combinados, en relación con los diagnósticos de consenso de la FIGO III- IV (FIGO III +) y la FIGO II-IV (FIGO II +). Combinando el punto final intensidad positiva para p16
tinción INK4a con Ki-67 y p53, la tinción aumentó la especificidad y la precisión para FIGO III + y FIGO II + detección (Tabla 5). La más alta sensibilidad y especificidad se observaron en los estadios avanzados (FIGO II +) por el índice de Youden; la adaptación de un punto de corte de más del 25% de las células que expresan Ki-67 y p16
INK4a con intensidad moderada o fuerte 93,5%, 100% y 93,5%.
Relación de VPH genotipos con los hallazgos inmunohistoquímicos
examinó si el VPH 16 o ciertas combinaciones de genotipos de VPH podrían influir en la expresión de los biomarcadores analizados en las muestras de la CPI. Alta expresión de Ki-67 se asoció con otros tipos de HPV, en comparación con el VPH 16 o cuando segregados en diferentes grupos (HPV 16 infección individual, otro de alto riesgo y de bajo riesgo e indeterminada, y las infecciones múltiples) como se muestra en la Tabla 6. No se observó ninguna relación entre p16
INK4a expresión y de grupo VPH genotipos. No hubo correlación significativa con la expresión de p53 y el genotipo del VPH (Tabla 6).
Discusión
observado una expresión creciente de Ki-67, p53 y p16
INK4a en especímenes de cáncer invasivo en comparación con los controles normales. Desde Ki-67 es un marcador de proliferación clásica y se ha utilizado para diferenciar benigna frente a tumores malignos en varios sitios, se esperaba que la fuerte correlación de Ki-67 y cervical malignidad [33]. Ki-67 se expresó en todas las capas del epitelio escamoso con cáncer invasivo. También se encuentra en los tejidos normales, sin embargo, restringido principalmente a la región de la capa parabasal. Estos datos están de acuerdo con varios estudios, en los Ki-67 han sido expuestos en los altos índices de especificidad y sensibilidad como un biomarcador para la neoplasia intraepitelial cervical [33], [34].
La proteína p53 no mostró en el etiquetado epitelio normal. En los especímenes de cáncer de cuello uterino invasivo, se encontró que 49,4% (43/87) fueron positivas, aunque mostrando expresión en un número mucho menor núcleos de las células de carcinoma en comparación con el patrón de expresión de otros marcadores. La literatura describe datos contradictorios para la expresión de p53 en el cáncer de cuello uterino, con tasas que van desde muy bajos porcentajes de 62,0% de las células del cáncer [21], [25]. Aunque la base de esta marcada disparidad de resultados está claro, puede relacionarse a diferentes causas, entre ellas diferente de fijación del tejido, así como los métodos de recuperación de antígeno y adoptó puntos de corte [35]. También se sabe que en muchos tipos de cáncer humano, el p53 se sobreexpresa como resultado de mutaciones que modifican su actividad transcripcional, que pueden, a su vez, afectar a otras proteínas reguladoras, por ejemplo, MDM2 (también llamado HDM2 para la proteína humana) . Sin embargo, en el caso del cáncer cervical, que parece ser diferente, ya que la proteína E6 de VPH de alto riesgo está asociado a la ubiquitinación de p53 y la posterior degradación por el proteasoma. Sin embargo esto no excluye la posibilidad de que algunos carcinomas cervicales presentan mutaciones puntuales de p53 [36]. Nuestros datos con respecto a la expresión de p53 es consistente con estudios anteriores, como por Bahnassy et al. (2007) y Skomedal et al. (1999) quienes encontraron, respectivamente, el 44,2% (19/43) y 55,4% (41/74) de las muestras de cáncer de cuello uterino invasivo positivos para p53 y en ambos estudios, ningún caso fue positivo en las muestras de control [33], [37 ].
en cuanto a p16
INK4a, varios estudios han documentado la sobreexpresión, con un patrón difuso y fuerte, no sólo en las lesiones intraepiteliales cervicales de alto grado, sino también con el cáncer invasivo en comparación con los especímenes normales [13] , [18], [33]. Nuestro estudio confirma este aumento en la expresión en cáncer invasivo en comparación con las muestras controles. Encontramos el 95,4% (83/87) del cáncer invasivo fueron positivos para p16
INK4a en comparación con el 11,6% (5/43) de los controles. Pocos trabajos han observado p16
INK4a expresión en tejidos normales [36], [38], [39]. Sin embargo, está bien establecido que las células epiteliales no displásicas pueden expresar p16
INK4a, por ejemplo, bajo ciertas condiciones fisiológicas, tales como el acortamiento de los telómeros en los tejidos más viejos. Aquí, la expresión de p16
INK4a induce inmediatamente la detención del ciclo celular y en última instancia, puede inducir la apoptosis con los resultados finales de ser un patrón focal con intensidad débil [40].
En cuanto a la etapa clínica de cáncer de cuello uterino, nuestra