Extracto
Aunque las mutaciones somáticas recurrentes en el factor de empalme
U2AF1 gratis (también conocido como
U2AF35
) se han identificado en varios tipos de cáncer, los efectos de estas mutaciones en el transcriptoma del cáncer aún no se han aclarado completamente. Aquí, hemos identificado alteraciones de empalme asociados con
U2AF1
mutaciones a través de distintos tipos de cáncer utilizando ADN y los datos de secuenciación de ARN a partir del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA). Utilizando los datos de RNA-Seq desde 182 adenocarcinomas de pulmón y 167 leucemias mieloides agudas (LMA), en el que
U2AF1
está mutado somáticamente en 3-4% de los casos, se identificaron 131 y 369 alteraciones de empalme, respectivamente, que estaban significativamente asociada con
U2AF1
mutación. De éstos, 30 alteraciones de empalme fueron estadísticamente significativas tanto en el adenocarcinoma de pulmón y AML, incluyendo tres genes en el gen del cáncer de censo,
CTNNB1
,
CHCHD7
, y
PICALM
. experimentos línea celular que expresa
U2AF1
S34F en células HeLa y en células 293T proporcionan más apoyo que estos eventos de empalme alterados son causados por
U2AF1
mutación. De acuerdo con la función de U2AF1 en 3 'del sitio de empalme reconocimiento, se encontró que las mutaciones S34F /Y causan preferencias para CAG sobre UAG secuencias 3' del sitio de empalme. Este informe demuestra efectos consistentes de
U2AF1
mutación de empalme en distintos tipos de células cancerosas
Visto:. Brooks AN, Choi PS, de Waal L, T Sharifnia, Imielinski M, Saksena G, et Alabama. (2014) Un Pan-cáncer Análisis de transcriptoma cambios asociados con mutaciones somáticas en
U2AF1
Revela Empalme Eventos comúnmente alterados. PLoS ONE 9 (1): e87361. doi: 10.1371 /journal.pone.0087361
Editor: Gil Ast, Universidad de Tel Aviv, Israel
Recibido: 28 Junio, 2013; Aceptado 20 de diciembre de 2013; Publicado: 31 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Brooks et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de subvención 5U24CA143867-03. ANB es un compañero de Merck del Runyon Cancer Research Foundation Damon (DRG-2138-12). JC es apoyado por la Sociedad Americana del Cáncer AstraZeneca beca posdoctoral. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
recientes estudios de secuenciación del exoma han identificado mutaciones somáticas recurrentes en los factores de empalme en los síndromes mielodisplásicos [1], la leucemia linfocítica crónica [2], la leucemia mieloide aguda [3], el cáncer de mama [4], el adenocarcinoma de pulmón [ ,,,0],5], y el melanoma uveal [6]. Muchos de estos factores de empalme son mutados punto de ramificación o 3 'de empalme factores de reconocimiento sitio (por ejemplo,
SF3B1
y
U2AF1
) y están implicados en la regulación de la eliminación de intrones del pre-ARNm. El 3 'complejo de reconocimiento del sitio de empalme se compone de U2AF1 y U2AF2 (también conocido como U2AF65), donde U2AF1 es importante para el reconocimiento de la AG en 3' sitios de empalme [7] y U2AF2 reconoce el tracto polypyrimidine aguas arriba de la AG [8 ].
U2AF1
se ha informado que tienen mutaciones hotspot significativos en la posición del aminoácido 34 en los síndromes mielodisplásicos [1], los adenocarcinomas de pulmón [5], y LMA [3].
U2AF1
mutaciones co-ocurren con mutaciones en los oncogenes conocidos conductor de adenocarcinoma de pulmón [5] y aún no está claro si estas mutaciones están transformando oncogenically. Para aclarar aún más los efectos centrales de
U2AF1
mutaciones sobre la biología del cáncer, que tuvo como objetivo identificar las alteraciones del transcriptoma comunes asociados con
U2AF1
mutaciones en distintos tipos de cáncer.
Resultados
mutaciones somáticas en
U2AF1
a través de 12 tipos de cáncer
Para observar los cambios asociados con el transcriptoma
U2AF1
mutaciones en diferentes tipos de cáncer, se utilizó el Atlas del Genoma del cáncer ( TCGA) de datos que proporcionan ambas mutaciones somáticas en la secuencia de ADN y nivel de alto rendimiento de mRNA (RNA-Seq) en las mismas muestras individuales a través de múltiples tipos de cáncer. Utilizando los datos disponibles a partir de 12 tipos de cáncer TCGA [9], hemos identificado el cáncer que albergan mutaciones somáticas en
U2AF1
. Al otro lado de 2.979 especímenes de cáncer tanto con la secuenciación del exoma y RNA-Seq, 26 tenían mutaciones sin sentido en
U2AF1
-17 en la posición del aminoácido 34 (Tabla S1 en el Documento S1, Figura 1).
U2AF1
mutaciones S34F se encontraron en ocho adenocarcinomas de pulmón (4%), cuatro muestras de AML (2%), dos carcinomas endometriales (1%), y una muestra de cáncer de vejiga (1%). También hubo dos
U2AF1
muestras S34Y AML (1%).
se informó U2AF1
a mutar significativamente en ambos adenocarcinomas de pulmón [5] y LMA [3]; sin embargo, no mutado significativamente en carcinomas endometriales [10], muy probablemente debido a la baja frecuencia dentro de este tipo de cáncer. Además de las mutaciones S34F /Y, se observaron otras ocho mutaciones somáticas en
U2AF1
. Para identificar alteraciones del transcriptoma asociados con
U2AF1
mutación, que se centró en el adenocarcinoma de pulmón y LMA ya que estos tipos de cáncer tienen una mayor frecuencia de mutaciones y así tendrían más poder para detectar cambios estadísticamente significativos asociados con la mutación y el control de diferencias entre el tejido de origen. Las mutaciones S34F y S34Y resultan en aminoácidos aromáticos; Por lo tanto, consideramos mutaciones S34F y S34Y ser funcionalmente similares.
(A) Representación de las mutaciones somáticas en
U2AF1
observado a través de 12 tipos de cáncer TCGA [9]. Cinco tipos de cáncer no tenían mutaciones somáticas en
U2AF1
. posiciones de los aminoácidos se indican. Zn, con dedos de zinc; UHM, U2AF homología con motivos. (B) Análisis de los datos JuncBASE RNA-Seq identificó 131 y 369 eventos de splicing significativamente diferencialmente empalmados en el adenocarcinoma de pulmón y LMA especímenes teniendo
U2AF1
mutaciones S34F /Y, respectivamente.
transcriptoma alteraciones asociadas a
U2AF1
mutaciones S34F /y en adenocarcinoma de pulmón y leucemia mieloide aguda
se utilizó JuncBASE [11] para identificar eventos de splicing alternativo que fueron significativamente diferencialmente longitudinalmente entre los
U2AF1
muestras de cáncer de tipo salvaje y
U2AF1
muestras S34F /y. identifica JuncBASE y clasifica las formas de splicing alternativo (por ejemplo, cinta de exón, alternativa 5 'sitios de empalme, alternativa 3' sitios de empalme), cuantifica la abundancia de la inclusión o exclusión de cada exón alternativo, a continuación, calcula un "porcentaje de corte y empalme en" (PSI ) valor para cada caso de empalme en cada muestra de cáncer. Una prueba de suma de rangos de Wilcoxon se llevó a cabo en los valores de PSI entre los cánceres con o sin
U2AF1
mutaciones S34F /Y para identificar los eventos de corte y empalme que fueron significativamente diferentes entre los dos grupos. Para el control de tejido de origen, se compararon
U2AF1
de tipo salvaje y muestras S34F /Y dentro del mismo tipo de cáncer. El
U2AF1
adenocarcinomas de pulmón S34F se encontraron en los tres subtipos de expresión (TCGA,
presentada
) y el
U2AF1
especímenes S34F /Y AML ocurrieron en cinco Francés-America- British subtipos (FAB) AML [3]; Por lo tanto, no controlamos más de subtipo. Las mutaciones somáticas en
U2AF1
se han encontrado para ser mutuamente excluyentes con otros factores de empalme [1], [3], [5], lo que sugiere que las mutaciones de la vía spliceosome pueden tener el mismo efecto funcional en la oncogénesis. Para eliminar posibles factores de confusión de mutaciones en otros factores de empalme, buscamos eventos empalmadas diferencialmente entre las muestras con
U2AF1
S34F /mutación Y y muestras que albergan ninguna mutación en cualquier gen factor de empalme que se ha informado anteriormente que se debe modificar de manera significativa en el cáncer (cuadros S1-S2 en el Documento S1).
Uso JuncBASE, se identificaron 131 y 369 eventos de splicing alternativo que fueron significativamente diferencialmente longitudinalmente en presencia de un
U2AF1
S34F /y mutación en el adenocarcinoma de pulmón y AML (Tasa de Falso Descubrimiento (FDR) & lt; 5%), respectivamente. Además, estos eventos de empalme tienen a & gt; 10% de diferencia en la PSI mediana de los cánceres sin factor de empalme mutación genética y el cáncer con
U2AF1
mutaciones S34F /Y (Archivo S1-S3). Comparando
U2AF1
S34F /Y mutación con
U2AF1
muestras de tipo salvaje (algunos con mutaciones en otros factores de empalme) produjo resultados similares en adenocarcinoma de pulmón (TCGA,
presentada
) y AML (S4 File). JuncBASE cuantificación de
U2AF1
eventos de splicing S34F /Y-asociado en la LMA fueron consistentes con un análisis de
U2AF1
mutaciones en 20 muestras de AML [12] (r
2 = 0,84, Figura S1 en el Documento S1).
Como un control positivo y negativo para este análisis, se compararon 10 muestras de adenocarcinoma de pulmón con un exón 14 del sitio de empalme mutación
MET
o eliminación con el resto de adenocarcinoma de pulmón muestras para buscar significativa corte y empalme diferencial entre los dos grupos. Los
MET
exón 14 alteraciones producen con una frecuencia similar a
U2AF1
mutaciones en adenocarcinoma de pulmón (TCGA,
presentada
). Este análisis sirve como un control positivo, porque el evento de empalme diferencial más fuertemente asociado debería ser
MET
exón 14. Este análisis también sirve como un control negativo que no se esperaría que las alteraciones de causar cambios globales en el empalme desde las mutaciones se producen en
cis-actuando
alteraciones sitio de empalme. De hecho, el análisis sólo se identificó JuncBASE el empalme de
MET
exón 14 empalmado como significativamente diferente con una diferencia en la ISP & gt;. 10%
Como control adicional, se identificaron eventos de splicing alternativo asociaron significativamente con
STAG2
mutaciones en el adenocarcinoma de pulmón y LMA, como
STAG2
no es de esperar que es un regulador de empalme y que está mutado a una frecuencia similar en ambos tipos de cáncer. Sólo evento de un empalme se asoció significativamente con
STAG2
mutación en el adenocarcinoma de pulmón y ninguno en la LMA.
Al igual que lo observado en una caracterización completa de adenocarcinoma de pulmón (TCGA,
presentaron
), los eventos de empalme asociados con
U2AF1
mutaciones S34F en la LMA también muestran enriquecimiento de cassette exones y 3 'sitios de empalme alternativo (Figura 1B). No observamos amplios efectos sobre la retención de intrón, que se cree que se producen en la presencia de una mutación spliceosome. Si
U2AF1
mutaciones causan muchos intrones para ser empalmado, tal vez no es de una manera consistente y esos casos se disipó por la descomposición mediada por el antisentido (NMD). Para ver si la cinta de exón y 3 'del sitio de empalme sesgo es una característica general de splicing alternativo en estos tipos de cáncer o específicas de empalme alterada por
U2AF1
mutación, se identificaron las proporciones de cada tipo de evento splicing alternativo en el 10% de empalme de eventos más altamente variables en adenocarcinomas de pulmón sin mutaciones en el factor de empalme (figura S2 en el Documento S1).
U2AF1
cánceres S34F /Y preferentemente presentan alteraciones en la cinta de exón y 3 'sitios de empalme en comparación con el conjunto de eventos de empalme muy variables (prueba de chi-cuadrado, p = 6.6e-26).
Aunque hay cambios de empalme que están asociados con
U2AF1
S34F /y mutación en estos especímenes de cáncer, no está claro si los cambios de empalme son causados por la mutación o si hay alteraciones genómicas desconocidas que también se correlaciona con los cambios de empalme. A fin de evaluar la relación entre los cambios de empalme y
U2AF1
S34F mutaciones, se analizaron los datos publicados previamente RNA-Seq que comparan la expresión ectópica de
U2AF1
S34F o
U2AF1
silvestre tipo de expresión en las células HeLa [1]. JuncBASE análisis comparando los controles sin inducción con
U2AF1
de tipo salvaje o
U2AF1
inducción S34F identificó 1.221 y 5.399 empalme cambios significativos, respectivamente (Archivo S5 y S6). Nos encontramos con un solapamiento significativo de 165 cambios de empalme a la inducción de
U2AF1
S34F en células HeLa y empalme cambios en los cánceres humanos con
U2AF1
mutaciones S34F /Y (Figura 2, la prueba exacta de Fisher, P & lt ; 2.2e-16). Por el contrario, nos encontramos con una menor proporción de empalme cambios a
U2AF1
inducción de tipo salvaje a ser similares a las alteraciones en los cánceres humanos (15/1221, prueba exacta de Fisher, p = 0,72). En total, el 35% de la
U2AF1
empalme cambios asociados S34F-Y /visto en el adenocarcinoma de pulmón o LMA son apoyados por empalme cambios causados por
U2AF1
S34F expresión en células HeLa. No esperaríamos que todos los cambios de empalme que deben observarse en los experimentos de células HeLa como se conoce a los cambios de empalme para ser dependientes del contexto (revisado en [13]) y
U2AF1
inducción provoca la sobreexpresión del gen [1], el cual puede afectar a la formación de complejos spliceosome.
Una comparación de los cambios en el empalme asociados con
U2AF1
mutación somática en los cánceres humanos y
U2AF1
inducción S34F en células HeLa.
U2AF1
S34F /Y empalmes preferentemente a CAG en lugar de UAG 'secuencias de sitio de empalme
U2AF1 es la pequeña subunidad del heterodímero U2AF que reconoce el consenso AG de 3' 3 sitios de empalme. Un estudio previo que identificó corte y empalme diferencial de 35 exones asociados con
U2AF1
mutación identificado una firma secuencia en 3 'sitios de empalme de los exones alternativos [12]. Teniendo en cuenta los cambios significativos en cassette exones alternativos y 3 'del sitio de empalme eventos asociados con
U2AF1
S34F /Y mutación, se analizaron las secuencias de 3' sitios de empalme que se utilizaron preferentemente en
U2AF1
S34F /Y cánceres mutado. Por simplicidad, sólo se examinaron los cambios de empalme entre dos 3 'sitios de empalme alternativos.
Como factor de empalme de unión puede variar en función de la activación o represión de empalme (revisado en [14]), nos fijamos en las secuencias del sitio de corte y empalme del exón inclusión y exclusión eventos, por separado. Del conjunto de
U2AF1
cassette exones S34F /Y-asociado y alternativa 3 'del sitio de empalme cambios en la LMA, hemos encontrado un sesgo significativo hacia saltando de un exón (69% de cassette exones) o el uso de un mayor distal 'del sitio de empalme (el 75% de 3 alternativas "3 sitios de empalme) (prueba binomial, P & lt; 1e-4, Figura 3A). Encontramos un sesgo similar hacia el salto de exón y el uso del sitio de empalme distal de
U2AF1
eventos de empalme en el adenocarcinoma de pulmón (Figura S3 en el Documento S1) S34F-asociado. A modo de comparación, se identificaron eventos de splicing alternativo asociados significativamente con
RBM10
mutación en el adenocarcinoma de pulmón (S7 Archivo). La proteína de unión de ARN
fue encontrado RBM10
a mutar de manera significativa en los adenocarcinomas pulmonares recurrentes con mutaciones del marco de lectura, sin sentido, o el sitio de empalme [5]. La omisión de exón observada es específica de
U2AF1
eventos de splicing S34F-asociado como el sesgo opuesto se observa en
RBM10
pérdida de función (LOF) -asociado eventos de empalme (Figura B-S4A en el Documento S1).
(a) Proporción de una alteración en el exón cassette y eventos del sitio 3 'de empalme alternativo que muestran frente a la omisión de exón exón inclusión. motivos (B) secuencia de consenso identificados en los extremos proximal (3'ss prox) y los sitios de empalme 3 'distales (dist) 3'ss de eventos omisión de exón. (C): motivos secuencia de consenso en los extremos proximal y sitios de empalme 3 'distales de los eventos de inclusión exón. cambios de empalme de 3 'del sitio de empalme opciones presentadas y comentadas en la elección del sitio de empalme es TAG vs. CAG o TAG vs. AAG en (D) + células HeLa inducidas
U2AF1
células (E) o HeLa S34F + inducidos
U2AF1
de tipo salvaje.
de acuerdo con resultados anteriores [12], encontramos una secuencia TAG trinucleótidos consenso en los sitios proximales 3 'empalme de cassette exones omitidos. Por otra parte, también encontramos este motivo en los sitios de empalme eventos próximos de 3 'del sitio de empalme alternativos en
U2AF1
muestras S34F /Y AML (Figura 3B). Además, se observa un sitio de empalme consenso CAG en el sitio de empalme 3 'más distal, que no se ha informado anteriormente (Figura 3B). Una preferencia similar de los sitios de empalme del CAG (con una secuencia AAG menor) sobre los sitios de empalme TAG se observa en los exones preferentemente incluidos en
U2AF1
muestras S34F /Y AML (Figura 3C). Estos sitio de empalme secuencia de motivos preferenciales difieren de los motivos del sitio de empalme observadas cerca proximal y distal 3 'sitios de empalme de eventos de control de splicing alternativo (Figura S4C en el Documento S1, Wilcoxon la suma de rangos, FDR & gt; 95%).
Sorprendentemente, vemos las mismas preferencias de secuencia en el exón 3 'casete y cambios en el sitio de corte y empalme alternativos en
U2AF1
adenocarcinomas pulmonares S34F (Figura S3 en el Documento S1) y en las células HeLa transducidas con
U2AF1
S34F constructos mutantes (Figura S5A-B en el Documento S1). Por otra parte, no vemos este consenso secuencia del sitio de empalme 3 'en el empalme asociado-LOF
RBM10 Hoteles en adenocarcinoma de pulmón (Figura S4A-B en el Documento S1) ni en los cambios de empalme en las células HeLa transducidas con el tipo salvaje
U2AF1 gratis (Figura S5C-D en el Documento S1), que corroboren que la secuencia de preferencia es específica de
U2AF1
mutaciones S34F /Y.
Estos motivos de secuencias de consenso se generaron a partir de empalme acontecimientos que se estaban fuertemente asociadas con
U2AF1
mutación y no se resuelven las preferencias de secuencia entre dos opciones del sitio de empalme de un empalme caso individual. Para investigar más a fondo las preferencias de empalme CAG más de los sitios de empalme UAG, se analizó la secuencia del sitio de empalme cambia entre todos los pares de expresado y anotada CAG frente TAG sitios de empalme 3 '. Usando una disminución del umbral para la identificación de los interruptores de corte y empalme, se encontró que el 57% de CAG frente TAG 3 'sitios de empalme se vio alterada en las células HeLa que expresan el
U2AF1
S34F mutación, mientras que el 36% se altera cuando se expresa un
U2AF1
constructo de tipo salvaje (Figura 3D). De
U2AF1
interruptores asociados sitio de empalme-S34F, el 83% (884 /1.065) eran una etiqueta a un sitio de empalme CAG, mientras que sólo el 53% (347/660) pasó de una etiqueta a una CAG al expresar U2AF1 de tipo salvaje (prueba exacta de Fisher, P & lt; 2.2e-16). Se observó un sesgo similar de interruptores de TAG a los sitios de empalme AAG 3 '(prueba exacta de Fisher, p = 2.518e-5, la figura 3D).
Nuestro análisis muestra que el
U2AF1
S34F /Y mutación provoca alteraciones en 3 'el uso del sitio de empalme donde un [C /a] AG 3' del sitio de empalme se prefiere más de un sitio de empalme UAG. No se observó empalme alterada de todos los sitios de empalme UAG 3 '; Sin embargo, es difícil distinguir entre el empalme inalterada o la degradación de la transcripción aberrante por la descomposición mediada por el antisentido, apareciendo por lo tanto no haber cambiado.
Transcriptome alteraciones en los genes del ciclo celular y otros genes del cáncer están asociados con
U2AF1
mutación
La mutación somática en
U2AF1
puede causar cambios de empalme de genes clave de cáncer, lo que resulta en la función del gen alterado o vías alteradas. Para identificar las posibles consecuencias biológicas de aguas abajo de
U2AF1
mutación, se realizó un análisis conjunto de genes de enriquecimiento (GSEA) [15], [16] para identificar conjuntos de genes correlacionados positivamente con el
U2AF1
S34F /y mutación en el adenocarcinoma de pulmón y en AML. No hay conjuntos de genes alcanzaron significación estadística dado un punto de corte FDR del 25%. Se informó anteriormente que la transducción de
U2AF1
mutaciones en células HeLa S34F causó la regulación al alza de los componentes de la vía de descomposición mediada por el antisentido (NMD) [1]. No se observó una regulación al alza significativa en la expresión de los factores asociados con NMD
U2AF1
mutación en el adenocarcinoma de pulmón o LMA.
A pesar de que no hay conjuntos de genes pasaron FDR importancia, la parte superior de dos genes ontología GO enriquecido conjuntos en la LMA con las puntuaciones más altas de enriquecimiento normalizados eran "ciclo celular mitotitc" y "fase M del ciclo celular mitótico" (Figura S6 en el Documento S1, nominal P & lt; 0,05). Un subconjunto de estos genes del ciclo celular se upregulated en muestras de LMA con
U2AF1
S34F /Y mutación. En consonancia con el efecto de
U2AF1
mutación en el ciclo celular, el agotamiento de RNAi de
U2AF1
[17] y
U2AF1
expresión S34F en células HeLa [1] da como resultado una aumento de la fracción de células en fase G2 /M. No vemos ninguna asociación con conjuntos de genes del ciclo celular en
adenocarcinomas pulmonares U2AF1
S34F. Esto puede explicarse por la contaminación de los tejidos normales alta en este tipo de cáncer [18], lo que puede afectar la expresión génica firmas
.
De acuerdo con estas observaciones, hay 31 genes con
U2AF1
S34F empalme de eventos representados en el "ciclo mitótico celular" y "fase M del ciclo celular mitótico" conjuntos de genes, incluyendo /y-asociado
CHEK2
,
Cdc27
, y múltiples subunidades de la anaphase- la promoción de complejos (Tabla S3 en el Documento S1).
empalme alteraciones asociadas con
U2AF1
S34F /y mutación en ambos adenocarcinoma de pulmón y LMA son de particular interés ya que estos genes comúnmente alteradas pueden hacer contribuciones selectivas ventaja en estos tipos de cáncer. Hemos encontrado una coincidencia significativa de 30 eventos de empalme alterados que estaban asociados con
U2AF1
mutaciones S34F /Y en tanto el adenocarcinoma de pulmón y AML (Figura 2 y Tabla 1, la prueba exacta de Fisher p & lt; 2.2e-16). Para todos los eventos de empalme 30, la dirección de empalme fue la misma en ambos tipos de cáncer, donde
U2AF1
mutación causó un cambio a la omisión de exón o inclusión exón para el mismo evento de empalme. La mayoría (63%) de los acontecimientos comúnmente alterados mostró el uso del sitio de empalme 3 'más distal en
U2AF1
muestras mutadas. Además, 17/30 empalme eventos se vieron afectados de manera significativa a la inducción de
U2AF1
S34F en células HeLa pero no tuvo ningún cambio tras la inducción de
U2AF1
de tipo salvaje (Tabla 1). El 60% de estos eventos de empalme comúnmente alterados muestran 3 'del sitio de empalme secuencia de preferencia de un CAG, o AAG, sitio de empalme sobre una etiqueta sitio de empalme (Tabla 1, A o B), consistente con la observada preferencia global secuencia del sitio de empalme de
eventos U2AF1
S34F /Y-asociado. Además, buscamos genes con los eventos de empalme alterados que también estaban en el gen de censo de cáncer [19] (Tabla S4 en el Documento S1). Tres genes gen del cáncer del censo estaban entre los 30 eventos de empalme comúnmente alterados y que son de particular interés:
CTNNB1 gratis (TCGA,
presentada
),
CHCHD7
, y
PICALM gratis (Tabla 1 y Tabla S4 en el Documento S1).
El caso de empalme alterada en
CTNNB1 Hoteles en
U2AF1
cánceres mutante da como resultado un cambio hacia el empalme de un sitio de empalme más proximal en el 3 'UTR de
CTNNB1
(Figura 4A-B). regulación al alza significativa de la utilización del sitio de empalme proximal también se observó en las células HeLa que expresan
U2AF1
S34F (Figura 4C). La isoforma upregulated se ha demostrado que es un mRNA menos estable en células HeLa [20]; Por lo tanto, el caso de empalme alterado puede resultar en una reducción de los niveles de proteína CTNNB1. Aunque,
CTNNB1
de activación es una mutación conductor canónica, una disminución en los niveles normales de CTNNB1 También puede ser ventajoso para las células cancerosas como RNAi agotamiento de
CTNNB1
se ha demostrado que aumenta la migración celular [21 ].
"Porcentaje de corte y empalme en" valores (PSI) del próximo "sitio de empalme de la
CTNNB1 página 3 'UTR 3 eventos de corte y empalme en (a) adenocarcinoma de pulmón y AML (B). (C) RNA-Seq leer la cobertura del evento 3 'UTR en células HeLa con dos
U2AF1
controles no inducidos, la inducción de
U2AF1
de tipo salvaje, y la inducción de
U2AF1
S34F.
Para más prueba experimentalmente si los eventos de splicing observan en
U2AF1
cánceres mutantes son causados directamente por
U2AF1
mutación, transfectadas 293T células con
U2AF1
de tipo salvaje o
U2AF1
construcciones S34F y se ensayaron los cambios en cinco eventos de splicing utilizando RT-PCR cuantitativa (Figura 5, Figura S7 en el Documento S1). Hemos sido capaces de validar los cambios en el empalme en
CTNNB1
,
CHCHD7
, y
PTBP1
en las células transfectadas con
U2AF1
construcciones S34F y no en las células transfectadas con
U2AF1
de tipo salvaje (Figura 5, la prueba t no pareada, P & lt; 0,1). eventos de empalme en
KARS
y
CHEK2
no validar y pueden ser dependientes del contexto, los falsos positivos en el análisis del transcriptoma, falsos negativos en el experimento de transfección, o retardados objetivos indirectos de
U2AF1
actividad.
a veces de diferencia entre la expresión génica total y la isoforma inclusión de cada evento de empalme se normalizó por la diferencia pliegue de una muestra de control no-transfección para producir un nivel de inclusión relativa para cada muestra. Las coordenadas genómicas de empalme eventos analizados en (A)
CTNNB1
, (B)
CHCHD7
, y (C)
PTBP1
se dan en la Tabla 1.
Discusión
Nuestro análisis de empalme y cambios de expresión génica asociados con
U2AF1
mutación a través de múltiples tipos de cáncer se ha puesto de manifiesto alteraciones en el reconocimiento de secuencias 3 'del sitio de empalme y pone de relieve las posibles consecuencias biológicas a través de los genes del cáncer alterados, tales como
CTNNB1
,
PICALM
, y
CHCHD7
. Además, hemos validado que al menos algunas de estas alteraciones de empalme son consecuencias directas de
U2AF1
mutación en experimentos de transfección.
Hay muchos factores que están implicados en el reconocimiento correcto del sitio de empalme en el complejo con U2AF1, incluyendo U2AF2. Ha sido bien conocido que sitio de empalme motivo de consenso 3 'incluye un C o U de nucleótidos antes de la AG en el extremo de los intrones y las mutaciones en
U2AF1
dar la primera indicación de que un factor tiene una preferencia específica para este posición -3 [12]. U2AF1 se ha demostrado que se unen débilmente a través de RNA que es UHM dominio [22]. Tal vez la mutación S34F en el dominio de dedos de zinc aguas arriba afecta a la secuencia de reconocimiento del sitio de empalme 3 'a través de la interacción directa con el pre-ARNm o a través de interacciones proteína-proteína con U2AF2, hnRNP A1 [23], o DEK [24]. Además de la caracterización bioquímica de la proteína U2AF1 S34F en complejo con otras proteínas puede conducir a una comprensión más general de "reconocimiento 3 secuencia del sitio de empalme.
En resumen, hemos encontrado varios genes, incluyendo varios genes del cáncer conocidos con el empalme alterada en la presencia de la
U2AF1
mutación tanto en el cáncer humano y en
U2AF1
mutantes células transfectadas. El impacto de estas alteraciones en la función de corte y empalme de genes es un tema importante para la investigación futura. Nuestra identificación de los cambios de empalme de manera significativa y consistentemente asociada con mutaciones somáticas en el
U2AF1
factor de empalme pone de relieve la necesidad de futuros estudios sobre la función de las formas alternativas de empalme de genes con el fin de comprender plenamente las alteraciones genómicas asociadas con el cáncer.
Métodos
las mutaciones somáticas
llamadas mutación somática a partir de los 12 tipos de cáncer TCGA Pan-cáncer se utilizaron (doi: 10.7303 /syn1710680.4), con la excepción de pulmón adenocarcinoma. Se tomaron de adenocarcinoma de pulmón llamadas mutación somática del grupo TCGA análisis de adenocarcinoma de pulmón de trabajo (TCGA,
presentada
).
procesamiento del ARN-Seq
RNA-Seq archivos de alineación para 230 adenocarcinomas de pulmón y 173 leucemias mieloide aguda (LMA) estaban disponibles a través de CGHub (https://cghub.ucsc.edu). alineaciones AML descargados de CGHub utilizan una versión más antigua de la referencia del genoma humano (hg18); Por lo tanto, los archivos AML BAM se convirtieron a FASTQ usando SamToFastq [25] y luego realinearse contra hg19 usando TopHat [26] con los siguientes parámetros: "-G [transcripciones Gencode v7 [27]] -mate-interior-dist 300 -mate -std-dEV 500 ". Una muestra de la LMA no RNA-Seq realineación y el procesamiento y fue excluido: TCGA-AB-2977. alineaciones de ARN-Seq muestras de adenocarcinoma de pulmón utilizan MapSplice [28].
archivos de RNA-Seq FASTQ de experimentos con células HeLa fueron descargados desde el repositorio DDBJ con los números de acceso DRR001796-DRR001799. Las lecturas fueron alineados utilizando TopHat [26] utilizando Gencode v7 [27] como una guía de transcripción.
Empalme análisis
muestras de adenocarcinoma de pulmón, AML muestras, y las muestras de los experimentos línea celular HeLa (HeLa +
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no inducido, HeLa +
U2AF1
S34F no inducido, HeLa +
U2AF1
de tipo salvaje inducida, HeLa +
U2AF1
S34F inducida por el tipo salvaje ) se ejecuta a través JuncBASE v0.6 [11] como tres conjuntos de análisis independientes. Para el adenocarcinoma de pulmón y muestras de AML, los parámetros JuncBASE utilizados para identificar eventos de splicing alternativo y calcular "empalmado por ciento en" valores (PSI) fueron los siguientes:
-c 2 -j [intrones de Gencode v7
[27]
] -jcn_seq_len 88
. Para los experimentos de células HeLa, los parámetros JuncBASE utilizados fueron los siguientes:
-c 2.5 -j [intrones de Gencode v7
[27]
] -jcn_seq_len 202
. Para el adenocarcinoma de pulmón, Gemelos [29]
de novo ha resultado útil transcripción estaban disponibles para incorporar potencialmente nuevos exones en el análisis de empalme (TCGA,
presentada
). UCSC hg19 knownGenes anotación de transcripción se utiliza para definir anotado exones [30].
Para identificar
U2AF1 servicios asociados S34F-Y /eventos de corte y empalme diferencial en el adenocarcinoma de pulmón y LMA,
compareSampleSets.py
del paquete JuncBASE v0.6 se utiliza con los siguientes parámetros:
-thresh 10 -mt_correction BH -which_test Wilcoxon -delta_thresh 5.0
. eventos de empalme con una diferencia significativa (FDR & lt; 5%) en los valores de PSI entre muestras sin mutación del factor condimentación y muestras con
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S34F /Y mutación se filtraron adicionalmente para eventos con una diferencia en la PSI media mayor que 10%. Para identificar eventos de splicing afectadas por la expresión de
U2AF1
S34F en células HeLa,
pairwise_fishers_test_getASEvents_w_reference.py
se utilizó para comparar la inclusión y la exclusión isoforma leer los recuentos entre el HeLa +
U2AF1 sobre Wild -type biblioteca no inducido secuenciado y HeLa +
U2AF1
inducida por S34F biblioteca secuenciado con los siguientes parámetros:
-thresh 25 -min_dpsi_threshold 5.0 -method BH -sign_cutoff 0.05
. Para identificar eventos de empalme específicos para
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inducción S34F, el evento no podría también ser significativamente diferentes entre los dos controles o cuando se compara el
U2AF1
de tipo salvaje no inducido a
U2AF1
de tipo salvaje induce. Esta última restricción se impuso para distinguir los cambios de empalme debido a la mutación S34F en lugar de la sobreexpresión de
U2AF1
. En algunos casos, como el 'UTR 3 evento de empalme de
CTNNB1
,
U2AF1
inducción de tipo salvaje causó un cambio en el empalme, pero en la dirección opuesta, como
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S34F inducción. Para ser conservadores, consideramos un
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evento afectada por el S34F empalme que tiene cualquier cambio en
U2AF1
inducción de tipo salvaje para ser no específica a la
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mutación ; Sin embargo, hacemos nota en la Tabla 1 de la
CTNNB1
caso de que también mostró un cambio de empalme en
U2AF1
de tipo salvaje de inducción, pero en la dirección opuesta.
En los casos