Extracto
Truncado de mutaciones germinales en el gen supresor de tumores BRCA-1 asociada a la proteína-1 (
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) han sido reportados en familias con predisposición a desarrollar una amplia gama de diferentes tipos de cáncer incluyendo melanoma uveal y el melanoma cutáneo. También ha habido una asociación entre el desarrollo del tumor germinal amelanotic y
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mutación que sugiere una posible característica fenotípica de
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portadores de la mutación. Aunque ha habido muchos tipos de cáncer asociado con la línea germinal
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mutación, el espectro de la asociación con la enfermedad es aún por determinar. Aquí se describe una familia danesa con melanoma uveal predominantemente sino también una variedad de otros tipos de tumores, incluyendo de pulmón, neuroendocrino, el estómago y el cáncer de mama; así como lesiones pigmentadas de la piel. la secuenciación del exoma identificó un
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mutación de empalme situada en c.581-2A & gt; G, lo que conduce a un truncamiento prematuro de
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en un individuo con el melanoma uveal. Esta mutación se realizó por varios otros miembros de la familia con melanoma o varios tipos de cáncer. El hallazgo se expande en el perfil creciente de
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como un importante y uveal gen supresor de tumores de melanoma cutáneo e implica a su implicación en el desarrollo del pulmón y el cáncer de estómago
Visto:. Aoude LG, Wadt K, Bojesen A, Crüger D, Borg Å, Trent JM, et al. (2013) Un
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mutación en una familia danesa predispone a uveal melanoma y otros cánceres. PLoS ONE 8 (8): e72144. doi: 10.1371 /journal.pone.0072144
Editor: Soheil S. Dadras, Universidad de Connecticut Health Center, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Febrero, 2013; Aceptado: July 5, 2013; Publicado: 19 Agosto, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Alianza de Investigación del melanoma, cáncer de la Sociedad Sueca, el Consejo Sueco de Investigación, la Fundación Berta Kamprad, el Nacional de Salud y el Consejo de Investigación médica (NHMRC) de Australia, y la lucha por la vista, Dinamarca. HNC y LGA reciben apoyo salarial a través de un NHMRC Senior Principal beca de investigación y ANZ Ph.D. beca, respectivamente. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
BRCA-1 asociada a la proteína-1 (
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) es un gen supresor de tumor localizado en el cromosoma 3, una región que se ha relacionado con melanoma uveal (UMM). En el primer informe para establecer una relación entre
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se encontró que era el único gen que fue mutado en el cromosoma 3 en cada una de estas muestras y ambas mutaciones dirigidas al truncamiento de la proteína. Ellos junto interrogados 57 tumores UMM utilizando secuenciación de Sanger y encontraron que
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mutaciones ocurrieron predominantemente en los tumores que habían sufrido metástasis. En general, 26/31 de los tumores que producen metástasis (alto riesgo) habían inactivar
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mutaciones somáticas en comparación con sólo 1/26 del grupo de bajo riesgo (no metastásico). Para las 20 muestras con una muestra de ADN normal correspondiente, casi todos los
No se encontraron mutaciones BAP1
ser adquirida somáticamente, con la excepción de un solo caso con una mutación del marco de la línea germinal a juego. Esta mutación se introdujo la posibilidad de que
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defectos podrían predisponer a la UMM. Que conduce desde el estudio de Harbour et. al., varios grupos han estudiado el riesgo de enfermedad conferida por la línea germinal
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mutación. Testa y sus colegas investigaron
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mutaciones en dos familias estadounidenses que se presentan con mesotelioma y que no tenían contacto con cualquiera de los factores de riesgo ambientales conocidos para esta enfermedad [2]. Ellos encontraron dos mutaciones diferentes del marco de lectura en
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responsable del elevado riesgo de mesotelioma en estos individuos. Curiosamente, estas familias también presentan con una variedad de cánceres que incluyen UMM y melanoma cutáneo (CMM). Un segundo estudio también apoyó estos resultados interrogando ADN germinal de una familia que presenta con mesotelioma, meningioma y UMM [3]. En esta familia una mutación sin sentido provocó el truncamiento prematuro de la proteína BAP1 en los portadores. Un informe de Wiesner mostró
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mutaciones en dos familias que tenían un síndrome autosómico dominante caracterizado por la UMM, CMM y nevus melanocíticos benignos atípicos [4]. Las dos familias que se presentan con mutaciones de cambio únicas que co-segregados con el fenotipo de la enfermedad. En un informe de seguimiento, Wiesner y sus colegas identificaron una tercera familia con un
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mutación que co-segregados con mesotelioma y también mostraron evidencia de una lesión melanocítico en un portador de la mutación [5]. Otros grupos también han descrito
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mutaciones en individuos que presentan tumores intradérmicas atípicos, que proponen que estas lesiones pueden ser una característica fenotípica de
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portadores de la mutación [6], [7]. Un estudio reciente de los hermanos portugueses con un subtipo raro de mesotelioma epitelioide descubrió una línea germinal
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mutación como la posible causa de la agrupación familiar sólo se conoce de mesotelioma papilar bien diferenciado. Cabe destacar que uno de los hermanos también desarrollaron UMM [8]. Recientemente una mutación de empalme críptico en
fue encontrado BAP1
para co-segregar en una familia danesa con UMM, paraganglioma y atípico CMM [9].
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mutación también se ha implicado en el desarrollo del carcinoma de células renales y algunos de los familiares de estos casos han tenido UMM o CMM también [10]. Como se desprende de la literatura, existe un espectro de tumores de gran tamaño que parece acompañar a
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mutación germinal.
En este trabajo se informe de una familia danesa predispuestos a desarrollar UMM predominantemente, aunque presenta también con una amplia gama de tumores aparentemente no relacionados. Hay 7 miembros de la familia que han tenido UMM, con la edad más temprana de inicio siendo 20. Una UMM desarrollado a la edad de 30 y más tarde pasó a desarrollar cáncer de mama a los 45 años hay un individuo con cáncer de pulmón que tenía dos hijos que desarrollaron melanoma, uno UMM y el otro CMM. Otro individuo desarrollado UMM a la edad de 69 y tiene dos niños que fueron diagnosticados con UMM a las edades de 27 y 41. Hay un solo caso de la infiltración difusa cáncer gástrico y este individuo también tenía un niño con UMM, diagnosticado a los 57 años Por último , un caso más de UMM fue diagnosticado a los 56 años Consulte la Figura 1 para un árbol genealógico de la familia que identifica el cáncer de la historia de cada individuo.
en los individuos que tienen pedigrí melanoma uveal (UMM) están representados por círculos negros (hembra) o cajas (hombres) y las personas con melanoma cutáneo (MMC) se indican con círculos grises o cajas. La edad de diagnóstico de cada uno de melanoma se indica entre paréntesis. Una línea a través de un símbolo indica que la persona ha fallecido. Si una persona lleva el
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mutación de empalme que se indica con una "M" y si son de tipo salvaje para esta variante se indica con una "WT". Cuando el estado de la mutación se indica entre paréntesis, la persona es un portador obligado presunta, '(M)'. Otros tipos de cáncer también se indican en el árbol genealógico con la edad de diagnóstico entre paréntesis. Los asteriscos indican los dos individuos que se secuenciaron exoma. Los hermanos no afectados se representan por medio de diamantes, con el número en el centro indica el número de personas.
Aparte de la incidencia de cáncer sorprendente, esta familia presenta con otras características clínicas que se han convertido indicaciones de
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mutación. Cuatro de los cinco individuos con UMM murieron de metástasis de hígado derivado de la UMM. Persona III: 6, que fue diagnosticado con UMM a los 20 años, tenía un iris aislado melanoma y más tarde desarrolló tres carcinomas de células basales. En la actualidad es de 61 años de edad y bien. Persona III: 8, con CMM diagnosticado a los 35 tenía un tumor localizado en la región occipital, que lo más probable era una MMC primaria, pero su localización no se puede excluir. Murió a los 39 años de edad con CMM diseminada.
Métodos
Declaración de Ética
Ética aprobación de este proyecto fue concedida por los Comités de Ética de la Investigación Humana del Instituto Queensland de Investigación médica y la Universidad de Lund. Se obtuvo el consentimiento por escrito para cada individuo.
Muestras
Se recogió sangre completa de la enfermedad en los individuos afectados densos familias melanoma uveal. ADN genómico fue extraído por medio de métodos estándar. Las muestras de ADN se utilizaron luego para exoma y secuenciación de Sanger experimentos.
Whole-Exoma Secuenciación
Con el fin de encontrar variantes asociada a la enfermedad, la secuenciación del exoma se llevó a cabo en individuos clave representante de la la carga tumoral en esta familia. Se seleccionaron y secuenciación se llevó a cabo utilizando un Illumina HiSeq 2000 y un kit de iluminación Exoma Enriquecimiento TruSeq dos casos UMM que eran tres meioses separados (17, Figura 1 III:: 14 y III). Las lecturas que se generaron fueron asignadas para hacer referencia genoma UCSC hg19 usando el algoritmo de alineamiento BWA [11]. entonces SAMTOOLS se utilizó para detectar los SNPs y indeles [12]. Este proceso genera grandes volúmenes de datos y con el fin de esculpir la larga lista de variantes resultantes en un panel manejable de variantes varios criterios de filtrado se aplican al conjunto de datos. En primer lugar, las variantes que se veían en dbSNP (build 132) o reportados por el Proyecto 1000 Genomas (febrero de 2012) se separaron por filtración, dejando solamente nuevas variantes para su consideración. En segundo lugar, se eliminaron cambios sinónimos, dejando sólo las variantes de proteínas que alteran. Un punto de corte de 40 y luego se aplicó a la puntuación de calidad devuelto para cada variante con el fin de limitar la tasa de falsos positivos entre los llamados variantes. Un 20% de corte también se aplicó a la cantidad de alternativa lee, es decir, si una variante no tenía un porcentaje lo suficientemente alto de lecturas para el alelo alternativo entonces se retiró de la consideración. Lo que quedó después de este proceso de filtrado 140 eran nuevas variantes para el individuo III: 14 y 145 nuevas variantes para el individuo III: 17. exoma datos de estos individuos pueden ponerse a disposición con fines de investigación a petición de los autores.
Exoma-secuenciación reveló una
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mutación de empalme, lo que da como resultado el truncamiento prematuro de la proteína, en uno (III: 17) de los dos individuos y fue visto como un candidato probable responsable de UMM susceptibilidad debido a la literatura de apoyo. El resultado se verificó en el individuo mediante secuenciación de Sanger (consulte la Figura 2). Después de esto, el análisis de co-segregación se llevó a cabo para determinar lo bien que la variante segregó con la enfermedad en la familia y de si estaba presente en individuos con diferentes tipos de cáncer. Cada muestra de ADN de sangre disponible de esta familia se proyectó para la variante. Para individuo II: 11 Se obtuvo el ADN de tejido tumoral. Además, una nueva muestra de sangre se obtiene de los individuos III: 14 ya que la muestra inicial no mostró presencia de una línea germinal
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mutación. La segunda muestra de sangre se proyectó para la mutación específica en
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mediante secuenciación de Sanger.
(A) El panel izquierdo muestra el cromatograma de tipo salvaje, mientras que el panel de la derecha muestra el de la
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mutación de empalme. (B) de tipo salvaje secuencias de nucleótidos y aminoácidos se muestran en el panel superior, mientras que el panel inferior muestra parte de la proteína truncada BAP1 resultante de la pérdida del exón 8.
RT-PCR
RT-PCR se realizó en cDNA de un soporte (III: 6) para verificar que el
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mutación era de hecho una variante de empalme. El ARN se convirtió en ADNc usando Superscript II (Life Technologies) y los cebadores que flanquean los exones afectados por el sitio de empalme putativo fueron diseñados. Posteriormente, los productos PCR se corrieron en un gel de acrilamida (véase la figura 3).
Desde la izquierda, el primer carril muestra un marcador de tamaño, los próximos dos calles se puede apreciar tipo salvaje
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RT -PCR productos, y los dos últimos carriles muestran el producto de manera aberrante empalmado resultante de la c.581-2A & gt;. G mutación
de casos y controles Genotipado
Para comprender más plenamente el papel que esta variante podría desempeñar en el riesgo de melanoma una muestra de casos y controles de Australia se genotipo para esta nueva variante. A Sequenom IPLEX se ha ejecutado en 1655 probandos afectados de familias que tenían ya sea CMM, UMM o una combinación de ambos, y 1596 controles. El conjunto de muestras incluyó un amplio sector de los casos con variadas historias de melanoma. Algunos de los probandos son de familias de melanoma densos, mientras que otros son casos esporádicos. Esta cohorte se incluyen los casos con un amplio espectro de edades de inicio, que van desde la enfermedad de la infancia a finales del melanoma inicio.
Resultados
Whole-exoma secuenciación identificó un
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mutación de empalme (c.581-2A & gt; G) en un individuo con UMM de una familia danesa predispuestos a desarrollar UMM, así como una serie de otros tipos de cáncer. co-análisis de la segregación mostró que tres de los cuatro casos UMM con ADN disponible para fines de investigación eran portadores de esta mutación, lo que provoca el truncamiento prematuro de
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. Además, había otros cuatro individuos con diferentes tipos de cáncer que también tenían la mutación. Estos tipos de cáncer eran CMM, cáncer de pulmón y cáncer de estómago. Para confirmar ese individuo III: 14 era de tipo salvaje para el
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mutación se proyectará una muestra de sangre recién obtenida. De hecho, el análisis confirmó la ausencia de
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mutación lo que sugiere que este caso es un phenocopy. La pérdida de heterocigosidad (LOH) del
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mutación también se observó en el ADN de tejido tumoral de II.
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De acuerdo con los datos del Proyecto 1000 Genomas, genotipo resultados mostraron que esta variante sólo estaba presente en la familia actual, es decir sólo 1/1655 probandos de melanoma llevan la variante y 0/1596 controles. Los datos del Proyecto de Secuenciación del NHLBI GO Exoma (ESP) también refleja este hallazgo ya que esta variante de empalme no se encuentra en ninguno de los 6500 individuos secuenciados de los EE.UU. [13]. También se examinaron los datos exoma de 200 controles sanos daneses para
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mutación y no altera la variante de la proteína se observó [14]. Esto sugiere que los individuos descritos aquí más probable es que llevan una mutación "privado" a esta familia.
Discusión
Ha habido varios tipos de cáncer asociados con
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mutaciones en la línea germinal, pero el espectro completo de la susceptibilidad del tumor está aún por determinar. Presentamos aquí una familia danesa con UMM y lesiones pigmentadas de la piel, así como los cánceres de pulmón, neuroendocrinos, de estómago, y de mama. la secuenciación del exoma de un caso UMM identificó un
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de empalme mutación (c.581-2A & gt; G), que conduce al truncamiento prematuro de
BAP1
. Esta aberración del marco de lectura es consistente con mutaciones de línea germinal publicada visto en otras familias con predisposición a la UMM. En consonancia con otros de la línea germinal escandinava
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portadores, también se observa una menor edad en el diagnóstico de la UMM (Tabla 1). En el presente y las familias escandinavas previamente publicados, la edad media al diagnóstico de la UMM fue de 42 años para los nueve individuos afectados, en comparación con 53 años para los transportistas UMM en familias no escandinavos (Tabla 1 y sus referencias). Esto se compara con una edad media de diagnóstico para la UMM de entre 58-62 años en los casos esporádicos basados en la población en los países escandinavos [15] y los Estados Unidos [16]. El papel de
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como un gen supresor de tumor fue apoyado además por LOH del alelo de tipo salvaje en el tejido tumoral UMM de II: 11. El tipo salvaje individuo que se ve afectado con UMM muestra que en las familias densos es posible observar phenocopies incluso con un tipo de tumor tan raro como UMM. Los datos de la secuencia del exoma de la persona con la UMM y de tipo salvaje
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no reveló mutaciones en otros genes de predisposición al cáncer conocidos.
En resumen, este hallazgo se expande en el perfil creciente de
BAP1
como un importante y uveal melanoma gen supresor cutánea. La familia se describe aquí también tenía una variedad de otros tipos de cáncer, algunos de los cuales han sido implicados con
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mutación (pulmón) y algunos que no tiene (estómago, neuroendocrino). Para evaluar la posible implicación de
Hoteles en BAP1 predisposición a estos tipos de cáncer no melanoma y para comprender mejor el espectro de la enfermedad asociada a este tipo de mutaciones, se requieren grandes estudios poblacionales.
Apoyo información
Métodos S1. La adición de información
en la secuenciación del exoma, secuenciación de Sanger y métodos Sequenom IPLEX
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072144.s001 gratis (DOCX)
Reconocimientos
agradecemos a los miembros de la familia por su participación en este estudio.