Extracto
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es un objetivo bien establecido para el tratamiento del cáncer. Tirosina quinasa de EGFR inhibidores (TK), como gefinitib y erlotinib, se han desarrollado como fármacos contra el cáncer. Aunque el carcinoma no microcítico de pulmón de células con una mutación de EGFR activación, L858R, responde bien a gefinitib y erlotinib, los tumores con un doble EGFR mutado, T790M-L858R, adquieren resistencia a estos fármacos. El
C. elegans
EGFR homólogo LET-23 y su vía de señalización corriente abajo se han estudiado ampliamente para proporcionar información sobre los mecanismos de regulación conservados de
C. elegans
a los seres humanos. Para desarrollar un
sistema de cribado in vivo Opiniones de potenciales fármacos contra el cáncer dirigidos EGFR mutantes específicos, expresamos tres pisos-23 quimeras en las que el dominio de los conocimientos tradicionales se reemplaza por el dominio de los conocimientos tradicionales de tipo salvaje humana (LET-23: : hEGFR-TK), un dominio de los conocimientos tradicionales con la mutación L858R (LET-23 :: hEGFR-TK [L858R]), o un dominio de los conocimientos tradicionales con las mutaciones T790M-L858R (LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R ]) en
C. elegans
vulval células utilizando el
let-23
promotor. La proteína quimérica de tipo salvaje hEGFR-TK rescató el
let-23
fenotipo mutante, y la activación de las quimeras mutantes TK-hEGFR indujo un fenotipo multivulva (Muv) en una de tipo salvaje
C. elegans
fondo. El gefitinib fármacos contra el cáncer y erlotinib suprimen el fenotipo Muv en LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] expresando animales transgénicos, pero no en LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R] animales transgénicos. Como una pantalla piloto, 8.960 pequeños productos químicos se evaluó la supresión Muv, y AG1478 (un inhibidor de EGFR-TK) y U0126 (un inhibidor de MEK) fueron identificados como potenciales inhibidores de la función biológica mediada por EGFR. En conclusión, transgénico
C. elegans
que expresan las proteínas quiméricas LET-23 :: hEGFR-TK son un sistema modelo que se puede utilizar en las pantallas de la mutación específica para nuevos fármacos contra el cáncer
Visto:. Bae YK, Sung JY, Kim YN, Kim S, Hong KM, Kim HT, et al. (2012) Un
En Vivo C. elegans
sistema modelo para la detección inhibidores de EGFR fármacos anticancerosos. PLoS ONE 7 (9): e42441. doi: 10.1371 /journal.pone.0042441
Editor: Anne C. Hart, Universidad de Brown, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Marzo, 2012; Aceptado: 9 Julio 2012; Publicado: 5 Septiembre 2012
Copyright: © Bae et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue el único apoyo de una beca de investigación del Centro Nacional del cáncer (NCC-1110060) de Corea del Sur (www.ncc.re.kr). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Desarrollo de un alto rendimiento, bajo costo
in vivo
sistema de selección para las pequeñas reactivos contra el cáncer de molécula sería ideal será capaz de superar los principales problemas de la convencional
in vitro en
métodos de cribado. Debido al rápido tiempo de generación, los números altos de la progenie, de bajo costo, y herramientas genéticas bien establecidas, el nematodo
Caenorhabditis elegans gratis (
C. Elegans
) es un candidato atractivo para un sistema de detección modelo animal , con muchas de las ventajas de
in vitro
sistemas de cribado y modelos animales [1].
EGFR está sobreexpresado de forma aberrante o activado en varios tipos de cáncer humano, como el de mama, de ovario, y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [2]. EGFR está implicado en diversas etapas del desarrollo del cáncer, incluyendo la tumorigénesis, invasión, metástasis y la angiogénesis [3], y por lo tanto proporciona una diana atractiva para el desarrollo de fármacos contra el cáncer. Gefitinib (nombre comercial: Iressa) fue el primer fármaco inhibidor de EGFR-TK desarrollado para el tratamiento de los cánceres epiteliales tales como NSCLC [4]. Las mutaciones en el dominio de EGFR-TK se han relacionado con la sensibilidad a gefitinib en un subconjunto de cánceres de pulmón, y también se han encontrado para activar las vías anti-apoptóticos [5], [6].
C. elegans
vulval desarrollo es un sistema modelo bien establecido utilizado para estudiar la ruta de señalización de EGFR [7] - [9]. Entre los seis células precursoras vulvares (VPC), P5.p, P6.p, y P7.p adoptan los 2 ° -1 ° -2 ° destinos celulares, respectivamente, y siguen dividiendo para formar la vulva maduro. El destino 1 ° celular se determina como resultado de la EGFR-Ras-MAPK señalización en P6.p, mientras que el destino 2 ° celular se determina por LIN-12 de señalización /Notch en P5.p y P7.p, que se activa como resultado de EGFR-Ras-MAPK señalización en la célula vecina. Componentes de la vía EGFR, incluyendo EGFR, Ras, Raf, MEK y MAPK, están muy conservadas entre los humanos y
C. elegans
[8]. Un número limitado de compuestos químicos que se dirigen a la vía EGFR han sido probados utilizando
C. elegans
desarrollo vulvar como modelo. No se han encontrado inhibidores de la farnesiltransferasa, que inhiben la actividad de Ras, y compuestos de MCP, que rompen las interacciones Ras-Raf para actuar específicamente en las proteínas ortólogos en el
C. elegans
EGFR-Ras vía [10] - [12]. La toxicidad de los inhibidores de quinasa del EGFR y BIBU1361 BIBX1382 también se evaluó en
C. elegans
[13]. Estos estudios sugieren la posibilidad de utilizar
C. elegans
como una herramienta para la detección de drogas vía anti-EGFR.
En este estudio, hemos desarrollado y analizado un ser humano EGFR impulsada por
C. elegans
modelo, que exhibe el fenotipo Muv. Usando este modelo, se llevó a cabo una pantalla piloto de 8.960 productos químicos, y un inhibidor de EGFR y un inhibidor de MEK se aislaron como supresores, lo que sugiere que este
C. elegans
sistema basado pueden ser utilizados de manera eficiente para la detección de nuevas drogas inhibidoras de EGFR.
Materiales y Métodos
cultura Gusano y cepas
De tipo salvaje y N2 cepas mutantes se cultivaron como se describe por Brenner [14]. Los alelos mutantes utilizados en este trabajo son
let-23 (sy1), vamos-23 (SA62), let-60 (N1700)
y
lin-15 (n765)
. líneas de integración utilizados en este trabajo son
jgIs6
[
let-23p de la Unión :: LET-23 :: hEGFR-TK [L858R],
rol-6 (su1006)
],
jgIs19
[
let-23p de la Unión :: LET-23 :: hEGFR,
rol-6 (su1006)
],
jgIs25
[ ,,,0],
let-23p de la Unión :: LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R],
rol-6 (su1006), mio-2p :: mCherry
],
jgIs14
[
EGL-17p de la Unión :: EMR-1 :: RFP,
DHS-31p de la Unión :: NLS :: GFP,
rol-6 (su1006)
], JJ1136 (HMP-1 :: GFP), PS4657 (AJM-1 :: GFP) y PS3352 (CDH-3 :: GFP).
Construcción de let-23 :: hEGFR plásmidos quiméricos
Se utilizó ADN genómico de la
let-23
genes y ADNc que codifica EGFR humano. Cada fragmento de ADN se amplificó por PCR, se clonaron en el vector pGEM fácil-T (Promega Inc., Madison, WI, EE.UU.), y se confirmó por secuenciación. A continuación, reunidos los fragmentos de ADN utilizando enzimas de restricción apropiadas y los sitios correspondientes del vector pPD117.01 (Dr. Andrew Fire, Stanford Univ., CA, EE.UU.). mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Cat#200523, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EE.UU.) de EGFR-TK ADNc se realizó para producir EGFR [L858R], EGFR [T790M] y EGFR [T790M-L858R]. El procedimiento detallado y los cebadores utilizados en este estudio se proporcionan en los materiales complementarios (Fig. S1B). Para utilizar como marcador del destino celular secundaria, pJG205 fue construido mediante la combinación de un fragmento de PCR amplificado a partir de la secuencia de ADN genómico de 4,0 kb aguas arriba de
EGL-17
con
EMR-1 | ADNc, DsRed ( RFP, Clontech de Takara Bio Inc.) y pPD95.77 (A. Fuego). La secuencia de codificación GFP de pPD95.77 se reemplazó con DsRed cDNA. Otro marcador de destino celular, pJG207, se hizo por clonación del
DHS-31
región promotora en pPD95.69 (A. Fuego), que contiene la señal de localización nuclear de SV40 (NLS) y GFP. Todas las construcciones de plásmidos se confirmaron por secuenciación.
La microinyección y la integración
La concentración de inyección de construcciones de ADN y los marcadores fueron de 75 mg /ml pRF4 [
rol-6 (su1006)
], 50 ó 25 mg /ml de EGFR plásmidos quiméricos, 50 mg /ml
TTX-3 :: GFP
, 35 mg /ml pJG205 [
EGL-17p de la Unión :: EMR-1: : RFP], 40 mg /ml pJG207 [
DHS-31p de la Unión :: :: GFP NLS], y 5 mg /ml pCFJ90 [
mio-2p Unión :: mCherry] (Addgene, Cambridge, MA, EE.UU.). La concentración de ADN total de cada mezcla de inyección fue de 150 g /ml, con + DNA pBluescript SK añade cuando sea necesario. Todas las líneas integradas se hicieron usando la radiación UV y de cruzamiento cuatro veces.
Microscopía y Hoechst33342 tinción
Todas las imágenes microscópicas fueron capturados y procesados usando una cámara digital AxioCam HRc unido a una fluorescencia Imager M1 microscopio y Axiovision Rel. software 4.6 (Zeiss Inc., Alemania). Para Hoechst33342 (Molecular Probes of Life Technologies Co., Grand Island, NY, EE.UU.) tinción,
jgIs6
gusanos fueron cosechadas y se lava varias veces con tampón M9. Los gusanos fueron luego se remojan en una solución 1 mg /ml Hoechest33342 durante 30 minutos. Después del lavado, los gusanos se prepararon para la observación.
El tratamiento químico y estadísticas
Químicos incluyendo gefitinib, erlotinib, U0126, AZD6244, PD0325901 y WZ4002 se adquirieron de Selleck Químicos LLC. (Houston, TX, EE.UU.), y la biblioteca de 1.280 productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, EE.UU.). Los otros 7.680 productos químicos se obtuvieron de la Corea química Banco de KRICT. Productos químicos se disolvieron en solución de DMSO 100%, y se mantuvieron a -20 ° C como 1 o 10 stocks mM para el cribado. Todas las pruebas químicas fueron ejecutadas en placas de 96 pocillos, y el volumen final por pocillo fue de 100 l incluyendo gusanos, colesterol, y los muertos
E. coli
. La concentración de DMSO del grupo de control se mantuvo a 0,5%, y concentraciones de DMSO de todos los grupos experimentales estaban por debajo de 0,5%. La concentración química final utilizado para la pantalla fue 5 mM y 20 a 50 gusanos L1 se cultivaron en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Cada prueba química incluyó al menos tres pocillos por producto químico y se repitió al menos dos veces. Las barras de error en todos los gráficos representan SD (desviación estándar), y
P
valores relativos al control se calcula de Student no pareada
t
alltests.
Resultados
quimérico proteína LET-23 :: hEGFR-TK es funcional en
C. elegans
Para desarrollar un
C. elegans
sistema modelo para la detección de sustancias químicas que inhiben la actividad humana EGFR (hEGFR), se diseñaron construcciones de plásmidos que expresan el
C. elegans
ortólogo EGFR, LET-23, y la proteína de fusión hEGFR, mediante el canje de dominio citoplásmico o TK del LET-23 con cada dominio hEGFR (fig. 1A y la Fig. S1). El objetivo fue facilitar la expresión funcional de la contraparte humana en
C. elegans fotos: por retener la mayor parte de la
C. elegans
LET-23 codificación y secuencias reguladoras, por ejemplo, mediante el mantenimiento de los residuos C-terminales importantes para el tráfico adecuado [15]. Los productos proteicos putativos de estos transgenes tienen 1388 aminoácidos (LET-23 :: hEGFR) o 1323 aminoácidos (LET-23 :: hEGFR-TK). Como se muestra en la Figura 1A y la Figura S2, pisos-23 :: hEGFR incluye 841 aminoácidos del dominio LET-23 N-terminal, 542 aminoácidos del dominio C-terminal EGFR humano, y 5 aminoácidos de la LET-23 PDZ interactuar con motivos. LET-23 :: hEGFR-TK incluye 841 aminoácidos del dominio LET-23 N-terminal, 306 aminoácidos del dominio de EGFR-TK humana, y 176 aminoácidos de la LET-23 dominio C-terminal. Para probar si esta proteína LET-23 :: hEGFR-TK quimérico es funcional, la construcción se microinyectó en el
let-23 (sy1)
mutante. La mayoría
-23 permiten
mutantes son letales, pero
let-23 (sy1)
es viable y vulvaless (Vul) debido al tráfico aberrante de LET-23 [15] - [17]. El LET-23 quimérico :: hEGFR-TK proteína rescató el fenotipo Vul de
let-23 (sy1) gratis (Fig. 1B), lo que indica que la proteína quimérica es funcional en
C. elegans
. Cuando el
let-23 (sy1)
mutante fue rescatado con
jgIs19
, una cepa que contiene el transgén integrado LET-23 :: hEGFR, el
let-23 (sy1); jgIs19
cepa mostró una población vulvaless reducido significativamente (9,1%) en comparación con el
let-23 (sy1)
mutante (92%) (Fig. S1C).
(a) LET-23 y LET-23 basados en construcciones de receptor quimérico. Todas las construcciones fueron diseñadas para expresar cada receptor quimérico de la
promotor let-23. (B) El LET-23 :: hEGFR-TK quimera rescata el fenotipo vulvaless de la
let-23 (sy1)
mutante. (C) Una comparación de varios mutantes MUV y el
jgIs6
cepa transgénica que expresa LET-23 :: hEGFR-TK [L858R].
C. elegans
expresar LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] exhibió una pseudovulva mayor en comparación con
let-23 (SA62)
y
vamos-60 (N1700)
mutantes MUV. (D) Hoechst33342 (H33342) tinción de la región pseudovulval en
jgIs6
reveló muchos núcleos. La región en caja del panel inferior se agranda en el panel derecho. (E) La expresión de un marcador de células 1 °, CDH-3 :: GFP en el gusano de tipo salvaje y
jgIs6
. CDH-3 :: GFP es altamente expresado tanto en la vulva y pseudovulva de
jgIs6
. (F) La expresión de marcadores de 2 ° destino celular vulvares en el
lin-15
Muv mutante y
jgIs6
. Los genes indicadores controlados por los promotores de
EGL-17
y
DHS-31
se expresaron en la vulva y pseudovulva. Las puntas de flecha indican la vulva normal y pequeñas flechas indican pseudovulvae. Las barras de escala, 50 micras.
A continuación, se evaluaron los efectos de la sobre-expresión de la forma mutante de la activación de LET-23 :: hEGFR-TK en un
let-23 (
+) de fondo. Aumento de la actividad de la vía EGFR da-Ras-MAPK en la hiper-inducción de células vulvares, a que se refiere como un fenotipo Muv, como se ve con la semi-dominante
let-23 (SA62)
mutación y la constitutivamente activa
let-60 (N1700)
mutación.
lin-15
actúa aguas arriba de
let-23
para regular negativamente la vía EGFR-Ras-MAPK [18]. Esta regulación negativa se interrumpe en el
lin-15 (n765)
mutante, lo que resulta en un fuerte fenotipo Muv [18], [19]. Por lo tanto, esperábamos que las mutaciones activadoras en la región de EGFR-TK también causar un fenotipo Muv. Dos mutaciones activadoras del EGFR que confieren sensibilidad a gefitinib a ciertos tipos de cáncer de pulmón fueron probados: EGFR [L858R] y EGFR [Δ747-752] [20], [21]. En marco deleciones en el exón 19, incluyendo Δ747-749 (44%), y mutaciones puntuales en el exón 21, incluyendo L858R (41%) son los más frecuentemente encontrado EGFR-TK activación de mutaciones en NSCLC [20],. El EGFR gefitinib resistente [T790M-L858R] mutación también fue probado. T790M es una mutación secundaria que dota a la resistencia a la lesión gefitinib L858R [21]. Quimérico LET-23 :: hEGFR-TK que contiene cualquiera de estas mutaciones inducidas por la hiper-inducción de células vulvares que resulta en un fenotipo Muv (Fig. 1C y Tabla 1). Los animales transgénicos que expresan LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] o LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R] tenían un fenotipo similar al
lin-15 (n765)
, con 2-4 pseudovulvae grande. En contraste, los animales transgénicos que expresan pisos-23 :: hEGFR-TK [T790M] no mostraron un fenotipo Muv. Para facilitar su posterior análisis, se seleccionaron un LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] línea transgénica para generar
jgIs6
, una cepa con la matriz transgénico integrado en el genoma. La integración del transgén permitió aumentar la penetrancia del fenotipo Muv; 49% antes de la integración Muv frente a 94,6% Muv después de la integración (Tabla 1). La tinción de los núcleos con Hoechst33342 reveló la presencia de muchos núcleos en la región pseudovulval (Fig. 1D), y esto significa que el número de células se incrementaron en el pseudovulva de nuestra cepa transgénica similar a otros mutantes MUV como
let-60 ( N1700)
, y
lin-15 (n765)
. Los animales transgénicos mostraron un fenotipo de rodadura porque pRF4 [
rol-6 (su1006)
] se utilizó como un marcador transgénico. Para facilitar la detección fenotipo Muv, introdujimos el
SQT-1 (jg52)
mutación en las líneas transgénicas. Este
SQT-1 | mutante suprime el fenotipo de rodadura de
rol-6
sin defectos evidentes [23]. Inesperadamente, encontramos que el
SQT-1 (jg52)
mutación mejoró el fenotipo Muv de las líneas transgénicas de EGFR (Tabla 2).
El fenotipo de Muv
jgIs6
es debido a la activación ectópica de la LET-23 vía /EGFR
para confirmar que la formación pseudovulvae en
jgIs6
es debido a la activación específica de la EGFR-Ras-MAPK vía por el LET-23 quimérico :: hEGFR-TK [L858R] proteínas, se realizó ARNi de genes en la vía EGFR-Ras-MAPK. En consonancia con la activación ectópica de la vía EGFR-Ras-MAPK, knock-down de genes abajo de
let-23
, incluyendo
let-60 /Ras, MEK-2 /MEK
, y
MPK-1 /MAPK
, suprime el fenotipo Muv de
jgIs6
. RNAi de la subida de genes LET-23 /EGFR
lin-3 /EGF
también suprimió el fenotipo Muv. El fenotipo Muv de otra línea transgénica,
jgIs25
, que expresa LET-23 :: hEGFR-TK [L858R-T790M], también fue suprimida por ARNi de
lin-3, let-60, MEK -2
, y
MPK-1 gratis (Fig. S3 A). Dado que la vía Wnt actúa en paralelo a
lin-3
para mantener VPC competencia [24], también se realizó Wnt vía gen desmontables de RNAi para probar si la actividad afecta a la formación de Wnt Muv en
jgIs25
. Dos genes vía Wnt (
bar-1 | y
CWN-2
) se pusieron a prueba, porque sus fenotipos desmontables están asociados con el desarrollo vulvar [25], [26]. Similar a
lin-3
desmontables, RNAi de
bar-1 | o
CWN-2
produjo la supresión del fenotipo Muv de
jgIs25 gratis ( ). Hemos observado larvas de letalidad rara de estos experimentos de ARNi porque las larvas L1 sincronizada fueron tratados con RNAi, igual que el mismo método se utilizó para el tratamiento de drogas se describe a continuación. Para confirmar el efecto letal de RNAi EGFR genes abajo, se trataron
jgIs25
larvas L4 con
let-60
o
MPK-1 | ARNi y se contaron los números de F1 progenie. larvas de letalidad se incrementó significativamente por
let-60
o
MPK-1 | RNAi (Fig. S3C).
Se han comparado los marcadores de células suerte vulvar en
jgIs6
MUV y que tienen la vía EGFR-Ras-MAPK activada. Cuando se examinó el marcador de destino de la célula 1 °,
jgIs6
pseudovulvae mostraron expresión del destino celular marcador de 1 ° CDH-3 :: GFP (Fig. 1E). CDH-3 es una cadherina se expresa en las células 1 ° Vul C, D, E, y F [27]. Para ensayar la expresión de marcadores de 2 ° destino, se construyó una línea transgénica que expresa tanto integrada
EGL-17p de la Unión :: EMR-1 :: RFP y
DHS-31p de la Unión :: :: GFP NLS . EGL-17 se expresa en las células de 2 ° C y D Vul, y las células DHS-31 en el 2 ° B1 Vul, B2, D y en la etapa adulta [27], [28]. EMR-1 es un homólogo de la integral emerin proteína de membrana nuclear humano [29], y por lo tanto, hace que la localización de la envoltura nuclear. En un fondo de tipo salvaje,
EGL-17p de la Unión :: EMR-1 :: RFP y
DHS-31p de la Unión :: NLS :: GFP se expresan en la envoltura nuclear y el núcleo de la 2 ° vulval células, respectivamente. Tanto
lin-15 (n765): perfil y
jgIs6
animales tenían patrones similares de expresión de
EGL-17p de la Unión :: EMR-1 :: RFP y
DHS -31p de la Unión :: NLS :: GFP (Fig. 1F). Para la comparación adicional de
jgIs6
y MUV mutantes, se analizó la expresión de AJM-1 :: GFP y HMP-1 :: GFP, que se expresa tanto en la unión adherentes y marcar los límites de la proliferación y diferenciación de las células epiteliales [30]. AJM-1 :: GFP y 1 HMP-expresión :: GFP se observó en invaginaciones ventrales, incluidas las regiones pseudovulval putativos en
jgIs6
,
let-60 (N1700)
, y
lin-15 (n765)
mutantes en la etapa L4. Estos dos marcadores de unión también se observaron en el pseudovulva de
jgIs6
en la etapa de adulto (Fig. S4). Tomados en conjunto, los resultados descritos anteriormente sugieren que el
jgIs6
cepa transgénica que expresa el LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] características de visualización de proteínas quiméricas que son consistentes con la sobreactivación de la vía del EGFR en el Muv mutantes.
gefitinib y erlotinib inhiben el fenotipo Muv de
jgIs6
Para determinar si el
jgIs6
cepa transgénica que expresa el quimérico LET-23 :: hEGFR-TK proteína [L858R] podría ser utilizada en una pantalla de gran escala para los inhibidores de EGFR-TK humanos, hemos probado los efectos de la droga gefitinib y erlotinib. Cuando de tipo salvaje
C. elegans
fueron tratados con gefitinib, incluso dosis altas (40 mM) no afectó a la embriogénesis o desarrollo de las larvas (Fig. 2A). Esto indicaba que el gefitinib no es tóxico para los de tipo salvaje
C. elegans
, y parece tener poco o ningún efecto sobre la función LET-23, lo cual no es sorprendente, dada la identidad de la secuencia baja con la proteína EGFR humano o correlación de la respuesta a gefitinib y la activación de mutaciones de EGFR [31]. En contraste, el fenotipo de Muv
jgIs6
se inhibió hasta el 90% en 1 M gefitinib y completamente inhibida por 5 M gefitinib (Fig. 2B y C). Teniendo en cuenta que 250 o 500 mg de gefitinib por vía oral se recomienda una vez al día para pacientes con cáncer (aproximadamente 10 mM) [4], [32], el efecto inhibidor de gefitinib parece ser similar en
C. elegans
y los seres humanos. Para comprobar el mecanismo de acción de los inhibidores de EGFR-TK reversibles (TKIs) para nuestro LET-23 :: hEGFR-TK-expresión transgénica
C. elegans
, se trataron
jgIs25
con gefitinib. La mutación T790M puede resultar en una alteración de la topología de EGFR que se opone a la unión de EGFR-TKI reversible a través de impedimento estérico, o T790M puede aumentar la afinidad del dominio quinasa de ATP [21], [33] - [35]. el tratamiento con gefitinib no inhibió el fenotipo Muv de
jgIs25 gratis (Fig. 2C). Erlotinib, otro medicamento contra el cáncer de EGFR-TKI, produce efectos inhibitorios similares a gefitinib (Fig. 2D). Tratamos de comparar el nivel de expresión de dos proteínas quiméricas de
jgIs6
y
jgIs25
, pero no hemos podido cuantificar la proteína quimérica. Suponiendo niveles similares de la expresión transgénica, la diferencia observada en la actividad es probablemente debido a una disminución de la sensibilidad a los fármacos conferida por la mutación L858R.
(A) una alta dosis de gefitinib (40 M) no afectó a la embriogénesis normal de , el crecimiento de las larvas, o la formación de la vulva de la de tipo salvaje
C. elegans
. (B) El gefitinib inhibe el fenotipo Muv de
jgIs6
que expresa LET-23 :: hEGFR-TK [L858R]. (C) El gefitinib inhibe el fenotipo Muv de
jgIs6
en una forma dependiente de la dosis, pero no inhibió la de
jgIs25
, que expresa LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R ]. El número de gusanos contados (
n
) fueron 159, 96, 130, 85, 87, 125, 108 y 88 de izquierda a lo largo del eje x. (D) El erlotinib produce un efecto similar al gefitinib en tanto
jgIs6 Opiniones y
jgIs25 y modelos. (
n
= 159, 96, 67, 110, 80, 106, 95 y 176). (E) La determinación de la etapa de desarrollo de
jgIs6 Windows que es más sensible a gefitinib. Al igual que en el desarrollo normal de la vulva, larvas temprano (L1-L3) respondió bien a gefitinib. (
n
= 128, 224, 134, 116, 139, 167, 99 y 66). Barras de escala, 50 micras (A, B). Eje X, la concentración de gefitinib (C), erlotinib (D) y la etapa gusano de tratamiento gefitinib (E). Eje Y,% de los gusanos que muestran el fenotipo Muv (C-E). *
P
. & Lt; 0,001
Para determinar el grado de desarrollo del gusano durante el cual el tratamiento con gefitinib es más eficaz, tratamos
jgIs6
de cada etapa larval con 1 M gefitinib, y obtuvo el fenotipo Muv en la etapa adulta. Los animales expuestos a gefitinib desde las etapas L1, L2, o L3 mostraron una marcada reducción en el fenotipo Muv, y el grado de respuesta fue similar entre los tres etapas (Fig. 2E). L4 animales no eran tan susceptibles a gefitinib, lo que indica que el tratamiento con gefitinib antes de la muda L3 /L4, cuando se inicia el desarrollo de la vulva, es crítica para la inhibición efectiva de la LET-23 :: hEGFR-TK proteína [L858R]. A partir de este resultado, llegamos a la conclusión de que las larvas de principios, de L1 a L3, se puede utilizar para la detección de nuevos inhibidores contra la vía de señalización del EGFR-TK activado.
pantalla Piloto de inhibidores que inhiben el fenotipo Muv de
jgIs6
en base a los primeros resultados, se ha diseñado un protocolo de cribado de alto rendimiento a gran escala de los inhibidores de EGFR usando
jgIs6
. Para preparar un gran número de larvas sincronizada,
C. elegans
se cultivaron hasta que las placas estaban llenos de huevos, larvas y adultos y se eliminaron mediante un simple lavado con tampón M9. Después de 12 horas, las larvas eclosionadas se recogieron y se lavó tres veces con tampón M9. Hemos prescindido larvas L1 en placas de 96 pocillos que contenían una mezcla de muertos
E. coli
y los productos químicos se está ensayando. Después de 3-4 días, se observó el fenotipo Muv en un microscopio de disección (Fig. 3A). El uso de este protocolo, se realizó una pantalla de 1.280 pequeñas moléculas con dianas moleculares conocidos y eficacia. Entre los 1.280 productos químicos, AG1478 y U0126 inhibió el fenotipo Muv de
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. AG1478 es un inhibidor de EGFR se utiliza con frecuencia en
in vitro
experimentos, con una estructura similar a gefitinib (Fig. 3B). U0126, que se conoce como un inhibidor de MEK, inhibió la
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fenotipo Muv a 5 mM, pero no a concentraciones más bajas (Fig. 3C). Cuando los efectos de AG1478 y U0126 sobre el modelo resistente a gefitinib LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R]
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fueron probados, solamente U0126 tuvo un efecto inhibidor, mientras que AG1478 fue ineficaz (Fig. 3D).
(A) método de cribado, incluyendo la sincronización de los
C. elegans Opiniones y cultivo líquido utilizando la placa de 96 pocillos para la pantalla del inhibidor. (B) Las estructuras químicas de gefitinib, AG1478 y U0126. (C) Tanto AG1478 y U0126 inhiben el fenotipo de Muv
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de una manera dependiente de la dosis. (
n
= 295, 193, 381, 133, 254, 304 y 415 de izquierda a lo largo del eje X). (D) Efecto de gefitinib, erlotinib, AG1478 y U0126 en
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. Gefitinib, erlotinib, y AG1478 no inhibieron el fenotipo Muv de
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, pero U0126 inhibido. (
n
= 81, 99, 106, 90 y 81). concentración química, 5 mM. *
P
. & Lt; 0,001
inhibidores de MEK potencialmente pueden tratar cánceres resistentes a gefitinib
La observación de que U0126 inhibe el fenotipo Muv de
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sugerido que algunos inhibidores de MEK pueden tener el potencial para inhibir formas gefitinib resistente de mutaciones de EGFR. Por lo tanto, hemos probado los efectos de otro inhibidor de MEK, PD0325901, así como un Raf [V600E] inhibidor (AZD6233), y un EGFR [T790M] inhibidor (WZ4002) en nuestro sistema de modelo. Ninguno de estos productos químicos inhibe el fenotipo de Muv
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animales a dosis eficaces para U0126 (1 M o 5 M) (Fig. 4A). Sin embargo, a dosis más altas (5 M o 20 mM), el inhibidor de MEK PD0325901 inhibe ligeramente el fenotipo Muv de
jgIs25 gratis (Fig. 4B). Estos resultados fueron confirmados en un ensayo de lado a lado, donde
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y
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animales fueron tratados con 100 mM de cada producto químico para observar los efectos sobre el fenotipo Muv. WZ4002, que es un inhibidor contra el EGFR [T790M] mutación gatekeeper [36], inhibe el fenotipo de Muv
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mejor que la de
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. Al igual que en U0126, PD0325901 inhibe la perfección el fenotipo Muv de ambos
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y
jgIs25 gratis (Fig. 4C). También probamos si estos productos químicos destino
C. elegans
genes mediante el tratamiento de la
lin-15
Muv mutante con U0126 y PD0325901. Tanto U0126 y PD0325901 suprimen el fenotipo Muv de
lin-15
a una concentración excesiva (Fig. 4D). Este resultado sugiere que
MEK-2
, una de las MEK en
C. elegans Windows que está relacionado con el desarrollo de vulva, es uno de los posibles candidatos a blancos de U0126 y PD0325901.
(A) U0126, PD0325901 (inhibidor de MEK), AZD6244 (RAF [V600E] inhibidor) y WZ4002 (EGFR [T790M] inhibidor) se añadieron a
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. (
n
= 86, 94, 116, 64, 88, 66, 79, 110 y 98 de izquierda a lo largo del eje X). Se añadieron (B) Los productos químicos resistentes al gefitinib
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. inhibidores de MEK, U0126 y PD0325901, inhiben el fenotipo de Muv
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, pero las otras sustancias químicas no lo hicieron. (
n
= 64, 100, 128, 113, 89, 64, 63, 79 y 98). Se añadieron (C) Las dosis excesivas (100 m) de los productos químicos a
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y
jgIs25
. Dos inhibidores de MEK inhibieron la perfección el fenotipo Muv de
jgIs6
y
jgIs25
. WZ4002 inhibe el fenotipo Muv de
jgIs25
mejor que la de
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. (
n
= 160, 213, 186, 312, 195, 323, 192 y 237). (D) El fenotipo Muv de
lin-15
fue suprimida por U0126 y PD0325901; concentración química, 100 M (eje X). (
n
= 119, 89, 90 y 143). *
P Hotel & lt; 0,001
Todas las cepas transgénicas que expresan las quimeras EGFR activados, incluyendo
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y
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, crecen lentamente (. Fig. 5A y la Fig. S5) similar a cepas transgénicas que expresan ectópica LIN-3 /EGF [37]. Curiosamente, los inhibidores de EGFR-TK repararon la tasa de crecimiento de
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al nivel de tipo salvaje, y U0126 y PD0325901 rescataron a la tasa de crecimiento de ambos
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y
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(Fig. 5B).
(a) Las relaciones de adultos 3 días después de la colocación de los embriones en la placa. Todas las cepas de tipo salvaje eran adultos, pero la mayoría
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y
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cepas transgénicas eran más jóvenes que la etapa L4. Cinco adultos fueron transferidos a cada placa y se retiraron después de 6 horas de la puesta de huevos. Tres días después de eliminar gusanos P0, se observaron gusanos F1. Cuatro placas fueron contados para cada cepa. (
n
= 488, 313, 104 y 94 de izquierda a lo largo del eje X). *
P Hotel & lt; 0,001 y **
P Hotel & lt; 0,05. (B) y U0126 PD0325901 suprimen el fenotipo lento crecimiento de
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y
jgIs25
. Gefitinib y AG1478 suprimen el fenotipo lento crecimiento de
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, pero no
jgIs25
. larvas L1 etapa se incubaron con cada producto químico durante 4 días en placas de 96 pocillos, y se recuperaron en un plato fresco durante 6 horas antes de tomar fotografías.
C. elegans
creció lentamente cuando se cultivan en placas de 96 pocillos. Control (0,5% DMSO) y la concentración química (50 M). Barra de escala, 500 micras.
Discusión
Hemos construido transgénico
C. elegans
que contiene varios diferentes construcciones de EGFR. Las líneas transgénicas que expresan LET-23 :: hEGFR receptores quiméricos exhiben un fenotipo mucho más fuertes que las que expresan LET-23 :: receptores quiméricos hEGFR-TK (Tabla 1). Por desgracia, no hemos podido obtener líneas de integración para esas construcciones y sólo tienen datos producidos a partir de las líneas de integración de las líneas de let-23 :: transgénicos hEGFR-TK. La cola citoplasmática de hEGFR puede haber evolucionado para transmitir las señales activadas con mayor eficiencia que LET-23,
C. elegans
EGFR, incluso en las VPC.
Para establecer nuestro modelo de sistema, el quimérico LET-23 :: hEGFR-TK transgén se expresó en un fondo
let-23 gratis (+) . La posible formación de heterodímeros de endógena LET-23 con el LET-23 quimérico :: proteína hEGFR-TK puede explicar algunas observaciones que se hicieron en el curso de nuestro estudio. ocasionalmente se observó que las altas dosis de gefitinib inhibieron el desarrollo de vulva normal en el
jgIs6
.