Extracto
Un rs4245739 funcional A & gt; C polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) localizar en el
MDM4
región 3 'no traducida (3'-UTR) crea un MIR-MIR-191-5p o 887-3p sitios de orientación. Este cambio se traduce en disminución de expresión de oncogenes
MDM4
. Por lo tanto, hemos examinado la asociación entre este SNP y el riesgo de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), así como su función reguladora en las células de SCLC. Los genotipos fueron determinados en dos series de casos y controles independientes consistido en 520SCLC casos y 1040 controles de dos regiones de China. La odds ratio (OR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) se calcularon mediante regresión logística. El impacto del SNP rs4245739 en el miR-191-5p /miR-887-3p mediada
MDM4
regulación de la expresión se investigó utilizando ensayos de gen reportero de luciferasa. Se encontró que los genotipos
MDM4
rs4245739AC y CC se asociaron significativamente con una susceptibilidad reducida SCLC en comparación con el genotipo AA en ambos conjuntos de casos y controles (Shandong establece: OR = 0,53, IC del 95% = 0,32 a 0,89,
P = 0,014
; conjunto de Jiangsu: OR = 0,47, IC del 95% = 0,26 a 0,879,
P = 0,017
). Los análisis estratificados indicaron que hubo una interacción significativa de multiplicación entre rs4245739 y el tabaquismo (
P
interactioin = 0,048). Después de la co-transfección de miRNAs y diferente allelic-
MDM4
reportero construcciones en células de SCLC, se encontró que el miR-tanto 191-5p y miR-887-3p pueden conducir a una disminución significativa
MDM4
actividades de expresión en el constructo con C-alélica 3'-UTR, pero no alélica a-3'-UTR, lo que sugiere una correlación genotipo-fenotipo consistente. Nuestros datos se iluminan de que el
MDM4
rs4245739SNP contribuye al riesgo de SCLC y apoyan la noción de que las variantes genéticas del gen 3'-UTR, impactando miARN vinculante, podría modificar la susceptibilidad SCLC
Visto:. Gao F , Xiong X, Pan W, Yang X, Zhou C, Yuan Q, et al. (2015) Un Reguladora
MDM4
variante genética de posicionamiento en la secuencia de unión de microARNs múltiples contribuye a la susceptibilidad de cáncer de pulmón de células pequeñas. PLoS ONE 10 (8): e0135647. doi: 10.1371 /journal.pone.0135647
Editor: Yifeng Zhou, Facultad de Medicina de la Universidad Soochow, CHINA
Recibido: 18 Marzo, 2015; Aceptado: July 24, 2015; Publicado: 14 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Gao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación: el estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China. (números de subvención: 31271382 & amp; 81201586; URL: http://www.nsfc.gov.cn/) ; el Programa Nacional de Alta Tecnología de Investigación y Desarrollo de China (número de permisos: 2015AA020950; URL: http://www.most.gov.cn/); los fondos de investigación fundamental para las Universidades Central (los números de subvención: YS1407; URL: http://www.moe.edu.cn/); Proyecto de Beijing Educación Superior joven Elite Maestros (los números de subvención: YETP0521; URL: http://www.bjedu.gov.cn/); y el Programa de Changjiang eruditos y equipo innovador de investigación en la Universidad (los números de subvención: IRT13045; URL: http://www.moe.edu.cn/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en el mundo, con más than1,000,000 muertes por año [1]. El cáncer de pulmón se clasifica comúnmente como cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). A pesar de que representa sólo aproximadamente el veinte por ciento de todos los casos de cáncer de pulmón, SCLC es mucho más agresivo en comparación con NSCLC [2,3]. Como un tumor maligno con un mal pronóstico, SCLC muestra fracción de alto crecimiento, el tiempo de duplicación rápido, y el desarrollo temprano de metástasis generalizadas [2,3]. Cuando se diagnostica, la mayoría de los pacientes con CPCP tienen metástasis y mal pronóstico si no se trata [3]. evidencias epidemiológicas acumuladas indican que el consumo de tabaco pesado es un principal factor de riesgo ambiental de esta enfermedad [2,3]. Los recientes avances en los estudios de asociación de genoma completo (GWAS) han revelado que múltiples variaciones genéticas novedosas están asociados con la susceptibilidad al cáncer de pulmón [4-12]. Sin embargo, la mayoría de los estudios examinaron ambos subtipos de cáncer de pulmón o sólo se centra en NSCLC. Curiosamente, la mayoría de los loci de riesgo identificados no influyen significativamente el riesgo de cáncer de pulmón diferencialmente por la histología, y señalan que puede ser diferente de riesgo genético impactos de maquillaje de SCLC o NSCLC [4-12]. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevos SNPs asociados-SCLC-riesgo podría ser un camino potencialmente valiosa hacia iluminando etiología de SCLC.
MDM4, también conocido como MDMX o HDMX, es una proteína estructuralmente homóloga de MDM2. acciones MDM4 un NH
2-terminal P53-dominio de unión con MDM2 y puede inhibir la actividad de p53 en diversos tumores malignos [13-17]. Como guardián del genoma humano, las funciones de P53 en el centro de una red molecular complejo para mediar la supresión de tumores. Como oncogén conocido, MDM4 sobreexpresa en los tumores humanos incluyendo cáncer de pulmón condujo a actividades P53 deprimidas y, por lo tanto, la tumorigénesis. En línea con esto, el modelo de ratón con MDM4 sobreexpresada través de la tecnología transgénica mostró carcinogénesis espontánea durante su vida útil [18].
Hay un
MDM4
3'-untranslatedregion (3'-UTR) rs4245739A & gt ; C SNP localizar en el sitio de unión al objetivo para dos miRNAs (MIR-MIR-191-5p y 887-3p) [19,20]. miR-191-5p y miR-887-3p podrían unirse selectivamente a
MDM4
3'-UTR con el alelo rs4245739C pero no 3'-UTR con el alelo A. cables de unión esta alélicas miRNAs 'a los niveles de expresión elevados de
MDM4
ARNm y /o proteína entre rs4245739A alelo transportistas con cáncer [19-22]. Dos GWAS mostró que el
MDM4
rs4245739 A-alelo se asocia significativamente con un mayor riesgo tanto de cáncer de próstata y cáncer de mama [23,24]. Varios estudios de casos y controles utilizando la estrategia de genes candidatos también confirmaron la asociación positiva entre este polimorfismo y la susceptibilidad de cáncer de ovario, cáncer de mama, el carcinoma de células escamosas de esófago y el linfoma no Hodgkin en diferentes poblaciones étnicas [20,22,25,26]. Sin embargo, la participación de este SNP funcional en SCLC es todavía en gran parte desconocido. Considerando el papel esencial de MDM4 en la carcinogénesis, la hipótesis de que el
MDM4
rs4245739 SNP puede contribuir a la susceptibilidad SCLC través de la regulación alélica ofmiR-191-5p y /o afinidad de unión de miR-887-3p y, por lo tanto, MDM4 expresión. En el presente estudio, se realizó un estudio de casos y controles en dos etapas de SCLC reclutados de la ciudad de Jinan (provincia de Shandong, China) y la ciudad de Huai'an (provincia de Jiangsu, China). Por otra parte, para validar la función biológica de este polimorfismo, se investigó la regulación alélica de miR-191-5p y miR-887-3p en MDM4 en las células de SCLC.
Materiales y Métodos
Estudio sujetos
Este estudio consistió en dos series de casos y controles: conjunto (i) de casos y controles de Shandong: 320 pacientes con CPCP del hospital de Shandong cáncer, Shandong Academia de Ciencias médicas (Jinan, provincia de Shandong, china) y por sexo y de la misma edad (± 5 años) 640 controles. Los pacientes fueron reclutados entre junio de 2009 y noviembre de 2014 en el Hospital del Cáncer de Shandong. Control de los sujetos fueron seleccionados al azar de un grupo de 4500 personas de un programa de cribado del cáncer de la comunidad para la detección precoz del cáncer llevado a cabo en la ciudad de Jinan como se ha descrito en detalle previamente [22]. (Ii) conjunto de casos y controles de Jiangsu: 200 pacientes con CPCP del Hospital Huai'an Nº 2 (Huai'an, provincia de Jiangsu, China) y el sexo y la misma edad 400 controles. Los pacientes fueron reclutados consecutivamente entre enero de 2009 y enero de 2015 a Huai'an el Hospital Nº 2. Los controles fueron individuos libres de cáncer seleccionados de un programa de cribado del cáncer de la comunidad (3600 individuos) para la detección precoz del cáncer llevado a cabo en la ciudad de Huai'an como se ha descrito en detalle previamente [22]. Los individuos que fumaban un cigarrillo al día durante más de 1 año fueron considerados como fumadores [22]. Todos los sujetos eran no relacionados étnicos chinos Han. Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de Huai'an Nº 2 y el Hospital del Cáncer de Shandong, Shandong Academia de Ciencias Médicas. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada materia de contratación
genotipado de SNP
polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción basada en PCR (RFLP) se utilizó para determinar
MDM4
rs4245739A & gt;. genotipos C como se describe en detalle anteriormente [22,25,26]. En resumen, los cebadores utilizados para amplificar segmentos de ADN con el sitio de rs4245739 (la base desajuste está subrayado) fueron 5'-AAGACTAAAGAAGGCTGGGG-3 'y 5'-TTCAAATAATGTGGTAAGTGACC-3'. enzima de restricción
Msp
(New England Biolabs) se utilizó para digerir los productos de PCR y distinguir los genotipos rs4245739. Una muestra aleatoria del 10% se examinó recíprocamente por una persona diferente, y la reproducibilidad fue del 98,7%. Además, un 5% de las muestras al azar también fueron probados mediante secuenciación de Sanger, y la reproducibilidad fue del 100%.
Construcción de plásmidos
Las construcciones de reportero
MDM4
rs4245739A y alélicas fueron rs4245739C preparado mediante la amplificación de parte de la
MDM4
región 3'-UTR de los sujetos homocigotos para el genotipo rs4245739AA o rs4245739CC. Los cebadores de PCR utilizados fueron los siguientes: 5'-AACTCTAGAGGTAGTACGAACATAAAAATGC-3 'y 5'-AACTCTAGACTGCATAAAGTAATCCATGG-3', que incluye los
Xba
de sitios de restricción I (secuencias subrayadas). Los productos de PCR fueron digeridos con
Xba
I (New England Biolabs) y se ligó, respectivamente, en un vector de control pGL3 apropiadamente digerido (Promega). Las construcciones fueron designados aspGL3-rs4245739A y pGL3b-rs4245739C, respectivamente. Las inserciones se confirmaron por secuenciación de ADN.
gen indicador de luciferasa Dual ensayo
A luciferasa de luciérnaga plásmido reportero (control pGL3, pGL3-rs4245739A o pGL3-rs4245739C), un vector de luciferasa de Renilla (PRL -SV40, Promega) más el 30 nMsmall ARN (imita el miR-191-5p, imita miR-887-3p o ARN control negativo) (Genepharma, Guangzhou, China) fueron co-transfectadas en SCLCH446 células con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CALIFORNIA). Se determinó la actividad de luciferasa a las 48 h después de la transfección usando un sistema de ensayo de luciferasa (Promega) como se describe anteriormente [27 a 29]. Tres experimentos de transfección independientes se realizaron y cada uno se realizó por triplicado. Las veces de aumento se calculó mediante la definición de la actividad del vector vacío de control de pGL3 como 1.
Estadística
analiza
Como se ha descrito en detalle previamente [22, 30-32], las diferencias en las variables demográficas y genotipo distribuciones de
MDM4
rs4245739 SNP entre los casos y los controles fueron calculados usando SCLC χ de Pearson
2 test. Las asociaciones entre los
MDM4
genotipos rs4245739 y el riesgo de SCLC fueron estimados por la odds ratio (OR) y sus intervalos de confianza del 95% (IC) calcula utilizando el modelo de regresión logística incondicional. Todas las RUP se ajustaron por edad, género y el tabaco, donde era apropiado. Pusimos a prueba la hipótesis nula de interacción gen-covarianza multiplicativo y salidas evaluados a partir de modelos de interacción multiplicativos mediante la inclusión de las variables principales del efecto y sus términos de productos en el modelo de regresión logística [30-32]. Un
valor de P Red de menos de 0,05 fue utilizado como criterio de significación estadística, y todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras. Todos los análisis se realizaron con SPSS paquete de software (versión 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultados
Las frecuencias alélicas y genotípicas de las distribuciones de
MDM4
rs4245739SNP
La mediana de edad fue de 57 años (rango, 25-82 años de Shandong establecido; rango, 23-79 años para el conjunto de Jiangsu) para los pacientes y los 57 años (rango, 19-80 años para el conjunto de Shandong, rango, 20-81 años para el conjunto de Jiangsu) para los controles (Shandong establecen:
P = 0,615
; conjunto de Jiangsu:
P
= 1,000). No hubo diferencias significativas entre casos y controles en la distribución por sexos (Shandong establece: 78,4% hombres encajona vs. 76,4% en los controles;
P = 0,480
; Jiangsu conjunto: 74,0% hombres encajona vs. 71,3% en los controles ;
P = 0,479
). Esto indica que la coincidencia de la frecuencia era adecuado (Tabla 1). Sin embargo, no se encontraron más fumadores entre los pacientes con CPCP en el conjunto de casos y controles de Shandong en comparación con los sujetos control (conjunto de Shandong: 77,8% vs. 34,2%,
P Hotel & lt; 0,001). Del mismo modo, hay pacientes con CPCP más que fumar que los controles en el sistema de Jiangsu (78,5% vs. 21,5%,
P Hotel & lt; 0,001). Además, se observaron más pacientes con enfermedad limitada que entre aquellos con enfermedad extensa en dos sets (Shandong conjunto: 56,9% vs. 43,1%; conjunto de Jiangsu: 56,5% vs. 43,5%).
se muestra en la Tabla 2, la frecuencia de la
MDM4
alelo rs4245739 C fue de 0,038 y 0.073among pacientes con CPCP y controles sanos desde el conjunto de Shandong, y 0,043 y 0,101 del conjunto de Jiangsu. Todas las frecuencias genotípicas observadas en ambos casos y controles de SCLC se ajustan a Hardy-Weinberg. Las distribuciones de estos
MDM4
genotipos se compararon entre los casos y los controles de SCLC. Las frecuencias de
MDM4
rs4245739 AA y CA o CC genotipos entre los pacientes fueron significativamente diferentes de los que entre los controles en el conjunto de Shandong (χ
2 = 10,70,
P = 0,005
,
df
= 2) (Tabla 2). Del mismo modo, las frecuencias de
MDM4
rs4245739 AA y CA o CC genotipos entre los casos fueron significativamente diferentes de los del grupo de control en el sistema de Jiangsu (χ
2 = 12,84,
P = 0,002
,
df
= 2) (Tabla 2).
Asociación entre
MDM4
rs4245739SNP y el riesgo SCLC
Las asociaciones entre los genotipos de
MDM4
rs4245739 A & gt; C polimorfismo y el riesgo SCLC se calcularon utilizando análisis de regresión logística incondicional (Tabla 2). Como se muestra en la Tabla 2, los
MDM4
rs4245739 alelo C actúa como un alelo protector de SCLC. Los sujetos con el genotipo AC tuvieron un OR de 0,52 (IC del 95% = 0,31-0,87,
P = 0,013
) para el desarrollo de SCLC, en comparación con los sujetos con el genotipo AA. Redujo significativamente el riesgo SCLC también se observó entre rs4245739 CA o CC portadores en comparación con los portadores AA (OR = 0,53 IC 95% = 0,32 a 0,89,
P = 0,014
). Las asociaciones de riesgo SCLC con el
MDM4
rs4245739SNP fueron validados en un conjunto de casos y controles independientes de Jiangsu. Una disminución significativa del riesgo SCLC también se asoció con rs4245739 (AC: OR = 0,48, IC del 95% = 0,26 a 0,88,
P = 0,019
; CA o CC: OR = 0,47, IC del 95% = 0,26-0,87 ,
P = 0,017
). En los análisis combinados, se encontró que el genotipo AC rs4245739 tenían un riesgo 0,49-folddecreased para el CPCP en comparación con el genotipo AA (95% CI = 0,32-0,75,
P
= 0,001), y la CA o rs4245739 genotipo CC tenía un riesgo 0,50-folddecreased en comparación con el genotipo AA (IC 95% = 0,32-0,76,
P
= 0,001) (Tabla 2). Todas las RUP se ajustaron por sexo, edad y condición de fumador.
Además, examinó el riesgo asociado con el SCLC
MDM4
rs4245739genotypes estratificando por edad, sexo, tabaquismo y estadio de la enfermedad mediante el agruparon los datos de dos series de casos y controles chinos (Tabla 3). En los análisis estratificados con la edad, rs4245739AC y CC genotipos se asociaron significativamente con la disminución del riesgo en sujetos de 57 años o más jóvenes (OR = 0,40, IC del 95% = 0,21 hasta 0,74,
P
= 0,003), pero no en sujetos con edades mayores de 57 años (OR = 0,63 IC 95% = 0,35 a 1,15,
P = 0,134
). No hubo interacción significativa en edad gen (
P
interacción = 0,274). Una disminución en el riesgo de manera significativa de SCLC se asoció con genotipos de CA y CC sólo entre las mujeres (OR = 0,33, IC del 95% = 0,15 a 0,74,
P
= 0,007), pero no entre los varones (OR = 0,63, 95 CI = 0,38-1,06%,
P = 0,083
), en comparación con el
MDM4
genotipo rs4245739 AA. No se observó ninguna interacción significativa gen sexo (
P
interacción = 0,135). No se encontró significativamente menos de riesgo (OR = 0,73 IC 95% = 0,42 a 1,28,
P = 0,274
) para las portadoras con CA y CC genotipos en comparación con los individuos con el genotipo AA en los fumadores. Sin embargo, thers4245739AC y CC genotipos mostraron una disminución de 0,30 veces el riesgo de desarrollar CEP (IC del 95% = 0,14 hasta 0,64,
P
= 0,002) en comparación con el genotipo AA en los no fumadores. Existía una interacción gen fumadores multiplicativo (
P
interactioin = 0,048). No se observaron asociaciones entre rs4245739 genotipos de CA y CC y el riesgo de SCLC, tanto en pacientes con la enfermedad en estadio limitado (OR = 0,52, IC del 95% = 0,32 a 0,84,
P
= 0,008) o la enfermedad en etapa extensa (OR = 0,48; IC del 95% = 0,24 hasta 0,97,
P = 0,040
) (Tabla 3).
relevancia funcional ofrs4245739 en miARN mediada por
MDM4
regulación
SNPrs4245739A & gt; C podría conducir a una mayor afinidad entre miR-191-5p /miR-887-3p y
MDM4
ARNm y la disminución de
MDM4
expresión en múltiples tumores malignos [19 -22]. Sin embargo, su impacto en la
MDM4
regulación en el CPCP aún no están claros. Como resultado, hemos examinado si existe un efecto específico de alelo de rs4245739polymorphismon
MDM4
expresión en células de SCLC por miR-191-5p y miR-887-3p. Relativos ensayos de expresión de luciferasa indicó que miR-191-5p puede significativas actividades de luciferasa más bajos en las células SCLC H446 transfectadas con construcciones de reportero rs4245739C alélicas en comparación con ARN negativas de control (
P
= 0,003) (Fig 1). Del mismo modo, el miR-887-3p también regula
MDM4
región 3'-UTR con actividades de luciferasa significativamente más bajos en las células H446 que expresan construcciones rs4245739C alélicas en comparación con los ARN de control negativo (
P = 0,014
) ( Figura 1). Sin embargo, no hubo tal depresión en H446 células con transfección del reportero alélica rs4245739A construye por tanto imita miRNAs (Figura 1).
H446 células se cotransfectaron con PRL-SV40 para normalizar la eficiencia de transfección. Las veces de aumento se midió mediante la definición de la actividad de las células co-transfectadas con pGL3-tanto rs4245739A o pGL3-rs4245739Creporter construir y NC-ARN como 1. Todos los experimentos se realizaron por triplicado al menos en tres experimentos de transfección independientes y cada valor representa la media ± SD . *
P Hotel & lt; 0.05compared con cada uno de constructo de luciferasa por
t-pruebas
. NC-ARN, los ARN de control negativo; SCLC, cáncer de pulmón de células pequeñas.
Discusión
En el presente estudio, se investigó la asociación entre el
MDM4
SNP rs4245739 funcional y el riesgo a través de un caso SCLC -control enfoque. Hemos observado que los individuos con
MDM4
rs4245739 genotipos CA o CC muestran una disminución significativa del riesgo SCLC en comparación con los portadores del genotipo AA. Para revelar el miR-191-5p /miR-887-3p mediada alélica-regulación por este SNP, se examinaron las actividades de luciferasa en células de SCLC transfectadas con diferentes construcciones de reportero alélica. Los análisis de la correlación genotipo-fenotipo indicó que ambos miRNAs podrían inhibir
MDM4
expresión sólo en las células de SCLC con expresión de las construcciones C-alelo pero no constructos Un alelo. Estos resultados ponen de manifiesto la implicación de las variantes genéticas funcionales en los sitios en la etiología SCLC miARN vinculante.
evidencias acumuladas demostrado que la composición genética podría tener contribución directa al riesgo de SCLC [33-35]. Curiosamente, en referencia a las bases de datos de perfil de expresión génica para identificar genes que están desregulados en SCLC y sus SNPs en el 3'-UTR, Xiong et al identificaron una susceptibilidad SCLC rs3134615 SNP G & gt; T puede inhibir la interacción de miR-1827 con
MYCL1
3'-UTR, resultando en una mayor expresión constitutiva de MYCL1 [35]. En consonancia con esta idea, también encontramos un
MDM4
SNP 3'-UTR blanco de los miRNAs se asocia con la susceptibilidad SCLC.
El
MDM4
polimorfismo rs4245739 mostraron una asociación consistente con el riesgo de SCLC intwo series de casos y controles independientes, que son poco probable que sea atribuible a factores de confusión desconocidos debido a haber aumentado de manera significativa odds ratios con pequeñas
P
valores. Además, la relación genotipo-fenotipo entre el polimorfismo rs4245739 y expresión del gen indicador apoya nuestra conclusión. Por otra parte, el
MDM4
rs4245739 SNP podría ser un componente de riesgo genético común para los diferentes tipos de cáncer, que ha sido probado por nuestro grupo y otros a través de cualquiera de los enfoques de genes candidatos o GWAS [19-26]. Por ejemplo, nos encontramos con anterioridad que rs4245739 CA y CC genotipos se asociaron significativamente con la disminución del riesgo de cáncer de esófago [22], un tumor maligno de etiología ambiental similar de SCLC (es decir, fumar en exceso). Sin embargo, puede haber varias limitaciones en el estudio de casos y controles de corriente. Por ejemplo, ya que todos los casos de SCLC fueron reclutados del hospital, puede existir sesgo de selección. Por lo tanto, los resultados de nuestro orden de estudio para ser validados en un estudio prospectivo basado en la población en el futuro. tamaño de la muestra relativamente pequeña para los no fumadores debería seguir siendo analizado en una población mayor.
En resumen, nuestros resultados sugieren que funcional
MDM4
rs4245739 SNP se asoció con un riesgo significativamente menor SCLC en chino Han poblaciones. Las asociaciones entre SNPs y el riesgo de SCLC son notables en los no fumadores. Teniendo en cuenta este hecho, se necesitan más esfuerzos para examinar si
MDM4
rs4245739 polimorfismo genético puede ser utilizado como un marcador de diagnóstico potencial de SCLC.