Extracto
Objetivo
El carcinoma oral de células escamosas (COCE) es un frecuente cáncer, especialmente en los países en desarrollo. Las antraciclinas y sus derivados de antraquinona, tales como doxorrubicina, exhiben un efecto inhibidor del crecimiento celular y se han utilizado como medicamentos contra el cáncer durante muchos años. Sin embargo, la cardiotoxicidad de los antibióticos de antraciclina es una preocupación importante en su aplicación clínica. NSC745885 es un nuevo compuesto sintetizado a partir de 1,2-diaminoantraquinona, que posteriormente reacciona con cloruro de tionilo y trietilamina. El presente estudio tuvo como objetivo investigar el potencial anti-cáncer oral y la seguridad de NSC745885.
Métodos
Hemos investigado el potencial anticáncer de NSC745885 en líneas celulares de carcinoma escamoso oral y en un
in vivo
cáncer oral modelo de xenoinjerto de ratón. La expresión de los genes relacionados con la apoptosis se evaluó por tiempo real de RT-PCR y bloting occidental, y el
in vivo
evaluación de marcador de apoptosis se midió por tinción inmunohistoquímica. La eficacia anti-tumoral y de seguridad entre doxorubicina y NSC745885 también se compararon.
Resultados
Nuestros resultados demuestran que NSC745885 exhibe actividad contra el cáncer de oral a través de la inducción de la apoptosis en células de cáncer y en el tumor llevando los ratones, y este tratamiento no inducir marcada toxicidad en ratones experimentales. Este compuesto también exhibe una eficacia antitumoral comparable y una mayor seguridad en los ratones experimentales en comparación con la doxorrubicina.
Conclusiones
Los datos de este estudio proporcionan evidencia de NSC745885 como un potencial nuevo fármaco terapéutico para el tratamiento de la CCCA humana
Visto:. YW Chen, Huang SA, Shieh YS, Ma KH, Huang SH, Hueng DY, et al. (2014) un nuevo compuesto NSC745885 ejerce un efecto anti-tumoral en las células del cáncer de lengua SAS in vitro e in vivo. PLoS ONE 9 (8): e104703. doi: 10.1371 /journal.pone.0104703
Editor: Arianna L. Kim, Columbia University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 20 de enero de 2014; Aceptado: July 16, 2014; Publicado: 15 de agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de investigación del Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán, República de China (NSC101-2320-B-016-016 a G.-J. Lin y NSC102-2314-B-016-018-MY3 a Y. -W Chen), Tri-Service General Hospital, República Popular de China (Grant No se . TSGH-C102-019, TSGH-C100-034 y C101-009 TSGH--S06) y en parte por el CY Fundación para el Avance de la Educación, Ciencia y Medicina. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Entre los carcinomas orales de células escamosas (OSCCs), la gran mayoría de los tumores malignos de cabeza y cuello son carcinomas de células escamosas (HNSCCs). OSCC es el sexto cáncer más frecuente en todo el mundo [1], y el tercer cáncer más común en los países en desarrollo [2] - [4]. Las terapias tradicionales para OSCC incluyen cirugía, radioterapia, y quimioterapia. Sin embargo, el efecto corrector de este tipo de terapias de cáncer oral en fase terminal es uniformemente pobres. Además, incluso después de la resección del tumor con éxito, aproximadamente el 20% de los pacientes puede tener la recurrencia de los tumores en otro sitio [5]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para los tumores orales malignos es un tema urgente.
Las antraciclinas y sus derivados de antraquinona de exhibición de crecimiento celular y efectos inhibidores han sido utilizados como fármacos contra el cáncer durante más de 30 años [6]. La daunorrubicina y la doxorrubicina, dos antibotics de antraciclina, se utilizan con frecuencia para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda, así como tumores sólidos diversos [7]. Estudios previos han informado de que estos fármacos inducen la apoptosis en las células tumorales [8], [9]. Las acciones citostáticos y citotóxicos de estos fármacos se han observado a través de la inhibición de la topoisomerasa II y, posteriormente, el inicio de los daños del ADN [10]. El daño oxidativo se ha considerado un mecanismo crítico en la actividad antitumoral de antraciclina [11]. antibióticos de antraciclina también demuestran la capacidad de reducir la actividad de telomerasa y la expresión de hTERT. tratamiento doxorrubicina induce senescencia en la línea celular de tumor de mama MCF-7 de células a través de aumento de la actividad de p53, y reduce la actividad de la actividad de telomerasa en esta célula de cáncer [12]. Un estudio informó de que la actividad de la telomerasa y la expresión de hTERT mRNA fueron inhibidas por la doxorrubicina tratamiento en líneas celulares de carcinoma gástrico padre pero no en líneas celulares resistentes a la doxorrubicina [13]. Los resultados de estos estudios sugirieron un efecto de antraciclinas en la inhibición de la actividad de la telomerasa, y este efecto contribuido a la actividad anti-tumor de estos fármacos.
Aunque los antibióticos de antraciclina se han utilizado como medicamentos contra el cáncer para muchos años, su cardiotoxicidad plantea una terapia de preocupación clínica [14]. Las características de la cardiomiopatía inducida por antraciclinas en las biopsias de los pacientes tratados incluyen la pérdida de miofibrillas, la dilatación del retículo sarcoplásmico, vacuolización citoplasmática, un mayor número de lisosomas, e hinchazón de las mitocondrias en cardiomiocitos [15]. Estudios previos han demostrado que el desarrollo de cardiomiopatía en el tratamiento de la doxorrubicina se asocia con la dosis administrada [16]. Este efecto secundario se produce normalmente dentro de 1 año; sin embargo, también se puede producir varios años más tarde, durante la administración del fármaco. Además, las antraciclinas también pueden conducir a infrecuente (menos de 1%) cardiotoxicidad aguda (que ocurren generalmente dentro de 1 semana) [17]. Por lo tanto, el desarrollo de un nuevo fármaco que ejerce un efecto eficiente tumor anti, pero que presenta un efecto secundario menor, como cardiotoxicidad, se sigue que buscar la terapia del cáncer.
NSC745885 es un nuevo compuesto desarrollado en 2009. Este compuesto se sintetizó a partir de 1,2-diaminoantraquinona, que posteriormente reacciona con cloruro de tionilo y trietilamina [18]. Un estudio anterior encontró que NSC745885 exhibe un efecto anti-cáncer cuando se utiliza la pantalla principal línea de 60 células del Instituto Nacional del Cáncer (NCI). Los resultados indicaron que la leucemia, melanoma, y las líneas de cáncer de ovario son muy sensibles a NSC745885. cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de colon, neuroblastoma, cáncer de próstata y de células de cáncer de mama líneas también son sensibles a este compuesto. Además, este estudio anterior informó también de que NSC745885 es eficaz en la supresión del crecimiento celular en varias líneas celulares de cáncer, que se logra en parte por la capacidad inhibidora en la actividad de la telomerasa en estas células [18]. Sin embargo, el
in vitro
anticancerígeno potencial y el
in vivo
actividad de este nuevo compuesto en el cáncer oral no se ha explorado.
En este estudio, se investigó el potencial anticáncer de NSC745885 en líneas celulares de carcinoma escamoso oral y en un
in vivo
cáncer oral modelo de xenoinjerto de ratón. Por otra parte, también se evaluó la toxicidad de NSC745885 en otros órganos de los ratones tratados. Nuestros resultados demuestran que esta novela la apoptosis inducida compuesto de células de cáncer oral, ya sea en el
in vitro
cultivo celular o en el
in vivo de xenoinjertos
modelo de ratón del tumor. Además, también encontramos que
in vivo
tratamiento de NSC745885 suscitó ninguna citotoxicidad en el bazo, pulmón, hígado o corazón de los animales de experimentación. El hallazgo de nuestro estudio sugirió que NSC745885 podría ser utilizado como un fármaco eficaz para el tratamiento oral del cáncer, y este tratamiento puede presentar un mayor nivel de seguridad que los antibióticos de antraciclina tradicionales.
Materiales y Métodos
células y sustancias químicas
SAS se obtuvo de un carcinoma pobremente diferenciado de células escamosas humano [19]. Esta línea celular fue proporcionado por el Dr. Jeng-Fan Mín del Instituto de Biología Oral, Departamento de Odontología de la Universidad Nacional Yang-Ming, Taiwán [20]. OECM-1 se obtuvo de carcinoma epidermoide gingival de un paciente de Taiwán. SCC4 y SCC25 se obtuvieron de las células cancerosas escamosas de la lengua. Todas las líneas celulares se mantuvieron en un medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 25 mM de HEPES, y 1% de penicilina /estreptomicina. MRC-5 celular es una línea celular de fibroblastos de pulmón fetal humano normal (ATCC No: CCL-171) mantenida en un medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero bovino fetal al 10%, 2 mM de L-glutamina, 25 mM de HEPES, y 1% de penicilina /estreptomicina. NSC745885 [18] fue proporcionado por el Dr. Hsu-Shan Huang del Departamento de Farmacia de la Defensa Centro Médico Nacional, Taiwán.
Ensayo de inhibición del crecimiento
Las células en la fase de crecimiento logarítmico se cultivaron a una densidad de 5000 células /pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se expusieron a diversas concentraciones de NSC745885 por 24, 48, o 72 horas. Se utilizó un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) para evaluar el efecto de NSC745885 sobre el crecimiento celular, como se describió anteriormente. El IC
50 valor resultó de 50% de inhibición del crecimiento celular, que se calculó gráficamente como una comparación con el crecimiento del control.
Anexina V tinción
Las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en 1 X tampón de unión (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.). Las células resuspendidas se tiñeron con FITC-conjugado de Anexina V (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) y el porcentaje de células de Anexina V-positivos se analizó mediante citometría de flujo.
cuantitativa en tiempo real PCR
el ARN total fue aislado utilizando el método de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y la homogeneización de las células cancerosas en tampón de lisis Trizol fue seguido por extracción con cloroformo (Life Technologies). Para la síntesis de ADNc, 5 g de ARN total se transcribió de forma inversa a 50 ° C durante 60 minutos utilizando 200 unidades de transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los pares de cebadores para la caspasa-3 (sentido 5'-CTG CAG TGT GAG ATT GGC AC-3 '; antisentido 5'-AAG ACA CGA CTG GAT GAA CC-3'), XIAP (sentido 5'-GAC AGT ATG CAA GAT GAG TCA AGT CA-3 '; antisentido 5'-ACG AAG CTT CTC CTC TTG CAG-3'), y GAPDH (sentido 5'-GGA AGG AGG TGA TCA TCG GAG-3 '; antisentido 5'-GTC ATT GGC GAT AAC AAT ATC CAC T-3 ') se utilizaron para la amplificación de genes. Se utilizó el kit de mezcla maestra de SYBR Green /ROX qPCR (Fermentas, Glen Burnie, Maryland, EE.UU.) para todas las reacciones con una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR). En resumen, la PCR se realizó como sigue: un ciclo a 50 ° C durante 2 minutos, un ciclo de 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 15 segundos cada uno a 95 ° C, y 1 minuto a 60 ° C. Los datos fueron recogidos por triplicado y se normalizó con la expresión de GAPDH.
extracción de proteínas y Western blot
La proteína se extrae de una célula cultivada (SAS) se lisaron en una lisis celular que contiene inhibidores de la proteasa (50 mmol /L de Tris (pH 7,5), 30 mmol /L de MgSO
4, 8 mmol /L de EDTA, 2 mmol /L de la TDT, y 2% de Triton X-100). Los lisados celulares se clarificaron por centrifugación a 13000 rpm a 4 ° C durante 15 minutos. Las concentraciones de proteína de los lisados celulares se midieron usando un ensayo BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). El análisis de transferencia Western se realizó utilizando 50 g extractos de proteínas de células de cáncer de control, y las células tratadas con NSC745885 se cargaron y se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio 8%. Después de la electroforesis, las proteínas se electrotransfirieron a una membrana de polivinildifluoruro (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), que luego se bloqueó con una solución de bloqueo que contiene leche en polvo 5% no grasa en PBS más 0,2% de Tween 20 (PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de completar el bloqueo, la membrana se lavó 3 veces con PBST. La membrana de PVDF se transfirió con los siguientes anticuerpos primarios en PBS: anti-XIAP; caspasa-3 (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.); y anti-actina (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la membrana se lavó de nuevo en PBST. La membrana de PVDF se incubaron con anti-ratón o anti-conejo de anticuerpos IgG peroxidasa ligada durante 1 hora, se desarrolló usando un kit de detección de quimioluminiscencia (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), y se analizaron con un sistema de imagen Las-3000 ( Fujifilm, Tokio, Japón).
xenoinjerto de tumor de ratón Modelo
Ocho semanas de edad NOD /SCID (NOD.CB17
Prkdc
SCID /J, Nacional Los ratones de laboratorio Animal Center, Taiwán) se mantuvieron en micro-aisladores en condiciones libres de patógenos específicos y alimentos estériles alimentados y agua estéril tratada con cloro. Dieciocho ratones se dividieron en 2 grupos, y cada grupo de ratones se inyectaron por vía subcutánea con 3 × 10
6 SAS. Nueve ratones en cada grupo se trataron adicionalmente con NSC745885 o doxorrubicina (2,0 mg /kg de peso corporal /d /i.p.), Y se inyectaron 9 ratones en cada grupo diariamente con un control del vehículo. NSC745885 se inyectó por primera vez en cada grupo de ratones en el día 3, antes de cualquier tumor fue palpado y continuamente administrado hasta el día 10 en ratones portadores de SAS. El tamaño de los tumores trasplantados se midió en cada tercer día mediante el uso de pinzas calibradas, y el volumen del tumor se calculó usando la siguiente fórmula: volumen (V) = 1/2 x (longitud x anchura
2). Al final del tratamiento, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron los tumores, se pesaron y se fotografiaron.
Ética declaración
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales y fueron aprobadas por Institucional Cuidado de Animales de NDMC y el empleo. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales de experimentación. (número de registro: CICUAL-11-044)
tinción inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica se realizó utilizando el método de avidina-biotina se describe de la siguiente manera. Muestras de tejido se eliminó la cera en xileno y rehidratada en alcohol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo a través de incubación en 0,01 mol /L de tampón de citrato (pH 6,0) a 95 ° C durante 40 minutos en un baño de agua. La peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno 0,3% durante 30 minutos. Las secciones fueron incubadas con suero normal de caballo 5% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear una reacción de anticuerpo no específica. Después de lavar con TBS y 0,1% de Tween 20, los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C con la caspasa-3 anti-humano y un anticuerpo XIAP (DAKO, Osaka, Japón). Después de ser enjuagados en TBS y 0,1% de Tween 20, las secciones de tejido se incubaron durante 40 minutos a temperatura ambiente con biotinilado anti-IgG de ratón, seguido de un complejo de kit Vecstatin Elite ABC avidina-biotina-peroxidasa (Laboratorios Vector, Inc., Burlingame , CA) durante 40 minutos. Posteriormente, las secciones de tejido se tiñeron con 0,003% de 3,3-diaminobenzide tetrahidrocloruro y 0,005% de peróxido de hidrógeno en 0,05 mol /L de Tris-HCl (pH 7,2), por contraste con hematoxilina de Mayer, deshidratadas y montadas.
Evaluación de la tinción inmunohistoquímica
un procedimiento inmunohistoquímico sin añadir el anticuerpo primario se utilizó como control negativo en cada caso. La intensidad de la caspasa-3 y XIAP inmunorreactividad de las células tumorales se obtuvo en 3 grupos, y estandarizado de acuerdo con el nivel de tinción como un control interno positivo en una escala de 0 (sin tinción), 1 (tinción débil), 2 (moderada tinción) y 3 (intensidad más fuerte). La distribución de la caspasa-3 y etiquetado XIAP también se midió como de acuerdo con el porcentaje de células tumorales teñidas positivamente (de 0 a 100) en el volumen total del tumor en cada sección. Para evaluar las áreas de distribución de las expresiones XIAP caspasa-3 y mayor facilidad y eficacia, el 50% fue considerado como el punto de corte. Para comparar el control y el grupo tratado con NSC745885, el porcentaje de células de caspasa-3 y XIAP-positivos en cada intensidad fue multiplicado por la intensidad correspondiente (de 0 a 3) para obtener una puntuación de inmunotinción que van desde 0 a 300.
análisis
estadística
el paquete estadístico para las Ciencias (SPSS versión 10.0 para Windows de Microsoft, Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó Social para completar el análisis de los datos recogidos. Un
t-test
y una forma de análisis de varianza (ANOVA) con la prueba post-hoc de Scheffe se utilizaron para determinar si existían relaciones significativas entre los resultados cuantitativos. Los valores de
P Hotel & lt; 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
Crecimiento Efecto inhibidor de NSC745885 en líneas celulares de cáncer oral
Para examinar la influencia del tratamiento NSC745885 sobre el carcinoma oral de células escamosas, que trató a la SAS células de cáncer oral, con diversas concentraciones de NSC745885 durante 24 horas y se observan sus cambios morfológicos usando un microscopio de contraste de fase. El tratamiento de NSC745885 a las concentraciones de 3 M a 5 M disminuyó significativamente la densidad de células cultivadas en comparación con células no tratadas (Fig. 1A). Para evaluar el efecto inhibidor del crecimiento de NSC745885, se llevaron a cabo las células SAS con diversas dosis de NSC745885, y los números de las células supervivientes se midieron a diferentes puntos de tiempo y se compararon con los de las células no tratadas mediante el ensayo de MTT. El número de células supervivientes SAS se redujeron significativamente después del tratamiento NSC745885 de maneras tiempo- y dependientes de la dosis (Fig. 1B-1D). El IC
50 de NSC745885 era 0,85 M en las células SAS después de 72 horas de tratamiento (Fig. 1D). Estos resultados indicaron que NSC745885 demostró un efecto inhibidor del crecimiento o muerte de promoción sobre las células SAS. Para detectar células apoptóticas SAS, se realizó la tinción de anexina V para evaluar la proporción de la anexina V positiva bajo diversas dosis de tratamiento NSC745885 a las 24 horas. Los porcentajes de células positivas anexina V se incrementaron de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2A-2E). Existen diferencias significativas cuando dosificación de tratamiento fue superior a 0,5 M (Fig. 2F). Este resultado indica que el tratamiento NSC745885 indujo apoptosis temprana en la celda SAS.
(A) Los cambios morfológicos en las células del SAS. Las células fueron tratadas con las dosis indicadas de NSC745885 durante 24 horas. Las dosis superiores a 3 μΜ causaron la muerte celular en células SAS. La supervivencia de NSC745885 células tratadas SAS se evaluó mediante el ensayo de MTT en diversos momentos y dosis. (B) A las 24 horas post-tratamiento, la supervivencia de las células SAS mostró una diferencia significativa en las dosis superiores a 1 mM. (C) A las 48 horas de tratamiento, a 1 M o mayor que la dosis de NSC745885 exhibió un efecto significativo anti-cáncer. (D) Después de 72 horas de tratamiento, la IC50 de NSC745885 fue de 0,85 mM en células de SAS. Survival proporción (%) indica el valor relativo en comparación con grupos de control de vehículo en SAS (n = 3; *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001;. Ns, no significativa).
SAS células fueron tratadas con (a a E) indicaron dosis de NSC745885 durante 24 horas. Las células recogidas se tiñeron con FITC conjugado con anexina V y se analizaron por citometría de flujo. (F) Los porcentajes de células positivas de anexina V en tratamiento NSC745885 se compararon con los controles del vehículo (0 m) (n = 3; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001; NS, no significativo.).
por otra parte, también se examinó el efecto inhibidor del crecimiento en otras líneas celulares de cáncer orales, incluyendo OECM-1, SCC25, y SCC4. Se encontró que NSC745885 también exhibió un efecto inhibidor del crecimiento significativa en células OECM-1 a las dosis de 1 M o superior a 24 o 48 horas después del tratamiento del fármaco (Fig. 3A y 3B). Este compuesto incluso exhibió una eficacia inhibidora mayor en las células SCC4 (Fig. 3C y 3D). Por el contrario, existen diferencias significativas sólo en 4 M en SCC25 células en 24 o 48 horas (Fig. 3E y 3F). Con el fin de investigar la influencia de NSC745885 en tejidos normales, también se evaluó el efecto citotóxico de este fármaco en células MRC-5 (una línea celular humana normal de fibroblastos de pulmón fetal) [21]. Nuestros resultados encontraron que sólo altas concentraciones de NSC745885 (4 M) afectan de manera significativa el crecimiento de células MRC-5 (Fig. 3G y 3H), lo que indica que NSC745885 exhibe una especificidad para las células cancerosas.
células de cáncer oral ( OECM-1, SCC4, y SCC25) y fibroblastos de pulmón normales MRC-5 células se trataron con NSC745885 durante 24 o 48 horas con concentraciones indicadas. La viabilidad de estas líneas celulares fueron evaluados por los resultados de MTT assay.The indicaron que las concentraciones bajas micromolares de NSC745885 inducen la muerte celular (A) SAS, pero no afectó el crecimiento de (G y H) células MRC-5 (n = 3; * , P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001; ns, no significativo) guía empresas
Tratamiento NSC745885 induce la apoptosis de las células SAS
.. para examinar el efecto de NSC745885 sobre la inducción de apoptosis en células de SAS, las células se trataron con diversas dosis de NSC745885 durante 24 horas, y los niveles de expresión de ARNm de la caspasa-3 se midieron utilizando en tiempo real de RT-PCR. Nuestro resultado indicó que la expresión de la caspasa-3 fue significativamente mayor con el tratamiento NSC745885 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4A). Los niveles de proteína de la caspasa-3 y caspasa-3 escinde en las células SAS también se determinaron mediante western blot. Hubo aumentos significativos en la caspasa-3 y caspasa-3 escinden en tratamiento con concentraciones superiores a 1 M (Fig. 4B). Los niveles de proteína relativos entre varias dosis se compararon mediante un medidor de densidad, mostrando resultados consistentes con la observación directa en el western blot (Fig. 4C y 4D). Estos datos indican que el tratamiento indujo la apoptosis NSC745885 de las células SAS
.
(A) El nivel de expresión de ARN relativo de la caspasa-3 en células SAS tratados con las dosis indicadas de NSC745885 de 24 horas se evaluó utilizando en tiempo real RT-PCR. La expresión de la caspasa-3 aumentó significativamente con el tratamiento NSC745885 de una manera dosis-dependiente. (B) La caspasa-3 niveles de proteína escindidos de caspasa-3 y en la célula tratada con SAS NSC745885 durante 48 horas se cuantificó mediante Western blot. (C) Los resultados de la transferencia de western en la caspasa-3 se evaluaron en 3 experimentos independientes y se normalizaron con β-actina (*, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001; ns., no significativa). El nivel de proteína de la caspasa-3 fue mayor en 1.5 μΜ del tratamiento NSC745885. (D) Los resultados del Western blot en caspasa-3 escinde fueron evaluados en 3 experimentos independientes (*, P & lt; 0,05;. Ns, no significativo).
NSC745885 Disminuye el ARN y la expresión de la proteína XIAP en células SAS
el ligada al X inhibidor de la proteína de la apoptosis (XIAP) se ha identificado como una proteína anti-apoptótica en células de mamífero [22]. Desempeña un papel crítico en la inhibición de la apoptosis tanto en la muerte mediada por receptor y las vías de mitocondrias mediada por [23], [24]. Un estudio reciente demostró además que XIAP es un predictor de la respuesta a la quimioterapia y el pronóstico de los pacientes con cáncer avanzado de cabeza y cuello [25]. Por lo tanto, también examinamos el efecto de NSC745885 en el gen de XIAP y la expresión de proteínas en células de cáncer oral, se trataron las células SAS de cáncer con diferentes concentraciones (0 mM, 0,5 m, 1,0 m, 1,5 m, y 2,0 M) durante 24 horas y, a continuación determina su cambio en la expresión génica mediante el uso de la Q-PCR. En comparación con las células de control, el gen XIAP expresión disminuyó significativamente con el tratamiento NSC745885 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5A). También tratamos las células de cáncer de SAS con diferentes concentraciones (0 mM, 0,5 M, 1,0 M, 1,5 M, y 2,0 M) durante 48 horas, y luego se determinaron sus cambios de expresión de proteínas mediante el uso de transferencia Western. Una disminución significativa en XIAP se observó en tratamiento con concentraciones superiores a 1 mM (Fig. 5B). Los niveles de proteína relativos entre varias dosis también se compararon mediante un medidor de densidad, mostrando resultados consistentes con la observación directa en el western blot (Fig. 5C). Estos resultados indicaron que la NSC745885 exhibió un efecto de apoptosis en las células de la promoción de SAS.
El nivel de expresión de ARN relativo de XIAP en células SAS tratados con las dosis indicadas de NSC745885 se evaluó a las 24 horas utilizando en tiempo real RT- PCR. La expresión de XIAP se redujo significativamente con el tratamiento NSC745885 de una manera dependiente de la dosis. (B) La expresión de XIAP en células tratadas con SAS NSC745885 se cuantificó mediante Western blot a las 48 horas de tratamiento. (C) Los resultados Western Blot se evaluaron en 3 experimentos independientes y se normalizaron con β-actina (*, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001). El nivel de proteína XIAP disminuyó de una manera dependiente de la dosis.
NSC745885 inhibe el crecimiento de células SAS
in vivo
Para evaluar el potencial antitumoral de NSC745885 en el cáncer oral
in vivo
, se realizó este tratamiento en un modelo de ratón portador de un tumor de xenotrasplante. Las células SAS se inocularon en ratones NOD /SCID y NSC745885 se inyectaron en el día 3 en cada grupo de ratones, antes de que se palpa cualquier tumor, y administrados diariamente hasta el día 10 en ratones portadores. El tamaño del tumor se redujo en los ratones tratados en comparación con los ratones de control portadores de tumor que fueron tratados con el vehículo solo (Fig. 6A). Los xenoinjertos SAS reducen en peso en un 23 ± 10,39% con el tratamiento NSC745885 (Fig. 6B). Los pesos corporales de los ratones control y tratados con NSC745885 También se evaluaron en días 1 y 10 después de la administración del fármaco. No existían diferencias significativas en el peso corporal del control o ratones (Fig. 6C) tratado con NSC745885. Estos resultados indicaron que el tratamiento NSC745885 a 2 mg /kg mostró un efecto anti-oral del cáncer, y este tratamiento no dio lugar a toxicidad marcada en ratones experimentales
.
(A) La célula de cáncer implantado ratones NOD /SCID se administraron con NSC745885 (2 mg /kg /d). tumores injertados se aislaron en el día 10 después de la administración del fármaco. tratamiento NSC745885 redujo significativamente el tamaño del tumor en comparación con el control del vehículo. (B) se comparó el peso medio del tumor entre el NSC745885 tratados y de los ratones portadores de tumores PBS-tratado en el día 10 (n = 9; *, P & lt; 0,01). (C) El peso corporal de los ratones experimentales no disminuyó significativamente con el tratamiento NSC745885 compara con el PBS controles tratados.
NSC745885 inducir apoptosis en células tumorales xenoinjertado
Para observar directamente la efecto apoptótico de NSC745885 en las células tumorales
in vivo
, se realizó la tinción inmunohistoquímica para evaluar el estado de la proteína caspasa-3 de apoptosis en xenoinjertos. Después de 10 días del trasplante, se eliminaron los xenoinjertos, medidos para el tamaño, y se examinaron con HE y tinción inmunohistoquímica. Los tumores de los ratones tratados con NSC745885 exhiben daño tisular en parte tumor (Fig. 7A) y una notablemente mayor recuento de células apoptóticas (caspasa-3 de células positivas) en comparación con el control de los tumores (Fig. 7B). También se evaluó la expresión de XIAP en los xenoinjertos. El resultado reveló que los ratones tratados con NSC745885 exhibieron un recuento marcadamente inferior de células anti-apoptóticos (células XIAP positivo), en comparación con los tumores de control (Fig. 7C). La expresión puntuaciones de los 3 caspasa-células positivas fueron 1,21 ± 0,04 y 2,87 ± 0,03 en el grupo control y el grupo tratado con NSC745885, respectivamente (Fig. 7D). La expresión decenas de las células XIAP positivos fueron 2,24 ± 0,03 y 1,16 ± 0,02 en el grupo control y el grupo tratado con NSC745885, respectivamente (Fig. 7E). En consecuencia, nuestros resultados demostraron que NSC745885 reduce la proliferación de células de cáncer de SAS, y ejercieron efecto antitumoral
in vivo
través de la inducción de la apoptosis
.
(A) Los cambios histológicos en los injertos tumorales se evaluaron mediante la tinción de HE. Comparando el control PBS con los grupos tratados con NSC745885 reveló una marcada necrosis del tumor en el grupo tratado con NSC745885. (B) El nivel de expresión de la caspasa-3 en los injertos tumorales aisladas se evaluaron utilizando tinción inmunohistoquímica. (C) El nivel de expresión de XIAP en los injertos tumorales aisladas También se evaluaron mediante la tinción inmunohistoquímica. La expresión anota para la caspasa-3 (D) y XIAP (E) se cuantificaron, revelando un aumento en la expresión de la caspasa-3 con el tratamiento NSC745885 (P & lt; 0,05). Por el contrario, la expresión de XIAP en los injertos de tumor disminuyó con este tratamiento (P & lt; 0,05).
Efectos de NSC745885 sobre el peso corporal en ratones
Para determinar si las causas de tratamiento NSC745885 pérdida de peso corporal, que supervisa la alteración del peso corporal en los ratones experimentales. Un efecto citotóxico significativo de NSC745885 se reveló con la administración diaria de NOD /SCID a una dosis de 40 mg /kg /d (Fig. 8A). El peso corporal de los ratones tratados con la dosis más alta se redujo significativamente, y todos los ratones murieron por día 14. En este estudio, se encontró que la dosis máxima tolerada de NSC745885 en ratones fue de 40 mg /kg /d. Para determinar si el tratamiento NSC745885 creado citotoxicidad en los órganos de los ratones experimentales, los bazos, los pulmones, hígados y corazones fueron cosechadas de los ratones tratados con PBS y tratados con NSC745885 en día 14 y se evaluaron mediante un ensayo histológico. No existieron diferencias obvias en los órganos de los ratones tratados con PBS o con tratamiento NSC745885 (Figs. 8B-8E). Este resultado indicó que el tratamiento diario de NSC745885 a 2,0 mg /kg /d por vía i.p. provocado ningún efecto adverso marcadas en los ratones.
ratones NOD (A) /SCID se trataron con PBS o indicadas dosis diarias de NSC745885, y se midieron los pesos corporales de estos ratones. La influencia del tratamiento NSC745885 en los órganos de los ratones experimentales se evaluó mediante un ensayo histológico y tinción HE en el día 14. No hay diferencias obvias existían en el bazo (B), (C) pulmón, (D) del hígado, o (E) corazón de los ratones tratados con PBS y tratados con NSC745885.
las comparaciones de la seguridad y la eficiencia anti-tumoral entre NSC745885 y doxorrubicina
Para comparar la seguridad de NSC745885 con doxorrubicina, nos NOD tratados /ratones SCID con estos dos compuestos a 2 mg /kg /d ip durante 10 días. La supervivencia y el peso corporal de los ratones experimentales se controlaron diariamente. Nuestros resultados mostraron que 50% de los ratones tratados con doxorubicina estaban muertos en el día 11 (Fig. 9A). Por el contrario, todos los ratones tratados con NSC745885 sobrevivían en el día 11 (Fig. 9A). Hay significativa disminución en los pesos corporales de los ratones tratados con doxorrubicina en comparación con los grupos tratados con NSC745885 (Fig. 9B). Estos resultados indicaron que NSC745885 exhibió una seguridad mayor que la doxorrubicina. Además, también comparó la eficacia anti-tumor entre estos dos fármacos mediante la medición de los pesos de los tumores en el modelo de xenoinjerto portador de un tumor. ratones NOD /SCID se inocularon con células de SAS y se trataron con 2 mg /kg /d por vía i.p. de doxorrubicina o NSC745885 desde el día 3 al día 10 de la inoculación de células de correos. Los tumores se recogieron en el día 11 (Fig. 9C, n = 9) y pesos de los tumores se midieron.