Extracto
epitelio-mesenquimal transición (EMT) está involucrado en las características de malignidad, tales como la invasión, metástasis, y quimio-resistencia. En el cáncer de las vías biliares (BTC), EMT es inducida por factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1). La EMT es reversible; por lo tanto, es concebible que podría estar relacionado con algunos cambios epigenéticos. Nos centramos en los inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) como reguladores de la señalización de TGF-β1, y se investigó su efecto sobre la EMT y la quimio-resistencia. Empleamos cuatro líneas de células BTC (MzChA-1, gemcitabina resistente MzChA-1, TFK-1, y gemcitabina resistente TFK-1) y se utiliza vorinostat como el inhibidor de HDAC. La expresión de mRNA relativa de un marcador epitelial (CDH1) y marcadores mesenquimales (CDH2, vimentina, Snai1) se midieron por QRT-PCR para evaluar los factores asociados con la EMT. MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) ensayo se realizó para evaluar la quimiorresistencia de cada línea celular. Además, los ratones NOD /SCID se utilizaron para evaluar el efecto de vorinostat
in vivo
. En el padre MzChA-1 y líneas celulares TFK-1, EMT inducida por TGF-β1 y quimio-resistencia; mientras que el vorinostat inhibió la EMT y la quimio-resistencia inducida por TGF-β1. En las líneas celulares resistentes a gemcitabina que expresan altamente TGF-β1, vorinostat EMT inhibido y atenúan la quimio-resistencia. Demostramos que vorinostat inhibe la translocación nuclear de SMAD4 que es un factor de señalización de TGF-β1, y este es uno de los mecanismos por los que vorinostat regula EMT. También demostramos que el vorinostat atenúa la afinidad de unión de SMAD4 a la transcripción relacionados con factores de CDH1 Snai1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, y TWIST. Además, la terapia de combinación con vorinostat y gemcitabina mejorado el tiempo de supervivencia en los ratones xenoinjertados con células MzChA-1 resistente a gemcitabina. En conclusión, el vorinostat regulada EMT y quimio-resistencia TGF-β1 inducida a través de la inhibición de la translocación nuclear SMAD4
Visto:. Sakamoto T, S Kobayashi, Yamada D, Nagano H, Tomokuni A, Tomimaru Y, et al. (2016) Un Inhibidor de histona deacetilasa suprime la transición epitelio-mesenquimal y atenúa quimiorresistencia en cáncer del tracto biliar. PLoS ONE 11 (1): e0145985. doi: 10.1371 /journal.pone.0145985
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos |
Recibido: 25 Junio, 2015; Aceptado: 7 Octubre 2015; Publicado: 4 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Sakamoto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica de JSP ((C) 24592024), y Grand-en-Ayudas para jóvenes científicos de JSP ((B) 26.861.069)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer del tracto biliar (BTC), que tiene una aumento de la incidencia en todo el mundo, tiene un mal pronóstico, ya que es difícil de diagnosticar en las primeras etapas. La tasa de supervivencia a 5 años es inferior al 30% [1-3]. Al momento del diagnóstico, muchos pacientes tienen resecable BTC debido a la diseminación y /o metástasis de la enfermedad local. Gemcitabina (GEM) a base de quimioterapia se utiliza a menudo; sin embargo, el efecto antitumoral es insuficiente, y el tiempo medio de supervivencia se limita a aproximadamente 10 meses [4,5]. Para mejorar el pronóstico de los pacientes BTC, la biología molecular de la enfermedad ha sido estudiado, incluyendo las citoquinas inflamatorias, la transición epitelio-mesenquimal (EMT), sistema de reparación del ADN, la señalización celular y la apoptosis [6-9]. Anteriormente puso de manifiesto que EMT se observó en la parte delantera de la invasión y metástasis en los ganglios linfáticos regionales con la expresión de citoquinas inflamatorias en BTC [10]. Varios tipos de citoquinas inducen informes, EMT, que se relaciona con procesos malignos tales como la invasión, metástasis y quimiorresistencia (S1 cuadro) [11-15]. factor beta 1 (TGF-β1) de crecimiento transformante induce EMT y la quimiorresistencia, y las células BTC quimiorresistentes producir IL-6 y TGF-β1 [10]; Por lo tanto, consideramos que estas citoquinas podrían desempeñar un papel importante en la promoción de la EMT en BTC.
rondas consecutivas de EMT y mesenquimal-epitelial (MET) se producen durante el desarrollo del tumor, lo que sugiere que la EMT podría ser reversible y asociada a cambios epigenéticos [16]. Nos centramos en la histona deacetilasa (HDAC) como un factor relacionado con los cambios epigenéticos. En nuestros datos de microarrays, los niveles de mRNA de las HDAC de clase I (HDAC1, HDAC2, HDAC3 y HDAC8) eran elevados en las células BTC GEM-resistente. Por otra parte, la actividad de HDAC se incrementó por la exposición a TGF-β1. Estos hallazgos sugieren que las HDAC podrían estar asociadas con EMT, y la inhibición de las HDAC pueden suprimir EMT a través de efectos sobre la señalización de TGF-β1. También se examinaron SMAD4, el factor clave de señalización de TGF-β1 para la EMT, y nos pareció que era estimulado directamente por la señalización de TGF-β1, con translocación en el núcleo donde se regula al alza factores de transcripción relacionados con la EMT como Snai1, SNAI2, ZEB1, ZEB2 y TWIST [17-21]. Además, en los hepatocitos normales y las células mesoteliales, la inhibición de las HDAC atenúa la translocación nuclear de SMAD4 [22,23]. En este estudio, la hipótesis de que los inhibidores de HDAC podrían regular la EMT a través de la vía de señalización de TGF-β1 en las células BTC.
El objetivo de este estudio fue investigar el efecto del vorinostat inhibidor de HDAC en la señalización de TGF-β1 vía y la quimiorresistencia, que está relacionada con EMT en células BTC. En primer lugar, se investigó el efecto de vorinostat en EMT inducida por TGF-β1. A continuación, se investigó el efecto de vorinostat en las células BTC chemoresistant. Posteriormente, puso de manifiesto la influencia de vorinostat en SMAD4 translocación nuclear de células BTC. Por último, se evaluó la eficacia de vorinostat combinado con GEM para BTC con el uso de ratones con células xenoinjertado MzChA-1 resistentes a GEM MzChA-1 o. Estos resultados demostraron la eficacia de un inhibidor de HDAC en la regulación de la EMT y la quimio-resistencia
in vitro
y
in vivo
. También se identificó uno de los mecanismos por los que un inhibidor de HDAC suprime EMT y atenúa la quimio-resistencia.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, culturas, y las drogas
Se utilizó la humana líneas de células BTC-1 y MzChA TFK-1. Las células MzChA-1 fueron amablemente proporcionados por el Prof. Gregory J. Gores de la Clínica Mayo, Rochester, Minnesota, Estados Unidos de América (EE.UU.) [24-27]. Las células MzChA-1 se propagaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco.
La línea celular TFK-1 se obtuvo del Centro de bio Riken de Japón. Estas células se propagaron en medio RPMI 1640. Cada medio fue suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina. Todas las líneas celulares se incubaron a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO
2.
Todas las líneas celulares se trataron con 5 ng /ml de TGF-β1 humano recombinante (Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ, EE.UU.), 100 nM (MzChA-1 y GEM-resistentes MzChA-1) o 300 nM (TFK-1 y GEM-resistentes TFK-1) de la vorinostat inhibidor de la histona deacetilasa (Selleckchem, Houston, TX, EE.UU.), o dimetilsulfóxido (como control) durante 72 h. En el experimento con TGF-β1, cada medio se cambió a medio libre de suero 24 h después del paso para evitar la influencia de TGF-β1 en el suero. El TGF-β1 y vorinostat se añadieron a cada línea celular después del cambio de medio. Los anticuerpos que se describen en la Tabla S2 se utilizaron para el análisis de transferencia Western, inmunohistoquímica, e inmunocitoquímica.
Establecimiento de GEM resistente MzChA-1 (MzChA-1_GR) y TFK-1 (TFK-1_GR) clones
Los MzChA-1 y TFK-1 líneas celulares GEM-resistente se establecieron a través de la exposición a concentraciones crecientes de GEM (de 0,2 ng /l a 80 ng /l para MzChA-1, y de 0,2 ng /l a 40 ng /l para TFK-1) más de 3 meses. Después de confirmar que estas líneas celulares, alcanzar mejor resistencia a GEM que las líneas celulares de los padres, los clones de células MzChA-1_GR y TFK-1_GR se establecieron mediante dilución limitante.
Análisis de la actividad HDAC
La células MzChA-1 se cultivaron con o sin 5 ng /ml de TGF-β1 y 300 nM vorinostat para 72 h. A continuación, las proteínas nucleares se extrajeron con el kit de extracto nuclear (Active Motif, Carlsbad, CA, EE.UU.). Posteriormente, la actividad de HDAC se midió con el kit de ensayo de actividad de HDAC (BioVision, Palo Alto, EE.UU.). En este experimento, se utilizó extracto nuclear HeLa como control positivo y agua destilada como control negativo. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
inmunocitoquímica
Las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente, se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100, y se bloquearon con 1 % de BSA durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se tiñeron con los anticuerpos indicados.
cuantitativa con transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa
El ARN total se aisló a partir de células cultivadas utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El ADN complementario se sintetizó a partir 3,0 g de ARN total con el sistema de superíndice primera hebra de síntesis (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se llevaron a cabo reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) con el kit LightCycler-Fast-Start principal DNA SYBR Green I (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.) con cebadores de oligonucleótidos específicos del gen, como se muestra en S3 Tabla . Las amplificaciones se realizaron por triplicado utilizando el sistema LightCycler (Roche Applied Science) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se realizó un análisis de curva de fusión para distinguir productos específicos de productos no específicos y dímeros de cebadores. La expresión relativa se calculó como la relación de ARNm específico para endógeno β-actina (ACTB) mRNA en cada muestra. Todos los QRT-PCR se realizaron por triplicado y los resultados se presentan como la media ± desviación estándar.
ensayos de inhibición del crecimiento con la terapia GEM
Cada línea celular (5 × 10
3 células /pocillo) se sembraron en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. A continuación, el medio se cambió a medio libre de suero. Posteriormente, las células fueron expuestas a GEM (1-120ng /ml) con los fármacos indicados (TGF-β1, vorinostat, o sulfóxido de dimetilo) durante 72 h. Estos ensayos se repitieron al menos tres veces, y se obtuvieron resultados similares cada vez. La proporción de MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) células positivas se incubaron sin drogas se definió como 100% de viabilidad.
Transfección de pequeños ARN de interferencia (siRNA)
Se utilizó TGF-ß siRNA (Invitrogen) y revueltos oligonucleótido siRNA (Sc) como control negativo. Se realizó la transfección de ARNsi con Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), de acuerdo con los protocolos del fabricante [28]. La eficacia de transfección fue confirmada por QRT-PCR.
Western blot
Se realizó un análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [28]. En pocas palabras, un lisado celular total se extrajo a partir de células BTC con tampón RIPA (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, EE.UU.) y las proteínas nucleares se extrajeron con el Kit de Extracción EpiQuick Nuclear I (Epigentek Group Inc., Brooklyn, Nueva York, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Alícuotas (12 mg) de proteínas totales o nucleares se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio que contienen 10% de Tris-HCl (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE.UU.). Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore) y se incubaron con cada anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C.
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
El chip de ensayo se llevó a cabo con el uso de un chip kit -IT expreso enzimática (Active Motif) como se describe anteriormente [29]. Brevemente, 1 × 10
7 células fueron reticulado con 1% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente y se inactivó mediante la adición de glicina. Para cosechar los complejos de la cromatina en el ADN, el lisado de células se trató con un kit enzimático de corte (Active Motif), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Para la inmunoprecipitación, 120 g de complejos de la cromatina de ADN se incubaron con perlas magnéticas proteína G vinculados a anti-SMAD4 anticuerpo (10 mg, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, EE.UU.), o anti-IgG de anticuerpos (10 mg, Active Motif) . Los eluidos se utilizaron como plantillas para PCR. Cantidades iguales de anti-IgG o pre-inmune complejo cromatina-DNA se utilizaron como controles. Los conjuntos de cebadores usados para la amplificación de PCR fueron: Snai1: 5'-GCTGTCACACCCGGCACCAAG-3 'y 5'-GGCGGCTTGAAATGCCACGG-3', SNAI2: 5'-ATGCGTGTGAAGTGCTTAGCATAGT-3 'y 5'-CACTCAGTGCCCAACAGTGTGT-3', ZEB1: 5 ' TTTCGGGAAGTTAAAATGTTTG-3 'y 5'-ATCCTGCTTCATCTGCCTGA-3', ZEB2: 5'-TACGCCTGCGCTGTGACCTA-3 'y 5'-ACTCACTGGACCCGCCTCAG-3', y TWIST: 5'-AGTCTCCTCCGACCGCTTCCTG-3 'y 5'-CTCCGTGCAGGCGGAAAGTTTGG-3'.
ratón modelo de xenoinjerto de tumor
el células MzChA-1_GR MzChA-1 o (1.0 × 10
6 células por ratón) se inyectaron en el tejido subcutáneo en la parte posterior de cinco a se permitió seis semanas de edad ratones desnudos masculinos (CLEA Japan Inc., Tokio, Japón), y para desarrollar tumores. Cuando los tumores crecieron hasta el volumen de 200 mm
3, GEM (125 mg /kg, una vez a la semana) con o sin vorinostat (60 mg /kg, 5 días consecutivos por semana) se administró mediante inyección intraperitoneal. Para investigar el efecto de vorinostat en el tiempo de supervivencia, el tratamiento se continuó hasta que la eutanasia apropiado. las piezas de resección de tumores fueron utilizados para inmunohistoquímica para investigar la expresión de SMAD4.
La inmunohistoquímica
Los estudios inmunohistoquímicos en 10 muestras de tumores resecados de los ratones con células xenoinjertado MzChA-1_GR. En pocas palabras,, tejidos embebidos en parafina fijadas con formalina se deparaffinized, se hirvieron durante la recuperación de antígenos, se incubaron con un anticuerpo SMAD4 durante 1 hora a temperatura ambiente, y luego se visualizaron con reactivos complejo avidina-biotina (Vector Laboratory Inc., Burlingame, CA, EE.UU.) y diaminobencidina. Todas las secciones se counterstained con hematoxilina. Se evaluaron todos los estudios inmunohistoquímicos en secciones en serie con cada anticuerpo.
declaraciones éticas
número de homologación de todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Osaka ( se llevaron a cabo 20-087), y los estudios de acuerdo con las directrices institucionales:. En los experimentos con animales, se llevaron a cabo todos los tratamientos invasivos, tales como el trasplante de xenoinjerto, alimentación forzada, y la eutanasia bajo anestesia general con sevoflurano. Los ratones fueron sacrificados en el inicio de los signos clínicos tales como la caquexia severa, pérdida de peso significativa, o la inactividad.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD) a partir de al menos tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student o la prueba exacta de Fisher para datos categóricos. Se utilizó la prueba t de Student no pareado para examinar las diferencias en el crecimiento de los efectos inhibitorios
in vitro
.
P-valores
& lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
Establecimiento de Mz-cha-1_GR y TFK-1_GR líneas celulares
Hemos establecido las líneas celulares resistentes a GEM, MzChA-1_GR y TFK-1_GR, para investigar el efecto de los inhibidores de HDAC en la quimio-resistencia. Las células MzChA-1_GR eran resistentes a GEM (IC
50 para GEM & gt; /ml,
P Restaurant & lt 100 ng; 0,01 frente al padre MzChA-1 en las células, S1A la figura) y las células TFK-1_GR fueron resistentes a GEM (IC
50 para GEM & gt; 100 ng /ml,
P Hotel & lt; 0,01 frente al padre TFK-1 células, S1B FIG). Estas células GEM-resistentes tenían formas de huso como.
Análisis de microarrays
Un análisis de microarrays se realizó utilizando el TORAY 3D-Gen
® para comparar los perfiles de expresión de células MzChA-1 con los de las células MzChA-1_GR e investigar los factores relacionados con la epigenética. Los resultados mostraron que la expresión de clase I HDACs (HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, y HDAC-8) fueron mayores en las células MzChA-1_GR que los padres células MzChA-1 (Tabla 1). Vorinostat inhibe estas HDAC de clase I, por lo que consideró que el vorinostat podría ser eficaz en las células BTC chemoresistant.
La expresión del ARNm de la clase I HDACs y la actividad HDAC en células MzChA-1 y MzChA-1_GR
para validar los resultados del análisis de microarrays, QRT-PCR para las HDAC de clase I se realizó para las células MzChA-1 y MzChA-1_GR. Todas las HDAC de clase I mostraron una mayor expresión en células MzChA-1_GR en comparación con las células MzChA-1 (
P Hotel & lt; 0,05, Figura 1A). La actividad HDAC fue significativamente mayor en las células MzChA-1 expuestas a TGF-β1 durante 72 h y las células MzChA-1_GR en comparación con células parentales MzChA-1 (
P
& lt; 0,05, Fig 1B). Además, vorinostat suprimió la actividad HDAC en células MzChA-1 expuestas a TGF-β1 y las células MzChA-1_GR (
P
& lt; 0,05, Fig 1C).
Los valores representan la media ± SD *
P Hotel & lt; 0.05. Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces. (A) Comparación de la expresión de las HDAC de clase I en las células MzChA-1_GR MzChA-1 y de QRT-PCR. (B) El efecto de TGF-β1 en la actividad HDAC en células MzChA-1 y la actividad HDAC en células MzChA-1_GR, la actividad se midió con el kit de ensayo de actividad de HDAC. (C) Los cambios en la actividad HDAC en células MzChA-1 y MzChA-1_GR tratados con TGF-β1 y vorinostat. En los experimentos para los paneles (B) y (C), las células se incubaron con o sin 5 ng /ml de TGF-β1 o 100 nM vorinostat para 72 h.
La relación entre TGF-β1 expresión y la quimio-resistencia
Para aclarar el significado de TGF-β1 en la EMT y la quimio-resistencia, se determinó la expresión de TGF-β1 en la matriz MzChA-1 y células MzChA-1_GR. Los resultados mostraron que el nivel de expresión de TGF-β1 fue significativamente mayor en las células MzChA-1_GR que las células MzChA-1 matrices (Fig 2A). A continuación, transfectadas con Si
TGF-β
para investigar si la EMT y la quimio-resistencia podrían ser suprimidas por el TGF-ß tocamos en células MzChA-1_GR. El resultado mostró que las células MzChA-1_GR transfectadas con Si
TGF-β
habían aumentado la expresión de mRNA de CDH1 y la disminución de la expresión de mRNA de CDH2, vimentina, y Snai1 (Fig 2B). Por otra parte, la transfección con Si
TGF-β
atenúa la quimio-resistencia en las células MzChA-1_GR (Figura 2C). Estos resultados sugieren la importancia de TGF-β en EMT y quimiorresistencia en BTC.
células MzChA-1_GR se transfectaron con oligonucleótido revueltos siRNA (control negativo) o TGF-β1 siRNA. Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces. Los valores representan la media ± S. D. *
P Hotel & lt; 0.05. (A) Comparación de la expresión de TGF-β1 en las células MzChA-1 y MzChA-1_GR. (B) Los cambios de la expresión de ARNm relacionadas con el EMT como resultado de TGF-ß transfección siRNA en células MzChA-1_GR. (C) El efecto de TGF-ß transfección siRNA en quimiorresistencia en células MzChA-1_GR. ensayos de inhibición de crecimiento se realizaron para las células transfectadas y no transfectadas tratadas con GEM.
El efecto de vorinostat en EMT y quimio-resistencia inducida por TGF-β1
Se investigó el efecto de vorinostat en la EMT y la quimio-resistencia TGF-β1 inducida en las células BTC. En MzChA-1 en las células, el TGF-β1 provocó cambios morfológicos de las células, a partir de formas valvados similar a las formas de huso como. Por otra parte, el TGF-β1 reducido regulado la expresión de CDH1, determinada por tinción de inmunofluorescencia (Fig 3A). Por el contrario, vorinostat impedido estos cambios causados por el TGF-β1 (Fig 3A). Además, el TGF-β1 disminuyó la expresión de ARNm de CDH1 y aumentó la expresión de ARNm de CDH2, vimentina (VIM), y Snai1. Por el contrario, vorinostat inhibió los cambios en la expresión de ARNm causados por el TGF-β1 (
P
& lt; 0,05, Fig 3B). Además, el vorinostat atenuada resistencia GEM inducida por TGF-β1 (
P Hotel & lt; 0,05, Figura 3C). En las células TFK-1, vorinostat impidió cambios morfológicos y la baja regulación de CDH1 causada por el TGF-β1 (Figura 3D). Vorinostat también inhibió los cambios en la expresión de ARNm relacionadas con la EMT (
P Hotel & lt; 0,05, Figura 3E), y atenuado quimio-resistencia a GEM causada por el TGF-β1 (
P Hotel & lt; 0,05, Fig 3F). Por lo tanto, vorinostat suprimida EMT y atenuada quimiorresistencia provocada por TGF-β1.
En cada experimento, las células se incubaron con o sin 5 ng /ml de TGF-β1 y 100 nM de vorinostat para las células MzChA-1 y 300 nM de vorinostat para las células TFK-1 para 72 h. Los valores representan la media ± S. D. *
P Hotel & lt; 0.05. Barras de escala: 100 m. Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces. (A) células de cambios morfológicos representativos inducidos por TGF-β y vorinostat en células MzChA-1. Inmunofluorescencia para CDH1 (rojo) se realizó en las células MzChA-1. tinción nuclear (azul) se llevó a cabo con Hoechst. (B) El efecto de vorinostat en la expresión ARNm relacionados EMT-en células MzChA-1. (C) El efecto de vorinostat en quimiorresistencia inducida por la exposición de TGF-β1 en las células MzChA-1. Los ensayos de inhibición de crecimiento se realizaron para las células MzChA-1 tratados con GEM. (D) de células cambios morfológicos representativos inducidos por TGF-β y vorinostat en células TFK-1. Inmunofluorescencia para CDH1 (rojo) se realizó en las células TFK-1. tinción nuclear (azul) se llevó a cabo con Hoechst. (E) El efecto de vorinostat en la expresión ARNm relacionados EMT-en células TFK-1. (F) El efecto de vorinostat en quimiorresistencia inducida por la exposición de TGF-β1 en las células TFK-1. ensayos de inhibición del crecimiento de células se realizaron TFK-1 tratados con GEM.
La influencia de vorinostat en las células TFK-1_GR MzChA-1_GR y
En las células MzChA-1_GR, vorinostat cambiado la morfología de las formas de huso como a valvados-como formas y aumentó la tinción de CDH1, como se determina por tinción de inmunofluorescencia (Fig 4A). La expresión de mRNA CDH1 tendió a aumentar, y CDH2, VIM, y Snai1 se redujeron significativamente por vorinostat (
P Hotel & lt; 0,05, Figura 4B). Además, vorinostat atenuada quimiorresistencia GEM en células MzChA-1_GR (
P
& lt; 0,05, Fig 4C).
En cada experimento, las células MzChA-1_GR se incubaron con o sin 100 nM vorinostat células y TFK-1_GR con o sin 300 nM vorinostat para 72 h. Los valores representan la media ± S. D. *
P Hotel & lt; 0.05. Barras de escala: 100 m. Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces. (A) Representante cambio morfológico inducido por vorinostat en las células MzChA-1_GR. Inmunofluorescencia para CDH1 (rojo) se realizó en las células MzChA-1. tinción nuclear (azul) se llevó a cabo con Hoechst. (B) El efecto de vorinostat en la expresión ARNm relacionados EMT-en células MzChA-1_GR. (C) El efecto de vorinostat en la quimio-resistencia en MzChA-1_GRcells. ensayos de inhibición del crecimiento se realizaron para las células MzChA-1_GR tratados con GEM. (D) los cambios morfológicos inducidos por el vorinostat representativos en las células TFK-1_GR. Inmunofluorescencia para CDH1 (rojo) se realizó en las células TFK-1_GR. tinción nuclear (azul) se llevó a cabo con Hoechst. (E) El efecto de vorinostat en la expresión ARNm relacionados EMT-en células TFK-1_GR. (F) El efecto de vorinostat en la quimio-resistencia en las células TFK-1_GR. ensayos de inhibición del crecimiento se realizaron para las células TFK-1_GR tratados con GEM.
En las células TFK-1_GR, vorinostat cambió la morfología y aumentó la tinción de CDH1, medido por tinción de inmunofluorescencia similar a MzChA-1_GR células (figura 4D). Además, el vorinostat aumentó la expresión de mRNA CDH1, y la disminución de la expresión de ARNm de CDH2, VIM, y Snai1 (
P Hotel & lt; 0,05, Figura 4E). resistencia GEM también fue atenuada por el vorinostat en las células TFK-1_GR (
P Hotel & lt; 0,05, Figura 4F). Estos resultados sugieren que el vorinostat suprimida EMT y atenúan la quimio-resistencia en GEM células BTC resistentes.
El efecto de vorinostat en SMAD4 translocación nuclear en las células MzChA-1 |
En nuestro estudio anterior, SMAD4 fue la clave molécula de la regulación inducida por TGF-β1 EMT [10]. Por lo tanto, se investigó el efecto de vorinostat en la expresión de SMAD4 por Western blot. En lisados de células enteras, no hubo diferencia significativa en la expresión de la proteína SMAD4 entre el grupo de TGF-β1 y el TGF-β1 más vorinostat grupo (Fig 5A, izquierda). Sin embargo, TGF-β1 upregulated la expresión de la nucleoproteína SMAD4 en comparación con el control, y vorinostat inhibió esta regulación al alza de la nucleoproteína SMAD4 causados por el TGF-β1 (Fig 5A, derecha). Además, se utilizó el método de chip para analizar el mecanismo molecular de SMAD4. Mientras que TGF-β1 mejoró la afinidad de unión de SMAD4 a los factores de transcripción relacionados con CDH1 Snai1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, y Twist, vorinostat inhibe la afinidad de TGF-β1-unión mejorada de SMAD4 a estos factores de transcripción (Fig 5B).
En cada experimento, las células se incubaron con o sin 5 ng /ml de TGF-β1 y 100 nM de vorinostat para 72 h. Barras de escala: 100 m. Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces. (A) El cambio en la expresión SMAD4 en lisados de células enteras (panel izquierdo) y en el núcleo (panel de la derecha) causada por el TGF-β y vorinostat. (B) chip de ensayo que muestra la expresión de Snai1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, y TWIST, que son elementos reguladores de CDH1. (C) La inmunofluorescencia de SMAD4 (verde) se realizó en las células MzChA-1. Se investigó el efecto de TGF-β1 y vorinostat en SMAD4 translocación nuclear. tinción nuclear (azul) se llevó a cabo con Hoechst.
La inmunocitoquímica demostraron que SMAD4 teñidas fuertemente en los núcleos después del tratamiento con TGF-β1 (Figura 5C). Por el contrario, SMAD4 se tiñó débilmente en los núcleos después del tratamiento con TGF-β1 más vorinostat (Fig 5C). Basándose en estos resultados, vorinostat regulada EMT a través de la inhibición de la SMAD4 translocación nuclear.
El efecto de vorinostat en los factores de señalización de TGF-beta, Smad2, Smad3, y Jun quinasa N-terminal (JNK)
también investigamos el efecto de vorinostat en SMAD2 y SMAD3 ya que están estrechamente relacionados con SMAD4 translocación nuclear en la señalización de TGF-β. Encontramos inducida por fosforilación SMAD2 y SMAD3 TGF-β1 en ambos lisados de células enteras y las proteínas nucleares (Fig 6). Además, vorinostat inhibe TGF-β1 inducida por la translocación nuclear de Smad2 fosforilados (p-SMAD2) y SMAD3 (p-SMAD3); mientras que, vorinostat no tuvo efecto sobre la translocación nuclear de Smad2 y SMAD3 (Fig 6). Estos resultados sugieren que vorinostat puede inhibir la translocación nuclear de Smad2 p, p-SMAD3, y SMAD4 al mismo tiempo. También se investigó la activación de JNK porque los informes recientes mostraron que la activación de JNK desempeña un papel central en TGF-β mediada EMT. El resultado mostró TGF-β1 upregulated la expresión de JNK fosforilado; sin embargo, vorinostat no tuvo efecto sobre JNK (Fig 6). En consecuencia, el efecto de vorinostat en EMT parece ser independiente de la vía de JNK en BTC.
En cada experimento, las células se incubaron con o sin 5 ng /ml de TGF-β1 y 100 nM de vorinostat para 72 marido. Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces. Se muestran los cambios en SMAD2, p Smad2, SMAD3, y la expresión de P-SMAD3 en lisados de células enteras (panel izquierdo) y en el núcleo (panel derecho). La expresión de JNK y p-JNK en lisados de células enteras también se muestran (panel izquierdo).
El efecto de vorinostat en el modelo de tumor de xenoinjerto de ratón
Para confirmar la
in vitro
resultados, se evaluó el efecto de vorinostat en ratones con células xenoinjertado MzChA-1 o MzChA-1_GR. En los ratones xenoinjertados con células MzChA-1, terapia de combinación con vorinostat y GEM no mejoró el tiempo de supervivencia en comparación con una única administración de GEM (Fig 7A). Por el contrario, la terapia de combinación con vorinostat y el IPG mejoró el tiempo de supervivencia en comparación con una única administración de GEM en los ratones con células xenoinjertado MzChA-1_GR (log-rank test,
P Hotel & lt; 0,01, Figura 7B).
NOD /SCID xenoinjertados con se emplearon células MzChA-1 y MzChA-1_GR como
in vivo y modelos. Cuando el volumen del tumor fue de más de 200 mm
3, los ratones fueron tratados con los fármacos indicados (GEM [125 mg /kg, una vez a la semana] y /o vorinostat [60 mg /kg, 5 días consecutivos por semana]) . El valor pronóstico se evaluó por el método de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank. La curva (a) La supervivencia de ratones con células xenoinjertados MzChA-1. (B) Curva de supervivencia de ratones con células xenoinjertados MzChA-1_GR. (C) Inmunohistoquímica para SMAD4 en las muestras de tumor resecado de los ratones xenoinjertados con células MzChA-1_GR.
A continuación, se realizó inmunohistoquímica de las muestras de tumores resecados de los ratones para evaluar la expresión de SMAD4
in vivo
. El resultado mostró que SMAD4 estaba fuertemente manchado en los núcleos de las células tumorales cuando los ratones fueron tratados con una sola administración de GEM. Por el contrario, SMAD4 se tiñó débilmente en los núcleos de las células tumorales cuando los ratones fueron tratados con GEM y vorinostat (Fig 7C). Estos resultados fueron los mismos en ambos sitios primarios y metastásicos (pulmonar). Por lo tanto, el vorinostat mejorado el tiempo de supervivencia en los ratones con células xenoinjertados chemoresistant cuando fueron tratados con GEM.
Discusión
En muchos tipos de cáncer, varios genes relacionados con la tumorigénesis y la progresión tumoral están regulados al alza, y los genes en relación con la supresión de tumores son downregulated. Uno de los factores que regulan la expresión de genes es la modificación postraduccional de las histonas. La metilación y acetilación de las histonas son bien conocidos modificaciones post-traduccionales [30-32]. Recientemente, se ha prestado mucha atención a la metilación y acetilación de las histonas para el tratamiento de tipos de cáncer [33,34]. En este estudio, nos centramos en la capacidad de los inhibidores de HDAC para regular la EMT. Utilizamos vorinostat, que inhibe la I HDACs de clase y se utiliza a menudo como un inhibidor de HDAC en ensayos clínicos de cáncer, como se muestra en la Tabla S4 [35-39]. En varios tipos de cáncer, como el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el cáncer de mama, quimioterapia de combinación con vorinostat era seguro y mostró potencial para mejorar la eficacia [38,40].
Nos centramos en SMADs, particularmente SMAD4 que es un factor de TGF-β1 de señalización, como uno de los mecanismos que regula vorinostat EMT. A menudo se informó que el TGF-β induce EMT y quimiorresistencia [10]. receptores de TGF-beta 1 de tipo I activadas fosforilan SMAD2 y SMAD3, que forman un complejo heteromérico con SMAD4 [41,42]. Este complejo se transloca al núcleo y se dirige a una variedad de proteínas de unión de ADN para regular las respuestas transcripcionales [41,42]. Por lo tanto, los reguladores de la transcripción de CDH1, como SNAI, ZEB, y TWIST, son upregulated [42]. Entonces, CDH1 es downregulated y EMT se produce [43,44]. Por lo tanto, la inhibición de la translocación nuclear de Smad2, SMAD3, y complejos SMAD4 podrían regular EMT relacionadas con el TGF-β1. En primer lugar, se investigó si el vorinostat cambia la expresión del ARNm de estos SMADs de QRT-PCR. No se observaron cambios en estos SMADs después de la exposición al vorinostat (S2 figura). Sin embargo, algunos estudios han demostrado aneffect de los inhibidores de HDAC en SMAD4 [22,23]. Kaimori et al. *
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