Extracto
El cáncer esofágico es uno de los cánceres más comunes, y la tasa de supervivencia a 5 años es inferior al 10%, debido a la falta de agentes terapéuticos efectivos. Este estudio fue evaluar la actividad antitumoral de Ec-LDP-Hr-AE, una proteína de fusión biespecífica enediyne desactivado desarrollado recientemente dirigida tanto epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR) y factor de crecimiento epidérmico receptor 2 (HER2), sobre el cáncer de esófago. La proteína de fusión Ec-LDP-Hr-AE consta de dos ligandos de oligopéptido y un lidamycin antibióticos enediyne (LDM) para la unión al receptor y la muerte celular, respectivamente. El presente estudio demostró que Ec-LDP-Hr tenía una alta afinidad para unirse a un carcinoma esofágico de células escamosas (CECA) las células, y la proteína de fusión enediyne-energizado Ec-LDP-Hr-AE mostró una potente citotoxicidad para células CECA con expresión diferencial de EGFR y HER2. Ec-LDP-Hr-AE podría causar un paro significativo G2-M en EC9706 y KYSE150 células, y también indujo apoptosis en las células CECA de una manera dosis-dependiente. ensayos de Western blot mostraron que Ec-LDP-Hr-AE promovió la caspasa-3 y caspasa-7 actividades, así como la escisión de PARP. Por otra parte, Ec-LDP-Hr-AE inhibió la proliferación celular a través de la disminución de la fosforilación de EGFR y HER2, y ejerció una inhibición adicional de la activación de sus moléculas de señalización aguas abajo.
In vivo
, a una dosis tolerada, Ec-LDP-Hr-AE inhibió el crecimiento del tumor en un 88% cuando se administró a ratones desnudos portadores de células CECA humana KYSE150 xenoinjertos. Estos resultados indicaron que Ec-LDP-Hr-AE exhibió eficacia anti-Caner potente sobre la CECA, lo que sugiere que podría ser un candidato prometedor para la terapia dirigida de cáncer de esófago
Visto:. Guo XF, Zhu XF, Yang WC , Zhang SH, Zhen YS (2014) Un EGFR /HER2-biespecíficos y proteína enediyne-energizada Fusión Muestra alta eficacia contra el cáncer de esófago. PLoS ONE 9 (3): e92986. doi: 10.1371 /journal.pone.0092986
Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Noviembre 2013; Aceptado: 27 Febrero 2014; Publicado: 24 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado en parte por el Proyecto de Investigación de Ciencias Naturales del Departamento de la provincia de Henan, China (Nº 12B350004 a XFG), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81202447 de XFG, http://www.nsfc.gov Educación. cn /Portal0 /default152.htm), y una beca de la USCACA (núm USCACA-TIGM-001 a EJT). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer esofágico es uno de los cánceres más comunes, así como la sexta causa más común de muerte por cáncer en el mundo. Las regiones del norte de Henan en la provincia China tienen la mayor incidencia de cáncer de esófago, particularmente el carcinoma de células escamosas de esófago (CECA) [1], [2]. Aunque muchas opciones de tratamiento están disponibles, incluyendo la cirugía, las estrategias de modalidad combinada, como la quimioterapia antes o después de la operación con o sin radiación, y quimiorradioterapia definitiva, el pronóstico de cáncer de esófago es pobre, con una tasa de supervivencia a 5 años inferior al 10% [3] - [5]. Debido a las desventajas de los agentes de quimioterapia, tales como graves efectos secundarios tóxicos, la alta incidencia de resistencia a las drogas, y pequeños efectos sobre la supervivencia, hay una necesidad urgente para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos eficaces, dirigidos a anormalidades moleculares específicos en esofágico . carcinomas, en especial los del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER) la familia [6]
la familia HER de receptores tirosina quinasa contiene cuatro miembros: HER1 /EGFR, HER2 /neu, HER3 y HER4. La unión del ligando a los receptores da como resultado la dimerización del receptor, a continuación, inicia una serie de eventos intracelulares que eventualmente promueven el crecimiento celular, la proliferación, la diferenciación y la migración [7]. La sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2 (HER2) se ha observado en muchos cánceres humanos, tales como de pulmón, cabeza y cuello, mama, ovario, y que se ha demostrado que desempeñan papeles importantes en tanto la formación y la progresión de muchos tipos de cáncer que ocurren comúnmente [8]. En el cáncer de esófago, la sobreexpresión de EGFR se produce en el 30% -90% [9], [10], y HER2 sobreexpresión rangos del 19% -43% [11]. Además, se observó la sobreexpresión de EGFR y HER2 en 18% -25% de los pacientes con cáncer de esófago [12], [13]. Por lo tanto, un agente de dirección tanto EGFR y HER2 exhibiría efectos terapéuticos más eficaces en pacientes con cáncer de esófago.
Ec-LDP-Hr-AE, una proteína de fusión biespecífica que consta de dos oligopéptidos (CE, 22 aminoácidos de EGF y Hr, región CDR3 de VH de anticuerpo anti-HER2 C6.5) específico para EGFR y HER2, y un lidamycin antibióticos enediyne (LDM), se construyó y se informó en nuestro estudio anterior [14]. Se mostró potente citotoxicidad a una variedad de células de carcinoma de
in vitro
, y fue muy eficaz en la inhibición del crecimiento de Caner ovárico humano SK-OV-3 xenoinjertos
in vivo
. Sin embargo, la eficacia antitumoral de Ec-LDP-Hr-AE sobre el cáncer de esófago no está bien estudiado. En este estudio, no sólo mide la afinidad de unión de la proteína de fusión Ec-LDP-Hr a las células esofágicas Caner, sino también evaluó la potencia de la fusión con energía las proteínas
in vitro
y
in vivo
. También se analizaron los efectos de la Ec-LDP-Hr-AE sobre la distribución del ciclo celular y la apoptosis. Para dilucidar los mecanismos implicados en la citotoxicidad y la inducción de la apoptosis de Ec-LDP-Hr-AE, la expresión de moléculas relacionadas con la apoptosis y moléculas clave en las vías de señalización HER se analizaron también.
Materiales y Métodos
Ética declaración
hembra Balb /c ratones nude (6-8 semanas) utilizados en los experimentos fueron adquiridos por el Instituto de Ciencias de laboratorio de animales, de la Academia china de Ciencias médicas, y alojado en virtud de patógenos específicos -free condiciones. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética Experimentación Animal del Instituto de Biotecnología medicinal, de la Academia China de Ciencias Médicas.
Líneas celulares y cultivo
esófago humano líneas celulares de carcinoma EC1, ECa109, y EC9706 KYSE150 y la línea celular de fibroblastos de ratón NIH 3T3 se obtuvieron de Cell Center de Peking Union Medical College, china, y se cultivaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% ( FBS, Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.), 2 mmol /L glutamina, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina.
Reactivos y anticuerpos
(3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difenil-ltetrazolium (MTT), isotiocianato de fluoresceína (FITC) y isopropílico-β-D-thiogalactopranoside (IPTG) fueron adquiridos de Sigma Chemical Inc. Aldrench (St. Louis, MO, EE.UU.). Todos los anticuerpos que incluyen fosforilada-HER2, -EGFR, -AKT, -extracellular proteína quinasa regulada (ERK), -p38 activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK), -c-Jun N-terminal quinasa ( JNK) y anticuerpos monoclonales anti-EGFR, -HER2, -AKT, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -caspase 3, 7 -caspase, anticuerpos PARP -cleaved se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.). Los anticuerpos anti-β-actina fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Peroxidasa de rábano (HRP) conjugado de cabra anti-conejo /anticuerpos de ratón también se adquirieron de por Cell Signaling Technology.
Preparación de proteínas de fusión energizadas
La preparación de proteína de fusión biespecífica Ec-LDP- Hr-AE y sus proteínas de fusión correspondiente monoespecíficas Ec-LDP-AE y LDP-hr-AE se describieron en nuestro estudio anterior [14]. En pocas palabras, los fragmentos de ADN que codifican Ec-LDP-Hr, Ec-PLD y LDP-Hr se obtuvieron mediante técnicas de clonación por PCR y ADN, y luego se insertaron en vectores pET30a para generar los plásmidos de expresión pET
Ec-LDP- hr
, pET
Ec-LDP Opiniones y pET
LDP-hr
. Estos plásmidos se transforman en
las proteínas de fusión Escherichia coli BL21
(
DE3
), y se expresaron mediante la adición de IPTG. Las proteínas de fusión se extrajeron del espacio periplásmico de
E. coli fotos: por el método del choque osmótico (manual del sistema pET, 9
ª edición, Novagen) y se purificaron por cromatografía de afinidad (columna HisTrap HP, GE Healthcare) . Las proteínas de fusión con energía Ec-LDP-Hr-AE, EC-LDP-AE y LDP-Hr-AE se construyeron mediante la integración del cromóforo activo enediyne (AE) de lidamycin en la CE-LDP-Hr, Ec-PLD y LDP- proteínas h, respectivamente.
la afinidad de unión de ensayo
a ensayo de inmunofluorescencia basado en citometría de flujo se utilizó para medir la afinidad de unión de la proteína de fusión Ec-LDP-Hr a las células de cáncer de esófago [15] . La proteína Ec-LDP-HR fue marcado con FITC durante 16 h en una solución tampón de carbonato (100 mmol /L de bicarbonato sódico
3, 10 mmol /L de Na
2CO
3, pH 9,0) a 4 ° C . proteína marcada se separó del no unido FITC mediante el uso de una columna Sephadex G-25 (GE Healthcare). A continuación, la proteína Ec-LDP-Hr marcado con FITC se incubó con 10
6 EC9706 células, KYSE150 células o células NIH 3T3 en un volumen de 100 l de tampón (PBS + 2% de FBS) durante 2 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados con 500 l de tampón, las células se analizaron con citómetro de flujo (BD Company). Los datos se analizaron con el software Prism 5 (GraphPad Software).
MTT ensayo
Las células se separaron mediante tripsinización y se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano, se cultivaron durante 24 h antes de la exposición a varias concentraciones de LDM, Ec-LDP-Hr-AE, EC-LDP-AE o LDP-HR-AE durante 48 h. Se añadió solución de MTT (5 mg /ml, 20 l) a cada pocillo y se incubó durante otras 4 horas a 37 ° C. El sobrenadante se retiró y 150 l de DMSO se añadió a cada pocillo. La absorbancia a 570 nm se midió utilizando un instrumento Multiskan Spectrum (Thermo Labsystems, Rochford, IL, EE.UU.). Los valores de absorbancia se expresaron como un porcentaje de la de las células no tratadas, y las concentraciones de agentes probados resulta en la inhibición del crecimiento del 50% (IC
50) se calcularon.
análisis de la distribución del ciclo celular
Los efectos de la proteína de fusión biespecífica Ec-LDP-Hr-AE sobre el ciclo celular se evaluó mediante tinción con yoduro de propidio (PI). Después del tratamiento con 0,1 nmol /L, 0,5 nmol /L y 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-AE de 48 h, EC9706 y KYSE150 células fueron digeridos por la tripsina-EDTA y se lavó con PBS. Las células se resuspendieron en 500 l de PBS con 50 mg /ml PI y 100 mg /ml de RNasa A. Después de la incubación a 37 ° C durante 30 min, las células se analizaron para la fluorescencia con un citómetro de flujo (BD Company).
apoptosis de las células de ensayo
Los efectos de la proteína de fusión biespecífica Ec-LDP-Hr-AE en la inducción de la apoptosis en las células CECA se midieron mediante el uso de la tinción de Hoechst y Anexina V-FITC /PI tinción. Para la tinción de Hoechst, KYSE150 células se cultivaron en cubreobjetos y se incubaron durante 24 h, después se añadieron 0,1 nmol /L, 0,5 nmol /L y 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-AE y se incubó durante otras 48 h. Las células en cubreobjetos se fijaron con metanol, se lavaron con PBS, y se tiñeron por 1 mg /ml de Hoechst 33342 para 15 min. Se observaron las imágenes en un microscopio de fluorescencia (Nikon TE 2000 u). Para Anexina V-FITC /PI tinción, las células apoptóticas se midieron por un V-FITC kit anexina /PI tinción (tecnología Biosea). Después de 0,1 nmol /L, 0,5 nmol /L y 1 nmol /L de tratamiento Ec-LDP-Hr-AE durante 48 h, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS, y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 500 l de tampón que contiene de 10 l PI Anexina V-FITC y 5 l de unión, se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min, y luego se analizaron para la fluorescencia con un citómetro de flujo (BD Company).
Western blot análisis
Las células se lisaron durante 30 min en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) contenía varios inhibidores de la proteasa (por ejemplo, 1 mg /ml de aprotinina, 10 mg /ml de leupeptina, 1 mmol /L fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 2 mmol /L Navo
4, y 50 mmol /L de NaF). Proteína extraída de las células se cuantificó utilizando el kit de ácido bicinconínico (Pierce Biochemicals), y 30 g de cada uno de proteína total se aplicaron de 10% SDS-PAGE y luego a electrotransferencia sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore). Las membranas se incubaron con 1% de BSA durante 2 h a temperatura ambiente antes de la incubación durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (diluido con tampón de TBST 1:1000, Cell Signaling Technology). A continuación, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (dilución 1:5000; Cell Signaling Technology) para 1 h después de lavar tres veces con tampón TBST. Las bandas específicas se visualizaron con el kit de Immobilon occidental quimioluminiscente de HRP Sustrato (Millipore) y capturados por ChemiImager sistema de proyección de imagen 5500 (Alpha Innotech Corp.).
En vivo
ensayo de eficacia
en vivo
eficacia de las proteínas de fusión energizadas se evaluó en un modelo de ratón desnudo KYSE150 xenoinjertos. 1 × 10
7 KYSE150 células suspendidas en 200 l de PBS fueron inoculados por vía subcutánea en la axila derecha de ratones desnudos. Después de 3 semanas, se tomaron los tumores a partir de ratones desnudos y se diseccionaron asépticamente en la solución salina estéril. Las piezas de tejido del tumor (2 mm
3 de tamaño) A continuación, se transplantaron en la axila derecha de ratones desnudos por un trocar, y la herida se cerró herméticamente por colodión. los ratones portadores del tumor se dividieron al azar en 3 grupos (n = 7) cuando el tamaño del tumor fue de más de 100 mm
3 (aproximadamente 10 días después). i.v. Lidamycin se inyectaron (0,05 mg /kg) y la proteína de fusión biespecífica Ec-LDP-Hr-AE (0,3 mg /kg) en la vena de la cola y dada en un volumen de 200 l de PBS en el día 11 y el día 21, respectivamente. El grupo de control de ratones recibió 200 l tratamiento PBS al mismo tiempo como proteínas de fusión. El tamaño del tumor se midió cada 3 días y el volumen del tumor se determinó por la longitud x anchura
2/2. Las tasas de inhibición fueron calculados por 1 -. Volumen del tumor (tratado) /volumen tumoral (control) x 100%
El análisis estadístico
Los resultados de los datos cuantitativos de este estudio se presentan como la media ± DAKOTA DEL SUR. Las diferencias entre grupos se analizaron estadísticamente mediante la prueba t no pareada de dos colas, y los valores de p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativas
Resultados
Preparación de las proteínas de fusión energizadas
de acuerdo con nuestro enfoque anterior, los genes que codifican las proteínas de fusión Ec-LDP-HR, Ec-LDP, y LDP-HR se construyeron y las proteínas codificadas se expresaron en el espacio periplásmico de
E. coli
. Las proteínas de fusión se purificaron por Ni
2 + cromatografía de afinidad y la pureza de las proteínas de fusión fue por todo el 90% como se determina por SDS-PAGE y rendimiento-líquido-cromatografía de alta resolución (HPLC). El cromóforo enediyne activa (AE) de LDM y tres proteínas de fusión se reconstituyeron
in vitro
para generar las proteínas de fusión energizadas Ec-LDP-Hr-AE, EC-LDP-AE y LDP-Hr-AE. Los resultados de HPLC de fase inversa mostraron que tres proteínas de fusión energizadas se ensamblaron con éxito.
afinidad de la proteína Ec-LDP-Hr a las células de cáncer de esófago
células
EC9706, KYSE150 células NIH 3T3 y Encuadernación las células se incubaron con varias concentraciones de marcado con FITC Ec-LDP-Hr, y las intensidades de fluorescencia se midieron por citómetro de flujo. Las intensidades de fluorescencia media (IFM) de las células EC9706 y KYSE150 células tanto aumentó significativamente (P & lt; 0,05), lo que indica Ec-LDP-Hr tenían fuerte actividad de unión a las células de cáncer de esófago (Fig 1A, 1C). Sin embargo, las IMF de células NIH 3T3 no mostraron aumento significativo, lo que significaba Ec-LDP-Hr era incapaz de unirse al EGFR y células NIH 3T3 HER2 negativo (Figura 1E). De acuerdo con la Ec las concentraciones-LDP-HR IMF y, la afinidad de unión (K
d) Los valores se calcularon con el software Prism 5. El K
d valores de Ec-LDP-Hr unidos a EC9706 y KYSE150 células fueron 5.283 mol /L y 3,562 mol /L, respectivamente (fig. 1B, 1D).
EC9706 células (A) , KYSE150 células (C) o células NIH 3T3 (e) se incubaron con la proteína Ec-LDP-Hr marcado con FITC a las concentraciones indicadas, y las intensidades de fluorescencia media (IFM) se analizaron por citometría de flujo. Aumento de las concentraciones de las proteínas Ec-LDP-HR marcados con FITC se incubaron con células EC9706 (B) o KYSE150 células (D). Después de FACS, las IMF se representaron frente a las concentraciones de proteína.
citotoxicidad de las proteínas de fusión energizadas
in vitro
La citotoxicidad de la proteína de fusión biespecífica energizado Ec-LDP- Hr-AE se llevó a cabo en cuatro líneas celulares humanas de carcinoma de células escamosas de esófago (CECA) que expresan diferentes niveles de EGFR y HER2 y EGFR /HER2 negativos células NIH 3T3 mediante el uso de ensayos de MTT (Fig. 2A). LDM y proteínas de fusión monoespecíficos energizado Ec-LDP-AE y LDP-Hr-AE se ensayaron también para la comparación. Como se muestra en la Fig. 2B, la proteína de fusión biespecífica energizado Ec-LDP-Hr-AE mató tanto a las células CECA y células NIH 3T3 con potencia muy alta. El IC valores
50 de Ec-LDP-Hr-AE para 4 células CECA estaban por debajo del 10
nivel de -10 mol /L (Fig. 2C). Sin embargo, la proteína Ec-LDP-Hr-AE biespecífico no siempre era más potente que los homólogos monoespecíficos y LDM. Los resultados de los análisis estadísticos revelaron que las diferencias en CI
50 valores de LDM, Ec-LDP-Hr-AE, EC-LDP-AE y LDP-Hr-AE para EC-1, ECa109 y EC9706 células no fueron estadísticamente significativas . Pero las diferencias en IC
50 valores para KYSE150 células fueron significativas (P & lt; 0,05). Por otra parte, IC
50 valor de Ec-LDP-Hr-AE para las células NIH 3T3 no mostraron diferencias significativas en comparación con las cuatro celdas CECA.
(A) La expresión de EGFR y HER2 en diferentes esofágico las células cancerosas y las células NIH 3T3 se analizaron por Western blot. (B) La muerte celular efectos de la Ec-LDP-Hr-AE en líneas celulares de cáncer de esófago KYSE150, EC9706, ECa109 y EC-1 y la línea celular de fibroblastos de ratón NIH 3T3 fueron probados por ensayos de MTT. Las células se expusieron a diversas concentraciones de Ec-LDP-Hr-AE para 48 h y los resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes. (C) El IC
50 valores de lidamycin (LDM), Ec-LDP-Hr-AE, EC-LDP-AE, y LDP-Hr-AE contra 4 tipos de células de cáncer de esófago y células NIH 3T3 se midieron por ensayo de MTT. Columnas, con una media de tres experimentos, bares, SD.
Efectos de la proteína de fusión biespecífica Ec-LDP-Hr-AE sobre la distribución del ciclo celular
EC9706 y KYSE150 células fueron expuestas a 0,1 , 0.5 y 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE durante 48 h, y la distribución del ciclo celular se evaluó mediante tinción con PI y citometría de flujo análisis. Las células de control (EC9706 y KYSE150) distribuidos en la fase G2-M fueron 10,51% ± 0,98% y 6,26% ± 1,96%, respectivamente, mientras que las células tratadas con 0,1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE distribuidos en la fase G2-M fueron 86.00% ± 0.98% y 89.36% ± 0.71%, respectivamente. Estos datos indicaron que una detención significativa G2-M fue causado por el tratamiento Ec-LDP-Hr-AE (Fig. 3). Aunque hubo un gran cambio (alrededor de 12,84% ~31.53% de incremento) en la fase G2-M después de la exposición a 0,5 nmol /L y 1 nmol /l de Ec-LDP-Hr-AE, las células distribuidas en la fase G2-M eran menor que la de tratado con 0,1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE, que indica las células en fase G2-M alcanzó el pico con 0,1 nmol /L de tratamiento Ec-LDP-Hr-AE (Fig. 3).
EC9706 células o KYSE150 células fueron expuestas a Ec-LDP-Hr-AE durante 48 horas a las concentraciones indicadas y la distribución del ciclo celular se determinó por citometría de flujo después de tinción PI. Columnas, con una media de tres experimentos, bares, SD.
Efectos de la proteína de fusión biespecífica Ec-LDP-Hr-AE sobre la apoptosis
Los resultados de la tinción de Hoechst 33342 y Anexina V- Los ensayos /PI tinción con FITC revelaron que las células apoptóticas (EC9706 y KYSE150) aumentó notablemente en una forma dependiente de la dosis después del tratamiento con Ec-LDP-Hr-AE. La tinción Hoechst 33342 se utilizó para detectar los cambios en la morfología nuclear. Los núcleos de las células no tratadas fueron normales en apariencia y exhibió difunden tinción de la cromatina. Después de la exposición a diferentes concentraciones de Ec-LDP-Hr-AE durante 48 h, KYSE150 células presentan cambios morfológicos típicos de la apoptosis tales como la condensación de cromatina o un núcleo encogido (Fig. 4A). Como se muestra en la Fig. 4B, las proporciones de células EC9706 apoptóticas después del tratamiento con 0,1, 0,5 y 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE eran 15,06% ± 0,29%, 38,10% ± 0,64% y 50,00% ± 0,39%, respectivamente, lo que mostró significativa aumenta en comparación con células de control (P & lt; 0,01). Las células apoptóticas también aumentaron mucho por las células KYSE150 después de la exposición a 0,1, 0,5 y 1 nmol /l de Ec-LDP-Hr-AE, con las relaciones de la apoptosis de 16.29% ± 0.35%, 21.54% ± 0.51% y 32.99% ± 0,38%, respectivamente (P & lt; 0,01 versus control, Fig 4C.). Además, Ec-LDP-Hr-AE indujo apoptosis en EGFR /células HER2 negativos NIH 3T3, y las proporciones de células apoptóticas después del tratamiento con 0,1, 0,5 y 1 nmol /l de Ec-LDP-Hr-AE fueron 16,47% ± 0,44%, 15,28% ± 0,45% y 19,90% ± 0,12%, respectivamente. Las células NIH 3T3 apoptóticas fueron significativamente menor que la de EC9706 células y KYSE150 células a las dosis de exposición de 0,5 nmol /L y 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE (P & lt;. 0.05, Fig 4D).
(a) KYSE150 células se trataron por Ec-LDP-Hr-AE a las concentraciones indicadas durante 48 h, y luego se tiñeron por Hoechst 33342. se observaron las imágenes en un microscopio de fluorescencia a 200 ×. EC9706 células (B), KYSE150 células (C) o células NIH 3T3 (D) fueron expuestos a las concentraciones indicadas de Ec-LDP-Hr-AE durante 48 h. Se recogieron las células y se tiñeron con una combinación de FITC-anexina V y PI. Los cuadrantes izquierdos inferiores (FITC
- /PI
-) indicaron que las células viables, y los cuadrantes inferiores derechas (FITC
+ /PI
-) indicaron que las células apoptóticas tempranas. Los cuadrantes superior derecho (FITC
+ /PI
+) indicaron que las células apoptóticas tardías, y los cuadrantes superior izquierdo (FITC
- /PI
+) indica que las células muertas
Efectos de la proteína de fusión biespecífica Ec-LDP-Hr-AE en EGFR /HER2 vías de señalización de activación
Para la caracterización de los mecanismos moleculares implicados en la citotoxicidad y la inducción de la apoptosis de Ec-LDP-HR AE, hemos examinado sus efectos sobre la expresión de moléculas relacionadas con la apoptosis y varias moléculas clave en las vías de señalización de EGFR /HER2. Como se muestra en la Fig. 5, Ec-LDP-Hr-AE promovidos caspasa-3 y caspasa-7 actividades, así como la escisión de PARP, lo que indica que la apoptosis inducida por Ec-LDP-Hr-AE puede estar asociada con las vías mitocondriales. Por otra parte, el tratamiento con Ec-LDP-Hr-AE con plomo a la significativa disminución de la fosforilación de EGFR y HER2, mientras que la expresión de EGFR y HER2 inactivada no se han cambiado. La fosforilación de moléculas de señalización aguas abajo de EGFR /HER2 vía, tales como AKT, ERK, JNK y p38MAPK se inhibió aún más por el tratamiento de la Ec-LDP-Hr-AE (Fig. 5). Los datos de densitometría demostraron que el fosforilada HER2 y p38MAPK disminuyeron significativamente con todas las concentraciones indicadas de tratamiento Ec-LDP-Hr-AE (datos no mostrados, P & lt; 0,05). EGFR fosforilado, AKT y JNK disminuyeron significativamente con 0,5 nmol /L y 1 nmol /L de tratamiento Ec-LDP-Hr-AE (P & lt; 0,05) y ERK fosforilada disminuyeron significativamente con 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE tratamiento (datos no mostrados, P & lt; 0,05). Los niveles de AKT total de ERK, JNK y p38MAPK no se vieron afectados por el tratamiento de la Ec-LDP-Hr-AE, y los datos de densitometría apoyaron esta conclusión (datos no mostrados).
La expresión de la apoptosis relacionado moléculas (por ejemplo, la caspasa 3, caspasa 7 y PARP) vías y moléculas clave en el EGFR /HER2 de señalización (por ejemplo, fosforilada-EGFR, -HER2, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -AKT) se determinaron por análisis de transferencia Western. β-actina se sirvió como control de carga.
En vivo
eficacia de las proteínas de fusión energizadas
En vivo
efectos antitumorales de energía proteínas de fusión se evaluaron en un modelo de ratón desnudo KYSE150 xenoinjertos. Como se muestra en la Figura 6A, LDM suprime el crecimiento de KYSE150 xenoinjertos de 61,4% a la dosis máxima tolerada (0,05 mg /kg), y la proteína de fusión biespecífica Ec-LDP-Hr-AE a la dosis de 0,3 mg /kg inhibió el el crecimiento de xenoinjertos KYSE150 en un 88%, lo que mostró diferencias estadísticamente significativas (P & lt; 0,05) en comparación con el grupo tratado con LDM en 0,05 mg /kg. No se registraron muertes de animales se encontraron en los grupos tratados, y las curvas de peso corporal indicaron que los animales toleraron bien a la dosis administrada de Ec-LDP-Hr-AE (Fig. 6B).
ratones Nude (n = 7) que llevan xenoinjertos de carcinoma esofágico KYSE150 humanos fueron tratados con LDM o Ec-LDP-Hr-AE en el día 11 y el día 21 después de la inoculación del tumor mediante inyección en vena de cola. Se muestran los volúmenes tumorales medios (A) y los pesos corporales medios de los ratones (B) en cada grupo. Ec-LDP-Hr-AE a la dosis de 0,3 mg /kg inhibió el crecimiento de KYSE150 xenoinjertos de 88%, que mostró diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo tratado LDM a la dosis máxima tolerada (0,05 mg /kg) (P & lt; 0,05 ).
Discusión
la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia siguen siendo el pilar del tratamiento para el cáncer de esófago, pero recientemente, una serie de terapias dirigidas están siendo estudiados con el objetivo de mejorar la respuesta tasa y la supervivencia en pacientes con cáncer de esófago [6], [16], [17]. Como se sabe, la sobreexpresión de EGFR y HER2 se ha observado en más del 30% de los carcinomas esofágicos, y su sobreexpresión se correlaciona con la reducción de la supervivencia, aumento del riesgo de recurrencia, metástasis a distancia, y la resistencia a la radioterapia [18]. Por lo tanto, los efectos de algunos anticuerpos monoespecíficos y los inhibidores de tirosina quinasa que bloquean el EGFR o la función de HER2, como cetuximab, trastuzumab, gefitinib, y erlotinib en el carcinoma de esófago han sido examinados, pero la eficacia se limita hasta la fecha [19] - [22] . A diferencia de los anticuerpos monoclonales y inhibidores de tirosina quinasa, las inmunotoxinas se consideran para ser altamente eficaz en la terapia del cáncer con la ventaja de la especificidad de anticuerpos o ligandos y la citotoxicidad de las toxinas [23]. Sin embargo, los datos de ensayos clínicos sobre las inmunotoxinas han mostrado resultados inconsistentes. Varios inmunotoxinas eran muy eficaces contra las neoplasias malignas hematológicas. Por ejemplo, en el ensayo de fase III en pacientes con linfoma cutáneo de células T (CTCL), el 30% de los 71 pacientes tratados con Denileukin Diftitox (DAB
389IL2, Ontak) tuvieron una respuesta objetiva, incluyendo 10% de remisiones completas. Y en un ensayo de fase I en 31 pacientes con leucemia de células peludas, BL22 inducido 19 respuestas completas (61%) y 5 respuestas parciales (19%) [24], [25]. Sin embargo, para los tumores sólidos, las inmunotoxinas demostraron eficacia antitumoral limitada. Las razones para que pierda el tratamiento de tumores sólidos incluyen penetración baja en los tumores y las respuestas inmunitarias graves [26] - [28]. Vallera y colaboradores han desarrollado moléculas biespecíficas novedosos mediante la fusión de dos ligandos dirigidos distintas a una única toxina con el objetivo de mejorar la especificidad, y los resultados demostraron que las moléculas biespecíficas mostraron bien una actividad antitumoral mejorada o más amplio espectro de reactividad de las moléculas monoespecíficas [15 ], [29], [30] - [34]. La proteína de fusión Ec-LDP-Hr-AE se construyó con anterioridad es una molécula biespecífica que la orientación tanto de EGFR y HER2. Ec-LDP-Hr-AE emplea dos oligopéptidos de unión al receptor y la administración intracelular subsiguiente de un antibiótico lidamycin enediyne de la muerte celular. En este estudio, se investigó la actividad antitumoral de Ec-LDP-Hr-AE sobre el cáncer de esófago, ya que se observó co-overexpresssion de EGFR y HER2 en la mayoría de los carcinomas escamosos de esófago.
La unión con los receptores correspondientes es el requisito previo para Ec-LDP-Hr-AE para ejercer sus efectos citotóxicos en células tumorales selectiva. Por lo tanto, la capacidad de unión de la proteína Ec-LDP-Hr a las células CECA se evaluó utilizando un ensayo de inmunofluorescencia basado en citometría de flujo. Los resultados mostraron que la proteína Ec-LDP-Hr era capaz de unirse a las células CECA con alta afinidad. Sin embargo, Ec-LDP-Hr no pudo demostrar la actividad de unión a EGFR y células NIH 3T3 HER2 negativos. En el ensayo de viabilidad celular, la biespecífico y proteína de fusión enediyne-energizado Ec-LDP-Hr-AE mostraron efectos de matanza extremadamente potentes en las células de cáncer de esófago con IC
50 valores en un nivel muy bajo (& lt; 10
-10 mol /L). Para las células KYSE150, que expresan los receptores EGFR y HER2, Ec-LDP-Hr-AE fue el más citotóxica para las células de cáncer de esófago cuando se comparan con LDM y dos proteínas de fusión monoespecíficas (CE-LDP-AE y LDP-Hr-AE). actividad mejorada de la proteína de fusión biespecífica puede explicarse por que Ec-LDP-Hr-AE unido a ambos EGFR y HER2, y hace que sea menos probable de disociarse de la superficie de la célula, aumentando así las posibilidades para la internalización de su resto citotóxico y celular ejerciendo matando efectos. Sin embargo, la proteína Ec-LDP-Hr-AE biespecífico no siempre era más potente que las contrapartes monoespecíficas y LDM como los resultados de los análisis estadísticos revelaron que las diferencias en CI
50 valores de LDM, Ec-LDP-Hr-AE , Ec-LDP-AE y LDP-Hr-AE para EC-1, ECa109 y EC9706 células no fueron estadísticamente significativas. Además, hemos encontrado que la citotoxicidad de las proteínas de fusión con energía para EscC células no se correlacionó bien con el EGFR y los niveles de expresión de HER2. Por ejemplo, el IC
50 valor de Ec-LDP-Hr-AE para EC9706 células con baja expresión de HER2 fue 5,12 × 10
-12 mol /l, mientras que IC
50 KYSE150 valor por células con alta EGFR y HER2 nivel fue de 6,10 × 10
-11 mol /L. Los resultados similares se observaron también entre la potencia de las proteínas de fusión monoespecíficas y los niveles de EGFR /HER2. Este fenómeno se ha observado en otros estudios sobre las drogas específicas, tales como lapatinib [35], [36]. Como resultado, los nuevos estudios que se centran en revelar los mecanismos moleculares de la sensibilidad a la Ec-LDP-Hr-AE son claramente necesarios, y esto puede proporcionar datos útiles para la selección de los pacientes que se beneficiarán de los agentes de EGFR /HER2-biespecífico.
para dilucidar los mecanismos de biespecífico Ec-LDP-Hr-AE exhibe citotoxicidad en células de cáncer de esófago, la tinción PI, tinción Hoechst, y Anexina V-FITC /se realizaron estudios de tinción PI para examinar la detención del ciclo celular y la apoptosis. Los resultados de los análisis del ciclo celular demostraron que Ec-LDP-Hr-AE causada significativa detención G2-M, en la que las células en fase G2-M alcanzó el pico con 0,1 nmol /L de tratamiento Ec-LDP-Hr-AE. Este resultado fue debido potencialmente a las células apoptóticas y muertas después del tratamiento con el aumento de 0,5 nmol /L y 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-AE. Por lo tanto, la detención G2-M fue menos significativa que la de tratamiento 0,1 nmol /L Ec-LDP-Hr-AE. Ec-LDP-Hr-AE también apoptosis inducida en EC9706 y KYSE150 células de una manera dependiente de la dosis, y la apoptosis inducida por la Ec-LDP-Hr-AE puede estar asociada con las vías mitocondriales, porque las actividades de caspasa-3 y caspasa-7 así como la escisión de PARP se incrementó significativamente como se muestra por el análisis de transferencia de Western.