Extracto
El neuroblastoma es el más común de cáncer sólido craneal extra de la infancia. A pesar de la escalada de los regímenes de tratamiento, una minoría significativa de los pacientes mueren de la enfermedad. Disialogangliósido (GD2) se expresa constantemente en altos niveles en los tumores de neuroblastoma, que han sido dirigidas con un cierto éxito utilizando anticuerpos monoclonales terapéuticos. GD2 también se expresa en una gama de otros tipos de cáncer, pero con la excepción de algunos nervios periféricos es en gran parte ausente de los tejidos no transformadas. Los receptores quiméricos antígeno (CAR) son proteínas de tipo artificial I que injertan la especificidad de un anticuerpo monoclonal en una célula T. Los datos clínicos con diseños coche temprano dirigidos contra GD2 han mostrado alguna promesa en el neuroblastoma. A continuación, describimos un casete retroviral CAR GD2-focalización, que ha sido optimizado para la persistencia de células T CAR, eficacia y seguridad
Visto:. Thomas S, Straathof K, N Himoudi, Anderson J, M Pule ( 2016) Un Optimized GD2-Targeting retroviral cassette para aumentar la seguridad de Terapia celular y más potente del neuroblastoma y otros cánceres. PLoS ONE 11 (3): e0152196. doi: 10.1371 /journal.pone.0152196
Editor: Sophia N. Karagiannis, el Kings College de Londres, Reino Unido
Recibido: 27 de enero de 2016; Aceptado: 10 Marzo de 2016; Publicado: 31 Marzo 2016
Copyright: © 2016 Thomas et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. el estudio fue financiado por la Sociedad neuroblastoma ahora re-etiquetado como "el neuroblastoma Reino Unido". Esta pequeña organización benéfica proporcionó una subvención de 133.000 £ en 2005 para un proyecto titulado "Ingeniería genética de las células T para inmunoterapia adoptiva del neuroblastoma". Martin Pule está soportado por el Centro de Investigación Biomédica Reino Unido INDH y el Wellcome Trust. John Anderson se apoya en el Hospital Great Ormond Street, Centro de Investigación Biomédica y la Caridad del Hospital de Niños Great Ormond Street. Karin Straathof se apoya en el Hospital Great Ormond Street, Centro de Investigación Biomédica y el Wellcome Trust. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. MP ha recibido fondos de investigación por contrato de Cellectis. Él es dueño de acciones y recibe aporte sueldo de Autolus Ltd. Él es un inventor de patentes registradas por UCLB y ha recibido y puede recibir regalías de los mismos. Ha recibido honorarios de Roche y Amgen por hablar. JA y ST poseen población a partir Autolos Ltd. Ellos son los inventores de las patentes presentadas por UCLB y pueden recibir regalías del mismo. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El neuroblastoma aproximadamente el 15% de las muertes por cáncer en los niños [1]. A pesar marcada intensificación de la terapia, menos del 40% de los pacientes de alto riesgo son los supervivientes a largo plazo, con la quimioterapia y la radioterapia y la resistencia recaídas tardías es la característica de fallo [2] tratamiento. Disialogangliósido (GD2), un antígeno de superficie glicolípido que es ubicua y abundante en células de neuroblastoma, así como tener la expresión específica del cáncer en un número de adultos y pediátricos tumores malignos [3], es un objetivo ideal para la inmunoterapia [4]. De hecho, los anticuerpos monoclonales anti-GD2 actualmente forman parte del tratamiento estándar para alta neuroblastoma de riesgo, así como su eficacia y perfil de toxicidad es bien establecida [3,5]
Administración de las células T específicas del tumor. (Adoptiva inmunoterapia) ha demostrado ser un tratamiento eficaz del cáncer de Epstein Barr linfomas impulsado por virus [6] y melanoma [7] con respuestas en la enfermedad resistente voluminoso. Sin embargo, no ha sido posible generar neuroblastoma células T específicas utilizando los métodos tradicionales de selección y expansión. Quimérico antígeno receptores (CARs) se puede construir mediante la conexión de la región variable de cadena única (scFv) a partir de un anticuerpo monoclonal a los dominios de señalización intracelular. GD2 de metas de las CAR, por tanto, nos proporcionan un método alternativo para la generación de células T específicas de neuroblastoma mediante ingeniería genética. La terapia CAR GD2 puede resultar en la mejora de la respuesta sobre la terapia de mAb debido a una persistente y rechazo dinámica de GD2-tumor que expresa.
Un estudio fase I clínica de CAR transducidas células T anti-GD2 en pacientes con neuroblastoma de alto riesgo en recaída informado alguna eficacia [8]. Una posible limitación del estudio fue que el uso de una primera generación de CAR, proporcionando sólo señales CD3 ITAM, que pueden haber dado lugar a mala persistencia y expansión. Un creciente cuerpo de datos clínicos de CD19 coche en células B malignas, así como un estudio de doble marcaje [9] sugieren que los coches que proporcionan señales coestimuladoras adicionales resultan en una mejor persistencia y eficacia. A continuación, describimos nuestros esfuerzos para construir un cassette más potente pero seguro GD2-orientación para su uso contra el neuroblastoma, el cual utiliza un descritas previamente tercera generación endodominio [10]. El objetivo de este trabajo es la optimización de la arquitectura CAR restante y casete de expresión para la eficacia y la seguridad máxima
.
El CAR investigado en el estudio reportado por Pule et al usaron un scFv derivado de 14-18, un mAb cuales en una forma quimérica está actualmente en uso clínico regular. Por tanto, hemos utilizado un dominio de dirección de una familia anti-GD2 mAb diferente para evitar anti-idiotipo rechazo /activación de las células T CAR. Para reducir las posibilidades de rechazo, una versión humanizada de la CAR se puso a prueba, y se llevó a cabo la optimización iterativa de la arquitectura CAR. La terapia anti-GD2 mAb se asocia con neurotoxicidad periférica. Mientras que el estudio inicial CAR GD2 no informó este [8], la preocupación persiste como cada vez más potentes CAR se introducen en la clínica. En previsión de esta eventualidad, se co-expresó CAR con el gen iCasp9 suicidio [11] y optimizado un casete bicistrónico retroviral para mantener la co-expresión del transgen y la salida consistente. La construcción final se ensayó in vivo. Hemos generado un CAR GD2 focalización casete retroviral optimizado para la eficacia y la seguridad.
Resultados
coche con scFv humanizado da expresión similar y aumento de la liberación de citoquinas y la expansión de las células T
KM8138 es un anticuerpo totalmente humanizado monoclonal anti-GD2 construida mediante el injerto de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la murino anti-GD2 anticuerpo KM666 asirse a compatibles humana V
H y V
regiones L marco [12] el epítopo. La secuencia de scFv humano resultante difiere de la murino en 31 residuos en las regiones marco fuera de las CDRs. anticuerpo murino scFv utilizados en los automóviles GD2 anteriormente descritos pueden ser un objetivo para el rechazo inmune ya sea debido a anti-idiotipo (desde mAbs terapéuticos en uso clínico actual se derivan del mismo clon), o de anticuerpos anti-ratón 14,18-deriva. Por lo tanto, se derivó un coche basado en el anticuerpo humanizado KM8138 [12]. Para determinar las consecuencias de la utilización de un scFv humanizado, también crear un automóvil derivado del anticuerpo de ratón parental por lo tanto nos generó un par de anti-GD2 coches idénticos excepto por sus scFv, que se derivan de un anticuerpo murino anti-GD2 mAb KM666, o su homólogo humanizado KM8138 [12]. Los coches tenían IgG1 espaciadores bisagra-Fc humana, el dominio transmembrana CD28 y el CD28-endodominio OX40-Zeta (figura 1A). Inicialmente se trató de comparar la expresión y función de este coche humanizado (HuK666) con su homólogo murino (MuK666). células T humanas donante normal se transdujeron con títulos iguales de codificación vector retroviral para cada receptor. La expresión en superficie de cada vehículo determinada por citometría de flujo con un anticuerpo policlonal anti-Fc fue idéntico (Figura 1B). La media de intensidad de fluorescencia (MFI) de las células T transducidas no fue diferente entre las CAR y humanizados murinos. Las células T transducidas fueron distribuidas en 4 horas ensayo de liberación de cromo CD56-agotado células T que expresan bien CAR demostró una destrucción comparable del Lan-1 línea celular de neuroblastoma que devengan GD2 y una ausencia equivalente de actividad contra la línea celular de osteosarcoma A204 que carece de expresión de GD2. Ni las células no transducidas T (NT) ni células T transducidas con un CAR irrelevante dirigido contra CD19 muestran ninguna citotoxicidad para cualquiera de las líneas de células (Fig 1C) Ambos receptores eran capaces de estimular la proliferación de células T transducidas como pozos como la secreción de IL2 y IFN-g en respuesta a la LAN1 pero no A204 (Fig 1D). No hubo diferencia significativa entre huK666 y muK666 las CAR para la proliferación (Figura 1D), la liberación de interferón γ (Figura 1E), o la interleuquina (IL-2) Release 2 (figura 1F) aunque hubo una tendencia no significativa para los tres hacia una mayor función de la CAR huK666.
(a) Comparación de las secuencias de aminoácidos de huK666 y muK666 scFv se comparan. regiones determinantes de complementariedad se muestran en rojo. La secuencia de engarce se muestra en verde. A la derecha, las arquitecturas de los coches generan para la comparación inicial de huK666 con muK666. Ambos difieren sólo en los scFv utilizados sean bien las secuencias muK666 murino original, o la humanizado (CDR injertadas) huK666. De lo contrario, las CAR forman parte de una IgG1 humana bisagra-CH2-CH3 espaciador, un dominio TM derivada de CD28 y un compuesto que comprende endodominio de fusiones entre endodomains de CD28, OX40 y CD3-Zeta. (B) Estabilidad de muK666 vs huK666 las CAR. Células T de 5 donantes fueron transducidas con títulos iguales de codificación sobrenadante retroviral para muK666 o huK666 las CAR. expresión CAR se detectó mediante anti-humano-Fc de anticuerpos policlonales. MFI era idéntico en ambos constructos. Un ejemplo representativo se muestra con NT (verde), muK666 (azul) y huK666 (rojo) histogramas superpuesta. Estas células T CAR fueron desafiados con LAN-1 (una línea celular de neuroblastoma que expresa GD2) y A204 (una línea celular de rabdomiosarcoma que es GD2 negativo). La citotoxicidad se muestra en (c), la proliferación en el día 7 se muestra en (d), IFN-γ en (e) y la liberación de IL-2 en (f). Los datos muestran como medias +/- SEM de 6 experimentos independientes con diferentes donantes.
espaciador que comprende de IgG1 Fc de dominio resultados en la matanza y la liberación de citoquinas óptima
coche de la función puede ser influenciada por selección del dominio espaciador [13-15]. Además de la CAR basado en huK666 descrito anteriormente que contienen la IgG1 dominio bisagra-CH2-CH3 humano como separador, se generaron variantes adicionales CAR huK666 en el que la región espaciadora se compone de la bisagra sola, la bisagra unida al tallo de CD8a o la CD8a tallo solo (Fig 2A). La selección de estos separadores se basa en la consideración tamaño, con bisagra de IgG1-solo ser un espaciador corto, intermedio y CD8 tallo de Fc de IgG1 de ser un espaciador largo. También se postula que el tallo CD8 puede no permitir la articulación suficiente del scFv y por lo tanto, hemos generado una variante adicional con la bisagra de IgG1 conectado al tallo CD8. Para permitir la fácil detección de CAR, marcamos el huK666 con un marcador HA amino-terminal, insertada entre la señal y el péptido-VH. Además, para controlar la variación en la expresión del vector, se clonó el pie aftosa secuencia de la enfermedad 2A TAV (2ATaV) en el marco con el extremo carboxi-terminal de la CAR, que a su vez fue clonado en el marco de CD34 truncado (dCD34ngg). Por lo tanto, hemos podido detectar la expresión del coche con respecto al vector de expresión mediante tinción de HA y anti-CD34.
huK666 varios coches fueron clonados en un formato idéntico con lo que el scFv fue etiquetado con una etiqueta HA, y el coche fue co -expresada con una secuencia de la FA-2A truncado con CD34 truncado. El casete de expresión se muestra en (a) y los dibujos animados de estos formatos se muestran en (b). Co-expresión de CAR (HA) y el gen marcador CD34 de los diferentes casetes. Las cuatro regiones de bisagra se compararon en términos de citotoxicidad (c) (objetivo LAN1 = GD2 positivo y A204 = objetivo negativo GD2), la secreción de IFN-γ (d), IL-2 (e) y la proliferación específica de la diana (f). Los datos muestran como medias +/- SEM de 4 experimentos independientes con diferentes donantes.
Las células T humanas primarias fueron transducidas con igual título de sobrenadante de estas construcciones y se tiñeron con anticuerpos anti-VHA y anti-CD34. Un análisis de citometría de flujo representativo de esta tinción se muestra en la figura 2B. Bisagra-CH2-CH3, bisagra-tallo y su expresión espaciadores coches eran idénticas, mientras que la bisagra independiente espaciador CAR resultó en una reducción tinción de HA (Figura 2B). Esto podría ser debido a la estabilidad reducida, o a la reducción del acceso a la HA-tag en este formato. experimentos funcionales se realizaron lado, y hay claras diferencias en las capacidades de las variantes espaciadores para mediar en la citotoxicidad, la liberación de citoquinas y la proliferación de las células en respuesta a Lan-1. PBMCs transducidas con cualquiera de los coches espaciador variantes muestran citotoxicidad hacia las células Lan-1; sin embargo, hubo diferencias significativas entre la eficacia en función de separador. CAR que expresan el espaciador CH2-CH3 fueron significativamente más eficaz que la bisagra /tallo (P = 0,009) y la bisagra (p = 0,0003), aunque la tendencia a matar reforzada en comparación con el tallo no fue significativa. Ninguno de los coches variantes espaciadores mediado ninguna muerte de las células A204 negativas GD2 (Figura 2C). También se observaron diferencias en la capacidad de las otras variantes del espaciador para estimular la producción de IFN-γ o IL-2 tras cultivo con células LAN1. CH2CH3 spacer indujo consistentemente tanto de las citoquinas, y fue significativamente mejor que la bisagra para la producción de IFN-γ (p & lt; 0,003, figura 2D), y significativamente mejor que la bisagra /tallo (p & lt; 0,03) y la bisagra (p & lt; 0,006) para IL producción -2 (Fig 2E). Con la excepción de la variante bisagra todos los receptores parecían comparables en términos de su capacidad para estimular la proliferación celular en respuesta a GD2-cojinete LAN1 pesar de la variación sustancial entre los donantes (Fig 2F). las células T que expresan la variante bisagra mostraron poca proliferación detectable, lo que es consistente con la disminución de la capacidad de este receptor para mediar en la liberación de IL-2. En general, la región Fc de IgG que parecía ser el espaciador óptima para el CAR GD2 y que utiliza este formato receptor en optimizaciones posteriores.
Enhanced coche de la función mediante la modificación del espaciador
Una función normal del CH2 región -CH3 de la región Fc de las inmunoglobulinas es la unión de los receptores Fc sobre las células efectoras inmunes. El espaciador IgG1 CH2-CH3 humano usado en la CAR GD2 es el ligando natural para alta afinidad Fc? RI (CD64) expresado en efectores innatos como los macrófagos y monocitos. Por tanto, existe un riesgo teórico de acoplamiento de CAR que expresan las células T con las células mieloides por la unión de CD64 resultante en tanto fuera de la toxicidad de destino de las células mieloides, y la desviación de las células T CAR de su función efectora deseada. De hecho, este fenómeno de las CAR que contienen separadores IgG1 CH2-CH3 ha sido reportado anteriormente [16,17]. Los aminoácidos críticos para el reconocimiento IgG1 residen en el dominio CH2 (PELLGG y motivos ISR [18]), y Hombach et al han demostrado que la sustitución de estos aminoácidos clave con los aminoácidos correspondientes de IgG2 en el contexto del diseño de automóviles, no tiene efecto inhibidor in vitro de un CD30 orientación CAR, pero impide de lisis objetivo de las células THP1 CD64 que expresan [16]. Por lo tanto, la mutación de la PELLGG y residuos ISR como por el enfoque de Hombach et al (Figura 3A) y la expresión equivalente demostrado en las células T del vehículo que transportaba la mutado (abreviado a PVAA) CAR (Figura 3B). El CAR-mutado PVAA conservó la función efectora del antígeno específico contra las células SupT1 ingeniería genética para expresar GD2 a niveles brillantes (Figura 3C). Mientras que el automóvil en el que PVAA-zadas GD2 células que expresan LAN1 con eficacia equivalente a la de tipo salvaje, el coche PVAA había reducido significativamente fuera citolisis diana contra CD64 que expresan las células THP1 (p = 0,0005 figura 3D). Del mismo modo, mientras que el co-cultivo de las células T WT-coche con células THP1 resultado en IL1β detectable en el sobrenadante del medio de 886pg /ml, esto se redujo a valores que no estaban hechos ya mencionados con PVAA que contiene CAR (figura 3E). Por lo tanto, la incorporación de una mutación para evitar la unión de alta afinidad FcyR evita la toxicidad de destino por el GD2-CAR.
(a) la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje (arriba) y mutado CH2 (PVAA) regiones responsables para FcyR unión. (B) de flujo de la tinción con anticuerpo anti-Fc para mostrar nivel comparable de expresión de receptor con o sin la mutación PVAA. Coches idénticos con y sin PVAA se compararon al lado del otro en cuanto a la citotoxicidad contra GD2 diseñados SupT1 y GD2 tipo salvaje negativo SipT1 células (c), la citotoxicidad contra las células lan1 positivo GD2 y células THP-1 positivos FcRγ (d), e IL 1β liberación de cultivo con células THP-1 (e). Los datos que se muestran como medias +/- SEM de 4 experimentos independientes con diferentes donantes.
Optimización de la co-expresión con el gen suicida
A pesar de proporcionar un tratamiento potencial para el cáncer potente, CAR- las células T tienen la capacidad de mediar eventos adversos potencialmente fatales. GD2 segmentación, puede conducir a la diana sobre la toxicidad fuera de tumor causado por el sistema nervioso central y periférico expresión GD2. Un medio para borrar de forma selectiva las células T auto en la cara de toxicidad inaceptable es deseable. Para lograr esto, se co-expresó la caspasa 9 inducible (iCasp9) gen suicida [11]. Co-expresión de CAR y iCasp9 estaba usando el auto-escisión de la FA-2A como secuencia de TAV
13. Esto da como resultado obligado de 1: 1 co-expresión de CAR con el gen suicida. Dado que la expresión retrovirales resultados en una distribución normal de la intensidad de la expresión, es una consideración escape de bajo nivel iCasp9 expresando células T CAR. Además, los altos niveles de iCasp9 pueden ser basalmente tóxico. Las células que expresan iCasp9 de bajo nivel pueden sobrevivir a la activación de genes suicidas, por lo que trató de conseguir la expresión luminosa homogénea de CAR y iCasp9, a pesar de la carga de la transcripción adicional de que el 1,5 kb iCasp añade al vector, y para demostrar que iCasp9 no era basales tóxicos en alcanzados los niveles de expresión. Hemos modificado el vector y marcos de lectura abierta de la siguiente manera: Vector 3 'LTR U3 se modificó para incluir la cromatina aislante de pollo β-globina [19]. La región de unión en andamio del gen de interferón-β humano se insertó en el 3'UTR [20] (Fig 4A). También generó construcciones con dos modificaciones juntos pero los títulos eran demasiado bajos para ser utilizable y no nos pusieron a prueba (datos no mostrados). Además, el marco de lectura abierto se codones optimizados. Finalmente, para asegurar que iCasp9 no dio lugar a toxicidad basal en los niveles de expresión de alto generamos un mutante no funcional con la cisteína del sitio activo mutado a serina (Fig 4A). PBMCs fueron transducidas con títulos iguales de sobrenadante retroviral para cada receptor, y la expresión se monitorizó 72 horas después de la transducción mediante citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia media de cada variante fusionada a la iCasp9 no funcional es ligeramente mayor que el receptor correspondiente no optimizado vinculado a un iCasp9 funcional, lo que sugiere células altamente expresan pueden perderse debido a inapropiado, la activación no específica de la iCasp9 (Fig 4B y 4C)
(a) se compararon nueve diferentes casetes de expresión:. Tres diferentes vectores retrovirales fueron generados-de tipo salvaje SFG, SFG con la región andamio-apego (SAR) insertados en el 3'UTR y SFG con CHS4 insertado en la región 3 'LTR U3. (Vectores retrovirales tanto con SAR y CHS4 se generaron pero producen títulos muy bajo vectoriales y no se compararon más); En estos vectores retrovirales se insertaron las construcciones de tipo salvaje CAR-iCasp9-2A huK666 y iCasp9 se insertaron en 3 formas; codones optimizados, de tipo salvaje, y con el dominio catalítico mutado. (B) Histogrammes en el día 3 después de transducción (líneas azules). Las células T cultivadas superpuestos en 20 nM CID se muestran en rojo. Gráficos de barras de MFI de las células en ausencia de CID en el día 3 (c) y el día (d) 7. Los datos se muestran como medias +/- SEM de 5 experimentos independientes con diferentes donantes.
Para evaluar los efectos de las modificaciones del vector durante periodos más prolongados, PBMCs transducidas se cultivaron a continuación para un total de 7 días. Durante la duración de este periodo de cultivo hemos observado disminución del diferencial en los niveles de expresión entre los 3 grupos: el no modificado (sin SAR /CHS) y los receptores de CHS mostraron una disminución sustancial de la IMF que variaba entre 22.4-49.5% en comparación con el día 3 IMF (Fig 4D en comparación con la figura 4C). Esta disminución de la expresión que se esperaba y se debe probablemente a la capacidad de respuesta de la MoMLV LTR de estado de activación de células T. Después de prolongada cultura 7 días la IMF de vectores que contienen SAR fue significativamente mayor que umodified. Esta disminución en la expresión fue significativamente menos marcada para los receptores que contienen SAR (P & lt; 0,02 para la no codón optimizado; véase la Figura 4D) lo que sugiere que la RAE está funcionando para evitar la baja regulación de las CAR GD2. El fenómeno de la menor de las IFM en el día 7 en comparación con el día 3 se observa igualmente en vectores que contienen o no contienen la mutación C a S lo que sugiere que la activación no específica del gen suicida no es responsable de este silenciamiento.
Siguiendo incubación con CID los niveles de expresión de CAR en vivo PBMC se evaluó mediante citometría de flujo (figura 4B). Como era de esperar los receptores mutantes C-a-S eran refractarios al tratamiento CID. Ninguno de los dos codón-optimización ni la inclusión de la secuencia influido en la respuesta SAR CID, pero la secuencia CHS4 parecían dar lugar a mayores niveles de células T transducidas escapan tratamiento CID (figura 4B). Escape de la activación del gen suicida parecía ser observado predominantemente el CAR-expresadores bajos y esto era consistente con la expresión general más bajo observado por los receptores CHS4. Mientras que un número muy pequeño de células T que expresan CAR residuales fueron detectables en los grupos no modificados y SAR después del tratamiento CID, no está claro si las células conservan la expresión de CAR suficiente para mostrar actividad.
Por lo tanto, en términos de expresión , la estabilidad y la respuesta a la CID, la SAR que contiene receptor de codones optimizados (iCasp-Huk) realizan el mejor y este receptor se comparó con el CAR HuK666 original para su capacidad para mediar la citotoxicidad y la liberación de citoquinas en respuesta a las células LAN1 (Fig 5 ). PBMCs transducidas se incubaron durante 72 horas en ausencia o presencia de CID 10 nm y luego co-cultivadas con células Lan-1 o A204. Un ejemplo de la expresión de estos coches en presencia y ausencia de CID se muestra en la figura 5A. Los niveles de expresión HuK666-iCasp9 fueron eliminados eficazmente por la inducción de la iCasp9 (Figura 5A).
El casete optimizado-codón SAR fue tomada y aún más en comparación con el casete original sin iCasp9. (A) La expresión de la CAR se mantuvo sin cambios. El agotamiento se muestra por FACS después de la adición del CID. La función de cassettes con y sin iCasp9 fueron evaluados por (b) la liberación Killing (c) IFN-γ y la liberación (d) IL-2. Los datos muestran como medias +/- SEM de 4 experimentos independientes con diferentes donantes.
PBMCs
HuK666 transducidas muestran niveles comparables de la citotoxicidad y la liberación de citoquinas en respuesta a las células lan1 independientemente de la cultura previa con CID. En ausencia de CID el constructo HuK666-iCasp9 a cabo, así como el receptor que carece del gen suicida. Sin embargo, un 72-hr pre-tratamiento con CID suprimió la liberación de citoquinas por (Fig 5C y 5D) y la citotoxicidad de (Fig 5B) de las células T que expresan Huk-iCasp9.
In vivo
función de casete iCasp9-CAR
para confirmar que la eficacia y la especificidad del gen CAR y el suicidio optimizado co-expresada observado in vitro era probable que equivale a la eficacia clínica se evaluó el casete iCasp9-CAR en un inmunocompetentes modelo de ratón. El antígeno GD2 es un gangliósido de estructura química idéntica entre las especies de modo que el ScFv huK666 ScFv se une GD2 igualmente en el ratón y las células humanas. Hicimos uso de la línea celular de cáncer de colon CT26 débilmente inmunogénica, que forma consistentemente tumores por vía subcutánea en ratones Balb /c. Las células CT26 fueron transducidas con un gammaretrovirus codifica GD2 y GD3 sintasas, y un clon (número 7) con la expresión brillante GD2 fue seleccionado para el análisis de la orientación GD2 por el GD2-CAR en un modelo inmunocompetentes (S1 figura). CT26-clon 7 células inducidas liberación específica de IL-2 e IFN-γ siguientes co-cultivo con esplenocitos transducidas con GD2-CAR (S2 figura). In vivo, CT26-GD2 clon 7 derivadas de tumores se eliminan de forma eficaz por los esplenocitos CAR transducidas en contraste con las células CT26 negativos GD2 que crecieron a la misma velocidad que los tumores en ratones tratados con esplenocitos no transducidas (Fig 6).
ratones Balb-C se innocultaed con 1x10
6 CT26 o células CT26-GD2 mezclado en matrigel. 10 días después de la inoculación del tumor, los ratones fueron sub-letalmente inyección del tumor irradiado (200 rads) y dos semanas después, los ratones fueron trasplantados por vía intravenosa con un total de 1.5x10
6 esplenocitos transducidas o controles no transducidas por inyección en vena de cola. tipo salvaje CT26 se utilizaron como controles negativos de antígeno (a, c) mientras que los tumores CT26-GD2 tratados con células T no transducidas (b) no retroceden mientras que los tumores CT26-GD2 desafiados con células T CAR retrocedido. Cada línea representa un ratón.
Discusión
alta neuroblastoma de riesgo representa un problema clínico sin resolver. tumores de neuroblastoma expresan la diasialoganglioside GD2 abundante y ubicua. GD2 es uno de los pocos antígenos de tumores sólidos con relativamente poca expresión en otros tejidos, específicamente la expresión nivel GD2-bajo en los nervios periféricos, haciendo GD2 un objetivo atractivo para la terapia CAR. Un estudio temprana de células T CAR GD2 se llevó a cabo el que se comparó el EBV-CTL y las células T de sangre periférica transducidas con los coches en el mismo paciente. Las respuestas fueron transitorias y sólo la persistencia de bajo nivel de CAR células T se observó [8].
Una posible limitación del estudio fue que el uso de un receptor de primera generación [21], que sólo transmite la señal inmunológica al 1 ligación. Vehículos de segunda generación se han descrito, que también transmiten señales co-estimuladoras [22]. Una comparación de doble marcado de las CAR primera y segunda generación sugiere la superioridad de esta última [9]. De hecho un creciente cuerpo de datos clínicos con los coches de segunda generación destinados a la terapia de células T CD19 CAR en tumores malignos de células B ha confirmado la superioridad de las CAR de segunda generación [23,24]. Aquí, incorporamos un endodominio que transmite dos señales coestimuladoras, uno por cada uno de la familia superfamilia correceptor Ig (CD28) y la familia correceptor familia TNF (OX40).
El aumento de la experiencia clínica ha demostrado que los coches que incorpora dominios de unión derivados a partir de anticuerpos murinos pueden provocar reacciones graves en los pacientes, que pueden contribuir a una mayor liquidación de las células T transducidas y la activación del coche con una toxicidad considerable [25,26]. Esta eventualidad es más acuciante en el neuroblastoma: desde la terapia anti-GD2 mAb es ahora estándar de atención, muchos pacientes han estado expuestos a la quimérica 14-18 mAb. Cabe destacar que estos anticuerpos terapéuticos se derivan de un mismo clon ya que el coche utilizado por Pule et al. Las CAR que contienen scFv basado en 14.18 se han demostrado recientemente para llevar a la tónica de señalización suficiente para la función [27] inhibe. Por lo tanto, hemos intentado hacer frente a la posibilidad de que tanto anti-idiotipo y anti-ratón de respuesta de marco preformada y CAR-inducida. Por ello, utilizó una familia aglutinante diferente, que era humanizado.
La función del receptor y la selección del espaciador correcto puede ser importante para la eficacia clínica [13,14,21,28]. Huéspedes et al han investigado cómo la secuencia de la función de espaciador y CAR parece estar relacionado con la distancia del sitio de unión del receptor en el antígeno diana de la membrana de la célula diana [13]. Los autores observaron que en el caso de NCAM y 5T4, los antígenos en la que el epítopo CAR se encuentra adyacente a la membrana, sus coches afines requiere la presencia de un espaciador Fc para un funcionamiento óptimo. La eliminación de este espaciador dio lugar a la disminución de la citotoxicidad y IFN-γ secreción a partir de células T transducidas en respuesta a las células tumorales que expresan el antígeno. Lo contrario parece cierto en el caso de CD19 y CEA, ambos antígenos en la que el sitio de unión de CAR-está más lejos de la membrana. CARs dirigidos contra estos dos últimos antígenos muestra reducida de respuesta de IFN-γ si contenían el espaciador Fc, aunque la citotoxicidad no se vio afectada. Hudecek et al en los modelos de ROR-1 y CD19 han sugerido que la longitud y la flexibilidad de espaciador óptima también depende de la localización de un epítopo diana en relación a la superficie celular [14,28].
Hemos observado que la alteración del espaciador en nuestro coche GD2 dio lugar a alteraciones en el potencial citotóxico de citoquinas y la secreción de PBMC transducidas. En general, el espaciador Fc proporcionado la respuesta óptima, mientras que las dos variantes de los receptores que contienen el tallo CD8 apareció sub-óptima en términos de la citotoxicidad y la liberación de IL-2, aunque las PBMCs transducidas-tallo-variante se observaron consistentemente para secretar niveles superiores de IFN-γ a estimulación de PBMCs transducidas con la variante de Fc. A falta de correlación entre la citotoxicidad, la proliferación y la secreción de citocinas para ciertas construcciones de receptor se ha señalado anteriormente [13] [29,30]. los niveles de transducción fueron consistentemente igual para todas las variantes espaciador y esto no parece dar cuenta de las diferencias observadas en función, excepto en el caso de la variante de la bisagra, que se expresó débilmente en la superficie celular de las células transducidas, y muestran poca o ninguna reactividad contra tumor células en cualquiera de los parámetros medidos. Esto puede ser debido al acceso limitado del anticuerpo anti-HA detectar a la etiqueta HA en el receptor de bisagra o a una disminución de la estabilidad en la superficie celular, aunque esta configuración receptor se ha observado para ser funcionales en otros sistemas [13,21]. La incorporación de la región bisagra en la variante tallo apareció negativa para influir en la función del receptor y la secreción de citoquinas mejorado en comparación con el tallo solo. Se ha postulado que la característica clave de la región espaciadora para determinar la función es la flexibilidad, permitiendo que el dominio de unión para acceder al antígeno diana. Una posibilidad es que la inclusión del segmento de bisagra puede disminuir la flexibilidad receptor y que esto puede superar cualquier beneficio derivado de un ligero aumento en la longitud receptor.
En última instancia, selecciona la variante de Fc-espaciador como óptima en nuestras manos y tomó esto adelante para una mayor investigación. Sin embargo, una cuestión que se ha observado con los coches que contiene el Fc de IgG es la unión de esta región a los receptores Fc gamma (FcyR) en las células del sistema inmune innato dando como resultado apropiado fuera del objetivo activación de las células T transducidas [16,17].