Extracto
hipoxia localizada en tumores sólidos activa transcripcional programas que promueven la transformación metastásica de las células. Como inducible por hipoxia hiper-vascularización, la pérdida de la proteína retinoblastoma (Rb) es un rasgo común a los estadios avanzados de la progresión tumoral en muchos cánceres metastásicos. Sin embargo, se ha establecido ningún vínculo entre el papel de Rb y procesos metastásicos hipoxia impulsada. Hemos demostrado que Rb es un mediador clave de la respuesta hipóxica mediada por HIF1α /β, el regulador maestro de la respuesta a la hipoxia, y su esencial co-activador, el /proteína retinoblastoma-interactuar tiroides receptor de la hormona (TRIP230). Además, la pérdida de Rb desenmascara el potencial co-activación completa de TRIP230. El uso de pequeñas enfoques de ARN inhibitorio
in vivo
, establecimos que Rb atenúa la respuesta fisiológica normal a la hipoxia por HIF1α. En particular, la pérdida de Rb resulta en cambios bioquímicos hipoxia dependiente que promueven la adquisición de un fenotipo invasivo en las células de cáncer de mama MCF7. Además, Rb está presente en HIF1α-ARNT /complejos de transcripción asociados con HIF1β TRIP230 como se determinó mediante ensayos de co-inmunoprecipitación, GST-pull-down y el chip. Estos resultados demuestran que Rb es un modulador negativo de la transcripción regulado por la hipoxia en virtud de sus efectos directos sobre el complejo de HIF1. Este trabajo representa el primer eslabón entre la ablación funcional de Rb en las células tumorales y la activación transcripcional dependiente HIF1α y la invasión
Visto:. Labrecque MP, Takhar MK, Jagdeo JM, Tam KJ, Chiu C, Wang TY, et al. (2014) Un complejo de proteínas de retinoblastoma TRIP230-Regula factor inducible por hipoxia-1α mediada por transcripción y la invasión de células cancerosas. PLoS ONE 9 (6): e99214. doi: 10.1371 /journal.pone.0099214
Editor: Sonia Rocha, Universidad de Dundee, Reino Unido
Recibido: 5 de Marzo, 2014; Aceptado: 12-may de 2014; Publicado: 11 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Labrecque et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos se incluyen en el manuscrito
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de funcionamiento de la Fundación del Cáncer de Mama canadiense BC /Yukon (http://www.cbcf.org/bc/Pages/default.aspx ) y de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación, RGPIN 356355 (http://www.nserc-crsng.gc.ca/index_eng.asp) de Canadá a TVB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
factor inducible de hipoxia-1α (HIF1α), su ortólogo HIF2α, y su socio de dimerización del receptor de aril hidrocarburos translocador nuclear, (ARNT o HIF1β) que componen el complejo de HIF1 [1], [2] regula una la respuesta de las células a condiciones de bajo oxígeno. En el tejido sano, el complejo HIF1 dirige la expresión ordenada y estrechamente regulada de genes que controlan la
de novo síntesis de nueva vasculatura para apoyar el crecimiento de tejido o tejido de reperfusión. Durante la hipoxia, HIF1α acumula, se transloca al núcleo, y se une ARNT. Los HIF1 reclutas complejos co-activadores incluyendo CBP /p300 [3], y BRM /BRG-1 [4] y activa la expresión de genes, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), eritropoyetina (EPO) y los marcadores metastásicos, CXCR4 y lisil hidroxilasa procolágeno 2 (PLOD2) [1], [5], [6]. La evidencia sugiere que el complejo de HIF1 puede activar la expresión génica de forma independiente o en concierto con otros factores de transcripción [7], [8]. Demostración de que HIF1α es capaz de interactuar con c-Myc, Notch y más recientemente FOXA2 para dirigir la transcripción ordenada y mejorar la formación de tumores [9] - [11] deja abierta la posibilidad de que el complejo de HIF1 es una unidad transcripcional núcleo que modula la señalización intracelular múltiples redes, muchos de los cuales pueden estar implicados en la transformación metastásica. Por lo tanto, muchas de las moléculas que controlan diferentes aspectos de la función HIF1 aún no se han identificado.
El complejo HIF1 lleva a cabo esta función mediante el reclutamiento de proteínas co-activadoras de la transcripción incluyendo el receptor de la hormona tiroidea /a proteínas de retinoblastoma-interactuando 230 (TRIP230) a las regiones reguladoras de genes sensible a la hipoxia para activar la transcripción [12]. TRIP230, se identificó inicialmente como un receptor de la hormona tiroidea (TR) -interacting proteína que mejora la actividad de TR [13]. Además, TRIP230 se ha aislado como parte de la p160 co-activador complejo [14], una bona fide ARNT co-activador complejo [15]. Es importante destacar que, hemos demostrado que TRIP230 es reclutado por ARNT como un co-activador transcripcional y es esencial para la actividad transcripcional del complejo HIF1 [12]. Además, se demostró que TRIP230 interactúa con Rb y Rb que atenúa TR impulsada mejorada TRIP230 transcripción [16]. Esto y un estudio posterior demostró que sólo la forma hiper-fosforilada de Rb interactúa con TRIP230 [17] destacando una función de Rb distinta de su regulación canónica E2F-dependiente del ciclo celular, específica a su forma hipo-fosforilados.
pérdida de
RB1
, el gen que codifica para Rb [18], y o está asociada con el desarrollo y la progresión metastásica de muchos otros tumores sólidos, incluyendo cánceres de ovario pérdida de la función de Rb, pulmón, mama, próstata y el cerebro [19] - [23]. La función mejor entendido de Rb es el de células regulador del ciclo reprimir la función del factor de transcripción E2F de ese modo la mediación de la proliferación y la diferenciación celular [24]. Hipo-fosforilados Rb bloquea la progresión del ciclo celular mediante la unión a factores de transcripción E2F y que afectan a los resultados de transcripción E2F-dependientes. Lo hace mediante el reclutamiento de proteínas represor transcripcional remodelación de la cromatina como Sin3a /b, HDAC, SUV39H1 y DNMT1 [25] - [27]. Hyper-Rb fosforilada no puede reprimir E2Fs y les permite activar o reprimir diversos programas de expresión génica [24].
Estudios recientes sugieren que Rb puede tener funciones fisiológicas además de su función de E2F canónica [28]. Anteriormente, hemos demostrado una interacción directa entre TRIP230 y ARNT [12]. Además, hemos demostrado que TRIP230 era indispensable para la transcripción mediada por dos socios de dimerización distintos de ARNT, a saber, el receptor de aril hidrocarburos y HIF1α [12]. En este informe, que proporcionan la primera evidencia de la existencia de un complejo Rb-TRIP230-ARNT que media la transcripción HIF1. Además, se demuestra que Rb atenúa la actividad de los complejos de transcripción ARNT en virtud de su asociación con TRIP230 e independiente de E2F. En última instancia, este trabajo revela la capacidad de Rb para modular la expresión génica HIF1-activado con consecuencias para la transformación de células de cáncer.
Resultados
Expresión Génica HIF1-regulada se ve reforzada por siRNA knock-down de Rb
TRIP230 se sabe que se une directamente al TR y ARNT [12], [16]. Teniendo en cuenta que la hiper-fosforilados-Rb reprime TRIP230 co-TR activada la actividad [16], [17] y que se requiere la expresión TRIP230 para la actividad transcripcional de los socios ARNT, AHR y HIF1α [12], la hipótesis de que Rb podría atenuar la hipoxia la transcripción de genes inducible. Con el fin de examinar el papel de Rb en la acumulación de especies de ARNm del gen diana inducible por hipoxia, que agotados Rb en líneas celulares de cáncer humano por génica mediada por siRNA
knock-down
. células MCF7 y LNCaP fueron transfectadas con cualquiera revueltos (SCX) controlar siRNA o dos siRNAs Rb-específicos y la acumulación de mRNA de los genes diana HIF1 expuestas a normoxia e hipoxia se compararon (Figura 1). Rb ARN y los niveles de proteína fueron suprimidas de forma equivalente, tanto en condiciones de normoxia e hipoxia (Figuras 1A y E). No se observó cambio en CXCR4 o la expresión del VEGF en las células transfectadas Rb siRNA en condiciones de normoxia, sin embargo, un aumento en la acumulación PLOD2 mRNA en condiciones de normoxia se observó en células MCF7 (Figura 1D), pero no en las células LNCaP (Figura 1E). Además, las células MCF7 transfectadas con los siRNAs Rb-específicos exhiben aumentó significativamente la acumulación de mRNA de los genes diana HIF1 CXCR4, VEGF y PLOD2 en condiciones de hipoxia (Figura 1B-D). Se observó un efecto dependiente de la hipoxia similar sobre CXCR4, VEGF y PLOD2 de inducción en respuesta a la expresión suprimida Rb en células de cáncer de próstata LNCaP (Figura 1E) lo que sugiere que esta observación no es una célula tipo específico.
células MCF7 (A , células LNCaP B, C y D) y (e) fueron transfectadas con cualquiera revueltos siRNA (SCX) o Rb siRNAs SIRB 1, y SIRB 2. Veinticuatro horas después de la transfección las células fueron o bien mantenerse en condiciones de normoxia o 1% o
2 durante 24 h. La expresión génica se determinó por cuantitativa en tiempo real PCR después del aislamiento y la transcripción inversa del ARN total. VEGF, CXCR4, PLOD2 y Rb expresión se normalizaron a la expresión de genes 36B4 constitutivamente activa. Las barras abiertas representan normoxia (20% O
2) y cerrado (gris) barras representan la hipoxia (1% O
2). Las barras de error representan ± S. D. * P & lt;. 0,05
Rb y Rb-represor proteínas asociadas son reclutados para las regiones reguladoras de genes inducible por hipoxia durante la transcripción activado
Hemos observado que la pérdida de Rb como resultado la expresión exagerada de HIF1 genes diana de una manera dependiente de la hipoxia. Por lo tanto, estábamos interesados en determinar si la presencia de Rb se podría registrar más de las regiones reguladoras de genes regulados HIF1 que albergan elementos de respuesta a la hipoxia bien caracterizados durante la transcripción activado; a saber, el promotor de VEGF y potenciador de EPO. Un esquema de estas regiones y la colocación de los oligonucleótidos para la amplificación por PCR de la cromatina se representan en la Figura 2A. inmuno-precipitación (CHIP), el análisis reveló que la cromatina asociados con Rb regiones reguladoras de los genes regulados, HIF1-VEGF y EPO en una forma dependiente de la hipoxia en las células MCF7 (Figura 2B). Para asegurar que nuestras condiciones experimentales producen la respuesta apropiada a la hipoxia, también precipitó la cromatina con anticuerpos frente a HIF1α, ARNT, TRIP230 o una IgG de conejo de control. Control de IgG fue incapaz de precipitar la cromatina que contiene las regiones reguladoras de VEGF y EPO. Como hemos demostrado anteriormente [12], que eran más fácilmente capaces de amplificar la cromatina precipitada tratada de hipoxia lisados que de los derivados de lisados mantenidos en condiciones de normoxia utilizando los anticuerpos HIF1α, ARNT, TRIP230 y Rb. Podríamos amplificar los bajos niveles de VEGF promotor y potenciador de la EPO en condiciones de normoxia (Figura 2B), cuando la precipitación de la cromatina con nuestro anticuerpo TRIP230, por lo tanto, no podemos descartar la posibilidad de que TRIP230 asociados con HREs a niveles bajos a pesar de la tensión de oxígeno normal. Sin embargo, nuestra incapacidad para detectar la proteína o HIF1α HIF2α en estas condiciones (Figura 2C) sugiere la posibilidad de que Rb no es reclutado para estas regiones de EDH en condiciones de normoxia
.
(A) Un esquema del promotor proximal y VEGF potenciador de la EPO y la ubicación relativa de los oligonucleótidos utilizados para la amplificación por PCR. (B) El estado de HIF1α, ARNT, TRIP230, y Rb en el promotor de VEGF y potenciador de EPO en las células MCF7 como se ensayó por la cromatina-inmuno-precipitación (ChIP) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y en comparación con la amplificación de las reacciones de derivados de lisados se precipitó con IgG control. Se realizaron todos los chips de al menos tres veces, excepto donde se indica. los niveles de proteína (C) y HIF1α HIF2α se enriquecen de manera espectacular durante la hipoxia en las células MCF7. células MCF7 se mantuvieron en cultivo en cualquiera de 20% o 1% O
2 para 24 h. Los extractos nucleares se analizaron por inmuno-blot y las membranas se sondearon con anticuerpos purificados por afinidad a HIF1α y α-tubulina. ChIP secuencial del promotor de VEGF proximal y potenciador de EPO usando anti-HIF1α (D) o anticuerpos purificados por afinidad contra-ARNT (E) seguido por inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Rb anti-TRIP230 y. (F) ChIP del promotor de VEGF después en las células MCF7 después de la transfección con cualquiera revueltos siRNA o siRb1 e inmuno-precipitación con el anticuerpo anti-TRIP230. Los valores se expresan como el enriquecimiento de veces sobre el control y se determinaron por cuantitativa en tiempo real PCR. Cada valor experimental se corrigió para la entrada y los experimentos se realizaron dos veces. (G) Análisis inmuno-blot de lisados de células MCF7 siRNA-transfectadas utilizados en experimentos chip. (H) chip de proteínas del complejo Rb-represor en células MCF7. Las células fueron tratadas como se describe arriba y la cromatina complejos fueron aisladas con anticuerpos purificados por afinidad dirigidos a Sin3a, sin3b, y las HDAC 1-3.
Hemos ampliado nuestras investigaciones en un intento por determinar si TRIP230 y Rb tienen la capacidad de interactuar con elementos de ADN individuales en concierto con HIF1α y ARNT en elementos de respuesta de hipoxia. Se realizó un chip de ensayo de dos etapas secuenciales, en primer lugar aislando la cromatina con anticuerpos purificados por afinidad a Arnt o HIF1α seguido de precipitación de estas fracciones purificadas de la cromatina con anticuerpos para TRIP230 y Rb. En cada caso promotor VEGF ADN fue amplificado por PCR de una manera dependiente de la hipoxia (Figura 2D y E) lo que sugiere fuertemente que HIF1α, ARNT, TRIP230 y Rb están presentes en HREs en un complejo multi-proteína. Además, knock-down de Rb según la evaluación de inmuno-blot (Figura 2G), no dio lugar a un mayor enriquecimiento de TRIP230 en el promotor de VEGF (Figura 2F) lo que sugiere que Rb no interfiere con TRIP230 reclutamiento a elementos de respuesta HIF1.
por último, estábamos interesados en ver si se conocen represor complejos asociados-Rb [26], [27] estuvieron presentes en estos elementos durante la transcripción impulsada por la hipoxia. Chip análisis reveló la Sin3a /b, HDAC1 y HDAC3 se enriquecieron en las regiones reguladoras de HIF-sensible tanto del VEGF y los genes de EPO en condiciones de hipoxia (Figura 2H) apoyan nuestra hipótesis de que Rb es parte de represor actúa complejo transcripcional en HIF1-regulada transcripción. Por el contrario, HDAC2 se comportó de una manera más canónica y fue despedido de estas regiones en una forma dependiente de la hipoxia (Figura 2H). Estos datos sugieren que las proteínas represor transcripcional son reclutados para genes regulado por la hipoxia durante la transcripción activado. Por otra parte, estas observaciones apoyan la hipótesis de que la transcripción debe ser atenuada para garantizar la respuesta transcripcional apropiado.
ARNT y TRIP230 son esenciales para la regulación de Rb-HIF1 Actividad
proteínas
Desde Rb y TRIP230 están interactuando , los cuantitativos RT-PCR experimentos se repitieron utilizando un siRNA dirigido a TRIP230. la inducción de genes de hipoxia de la acumulación de CXCR4 ARNm se deteriora severamente al derribo de TRIP230 (Figura 3A y B). Knock-down de Rb en estas condiciones, como lo demuestra el análisis de inmuno-blot (Figura 3B) no dio lugar a un aumento significativo de CXCR4 ARNm, proporcionando una prueba más de que este efecto es dependiente de TRIP230. Imágenes de enteros inmuno-borrones se pueden encontrar en la Figura S1. Además, la pérdida de Rb no condujo a un aumento en la acumulación de mRNA de CXCR4 en células de ablación para ARNT por siRNA mediada por knock-down lo que sugiere además que el efecto mediado por Rb es la hipoxia-dependiente (Figura 3C y D). Además, la supresión de ARNsi mediada de expresión DP1 en las células MCF7 respondió a la hipoxia tan fácilmente como las células de control (Figura 3C y E) que indican que la función moduladora de Rb en genes HIF-regulada es independiente de E2F y desacoplado de papel canónica de Rb como un mediador del ciclo celular. células MCF7
(a) fueron transfectadas con cualquiera revueltos siRNA (SCX) o Rb siRNAs SIRB 1, y SIRB 2, o una combinación de TRIP230 siRNA y siRb1. Veinticuatro horas después de la transfección las células fueron o bien mantenerse en condiciones de normoxia o 1% O
2 durante otros 24 h. La expresión génica se determinó por cuantitativa en tiempo real PCR después del aislamiento y la transcripción inversa del ARN total. CXCR4 expresión se normalizó a la expresión de genes 36B4 constitutivamente activa. (B) Análisis de Immuno-blot de TRIP230 y Rb después de la transfección de ARNsi con cualquiera revueltos siRNA, o una combinación de siTRIP230 y SIRB. Alfa-tubulina (α-tubulina) se utilizó como control de carga. las células (C) MCF7 fueron transfectadas con siRNA ya sea revueltos (SCX) o Rb siRNAs SIRB 1, y SIRB 2, o ARNT, o DP1 siRNA o una combinación de ARNT /Rb1 siRNA y se trataron como se ha descrito anteriormente. (D) Inmuno-blot de ARNT y α-TUB después de la transfección, ya sea con el control de revueltos siRNA dirigido a ARNT. (E) Inmuno-blot de DP1, TRIP230 y α-tubulina (α-tubulina). células MCF7 fueron transfectadas con cualquiera revueltos control (SCX) o siRNA dirigido a DP1. Los datos en la Figura 3A y 3C se analizaron utilizando una de dos vías-ANOVA. * P & lt;. 0,01
La pérdida de Rb conduce a un aumento en la expresión genética de HIF1 Objetivo Proteína
Estábamos interesados para determinar si el efecto de la pérdida de Rb-sobre la acumulación de mRNA se refleja a nivel de proteínas de HIF1 genes diana y, en particular, si se vieron afectados factores pro-metastásicos. Por lo tanto, también se examinó el papel de la Rb en la expresión de marcadores metastásicos aguas abajo que son sensibles a la hipoxia. La pérdida de Rb resultó en un aumento concomitante en los niveles de proteína CXCR4 después de 48 h de hipoxia y PLOD2 después de 96 h de hipoxia (Figura 4A). Además, un 24 h de exposición a la hipoxia con Rb knock-down también dio lugar a un aumento en la expresión del marcador mesenquimal, vimentina (Figura S2A). Además, la pérdida de Rb no aumentó los niveles endógenos de HIF1α (Figura 4A), lo que sugiere que el efecto hipóxico observado no era debido a un aumento en la expresión o estabilidad HIF1α. Por último, los informes previos demostraron que los TRIP230 asociados con hiper-fosforilados Rb [16], [17]. lisados de inmunotransferencia de células MCF7 y LNCaP con anticuerpos dirigidos a Rb, Rb-fosfo-serina
780 y Rb-fosfo-serina
807/811 demuestran que hay una cantidad significativa de Rb fosforilada en MCF7 y LNCaP las células (Figura 4B).
células MCF7 (a) fueron transfectadas con siRNA o bien revueltos (SCX) o Rb siRNAs Sirb 1 y 2. Sirb Rb, CXCR4, HIF1α, PLOD2 y los niveles de proteína alfa-tubulina fueron evaluada por inmuno-blot después de la exposición a la atmósfera de o
2 o 1% de o
2 de 48 (Rb y CXCR4) o 96 h (HIF1α, y PLOD2). (B) Inmuno-borrones de lisados de células enteras de MCF7 y células LNCaP ya sea a la izquierda en normoxia (N) o tratados con 1% O
2 durante 6 h (H). Las transferencias se sondearon con anticuerpos primarios a un total de Rb, Rb-fosfo-serina
780 (Rb-PS
780), Rb-fosfo-serina
807/811 (Rb-PS
807/811 ), o α-tubulina como control de carga.
La pérdida de Rb promueve un fenotipo invasivo de células de cáncer mamario MCF7
La capacidad de Rb knock-down para mejorar HIF1 complejo transcripcional actividad y expresión de la proteína nos llevó a evaluar si la supresión Rb también podría mejorar la invasión celular inducida por hipoxia en células de cáncer de mama MCF7 tradicionalmente no invasivos [29]. Para las células con un complemento completo de Rb (células transfectadas es decir, con control de SCX siRNA), la hipoxia no tuvo efecto sobre la invasión de células MCF7 en el matrigel (Figura 5A y B). Sin embargo, siRNA knock-down de Rb llevado a una mayor invasión de las células MCF7 bajo condiciones de hipoxia, pero no tuvo ningún efecto sobre la invasión en condiciones de normoxia (Figura 5A y B). Estos datos apoyan el papel de Rb como un supresor de tumor de programas metastásicos regulado por la hipoxia.
Veinticuatro horas después de siRNA transfección, las células se sometieron al ensayo de invasión de Matrigel. Las placas se incubaron en normoxia (20% O
2) o condiciones hipóxicas (1% O
2) a 37 ° C durante 24 h y las células invasoras se fijaron y se visualizaron con azul de toluidina. Las fotomicrografías (A) de las células MCF7 matrigel embebido. (B) la representación numérica de invasión relativo de células MCF7 matrigel embebido después del tratamiento con SCX o SIRB y la exposición a condiciones de normoxia o hipoxia (n = 6), (C) de la precipitación de Rb en las células MCF7 no altera la proliferación celular en respuesta a CoCl
2. Las células fueron transfectadas con siRNA de como se describe anteriormente. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se trataron con vehículo o 100 mM CoCl
2 para activar HIF1α y las células se contaron a las 0, 6, 12, 24, 36 48, y 72 h más tarde. Las barras de error representan ± S.E.M. * P & lt;.
0,01
Nos preocupaba que el aumento de la capacidad invasora podría ser debido a un aumento dramático en la proliferación celular debido a la pérdida de control de Rb del ciclo celular. Para evitar períodos de prolongada, hipoxia severa, hemos demostrado que el agente estabilizante HIF1α CoCl
2 sería imitar los efectos de la hipoxia en el ensayo de Matrigel (Figura S2C). Estos datos apoyan aún más nuestra hipótesis de que los efectos observados están mediados por el complejo HIF1. Con CoCl
2 establecido como un imitador efectiva de la hipoxia después de knock-down de Rb en el ensayo de Matrigel, hemos sido capaces de determinar si el aumento observado en la invasión de células se debió a un aumento en la proliferación celular (Figura 5C). la dinámica del crecimiento de células MCF7 fueron monitorizados a intervalos regulares contando las células viables durante un periodo de 72 h. En las células transfectadas con cualquiera de SCX ARNsi de control o Rb siRNA y con muestras separadas de cada mantuvimos ya sea en presencia o ausencia de CoCl
2, se observó que la pérdida de Rb disminución de la proliferación tanto en-un tratado y CoCl
2 células tratadas (Figura 5C), sin diferencia significativa entre los otros tratamientos. Del mismo modo, la invasión de matrigel de células de control SCX era indistinguible bajo cualquiera de estas condiciones. Clasificación de células después de la tinción con yoduro de propidio reveló una proporción mayor de las células knock-down Rb en la fase sub-G1 del ciclo celular (Figura 5D y E). Tomados en conjunto, estos datos sugieren fuertemente que la pérdida de Rb promueve la invasión de células de una manera dependiente de la hipoxia y que estos efectos no se deben al aumento del número de células o la proliferación.
Rb Asociados con el PAS-B /TRIP230- interacción dominio de la proteína ARNT
la posibilidad de que ARNT, TRIP230 y Rb pueden ser parte de un complejo multimérico fue explorada por inmuno-precipitación de complejos TRIP230 asociado de los extractos nucleares de células MCF7 se incubaron durante 6 h bajo condiciones hipóxicas condiciones (Figura 6A). análisis de Immuno-blot reveló ARNT y Rb estén presentes en el anti-TRIP230 inmuno-precipitado mientras que ninguno de los tres factores se detectaron en lisados de precipitados realizados con IgG no inmune. Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que la proteína TRIP230 nativo es capaz de interacciones proteína-proteína con ARNT y Rb.
(A) Immuno-blot de los complejos precipitó usando un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a TRIP230 o control IgG de ratón de los extractos nucleares de las células MCF7. Las transferencias se probaron para la presencia de TRIP30, ARNT y Rb. El carril de la izquierda de cada mancha contiene extracto nuclear que representa el 10% de la entrada. (B) GST-ARNT-PAS-B es capaz de tirar hacia abajo TRIP230 y Rb. análisis de inmuno-blot de GST-ARNT-PAS-B desplegable y GST pull-down de TRIP230 y Rb a partir de extractos nucleares MCF7. restos GST se fijan a perlas de glutatión-agarosa y se incubaron durante 90 min a 4 grados C con 500 g de extracto nuclear de células MCF7. carriles de entrada se cargaron con 250 g de extracto nuclear. Las transferencias completas para los paneles A y B se pueden encontrar en el Adicional Figura S1. GST-ARNT-PAS-B es capaz de tirar hacia abajo fosforilados Rb. (C) Análisis inmuno-blot de GST-ARNT-PAS-B desplegable y GST pull-down de Rb-fosfo-serina
780 (Rb-PS
780) de MCF7 extractos nucleares cosechadas a partir de células de la izquierda en normoxia (N) o se trataron con 1% de o
2 durante 6 h (h). ensayo de inmuno-precipitación (D) de la cromatina de EPO y potenciador de VEGF promotor regiones en las células MCF7 con el control o Rb-fosfo-serina
780 anticuerpos. Las células se trataron como se describe anteriormente. Rb atenúa mediada por TRIP230 co-activación de la actividad transcripcional dependiente de ARNT. Los dominios Rb y ARNT-interacción se indican. células Hepa-1c1c7 (E) y células MCF7 (F) fueron transfectadas con una hipoxia de respuesta de luciferasa impulsado por 4xHRE construir como reportero, plásmidos de expresión para TRIP230, TRIP230ΔRB y Rb como se indica y se sometió a 1% O
2 o atmosférica (20%) O
2 durante 24 h. Lisados de células enteras se sometieron a ensayo para la actividad luciferasa. (G) Un esquema de la mutante TRIP230ΔRB. niveles (H) TRIP230 de proteínas no se ven afectadas por la transfección de plásmido de expresión de Rb en células Hepa1c1c7. Lisados de células enteras fueron analizados por inmuno-blot y las membranas se sondearon con anticuerpos purificados por afinidad a TRIP230, Rb y α-tubulina. * P & lt;.
0,05
Dado que la anterior
in vitro
estudios de interacción Rb determinó que no interactúa directamente con ARNT [30], por lo tanto, estábamos interesados en determinar si la interacción TRIP230 dominio dentro de ARNT podría utilizarse para aislar Rb a partir de extractos nucleares de células MCF7. Partch y sus colegas han identificado que el dominio de interacción TRIP230 dentro de ARNT se encuentra en su región PAS-B [31]. Hemos fusionado aminoácidos 344-479 que alberga el dominio PAS-B ampliada de ARNT ratón para GST. El uso de este dominio de interacción mínima se hizo en parte para reducir el potencial de ARNT para interactuar con otras proteínas nucleares. Desplegable de TRIP230 y Rb a partir de extractos nucleares de células MCF7 hipoxia acondicionado fue dramáticamente enriquecida utilizando el dominio GST-ARNT-PAS-B en comparación con GST sola (Figura 6B). Por lo tanto, es posible que un complejo de ARNT incluyendo TRIP230 y Rb se forma a través del dominio PAS ARNT-B. Este dominio media la interacción entre ARNT y múltiples co-activadores que son esenciales para la transcripción mediada por ARNT: a saber, TRIP230 [12], los p160 /NCoA /SRC-familia de la transcripción co-activadores [15], y el cacao [32] .
por último, hemos querido determinar específicamente, si Rb hiper-fosforilados estuvo implicado en la transcripción de genes regulados HIF1. Que probaron inmuno-borrones con un anti-fosfo-serina
780 Rb-anticuerpo específico después desplegable utilizando GST-PAS-B. De esta manera, se observó Rb hiper-fosforilada en transferencias generados a partir de extractos nucleares de células MCF7 normóxicas e hipóxicas (Figura 6C). Además, la interrogación de las regiones reguladoras de la transcripción del promotor de VEGF-HRE que contiene y potenciador de EPO reveló la presencia de Rb-pSer
780 de una manera dependiente de la hipoxia (Figura 6D).
TRIP230 media la Efectos represivas de Rb en HIF-regulada Transcripción
Hemos establecido que Rb co-purifica con TRIP230 Rb y que atenúa la acumulación de ARNm del gen diana inducible por hipoxia y los niveles de proteína. Con el fin de determinar si la capacidad de Rb para modular la actividad transcripcional HIF1-regulada fue mediada a través de TRIP230, examinamos los efectos de Rb en la expresión de un constructo indicador sensible a la hipoxia utilizando mutantes de deleción de TRIP230 en líneas celulares-RB negativas y positivas a . Hepa1c1c7 células RB-negativo fueron transfectadas con un plásmido de expresión que codifica TRIP230, o una transcripcionalmente competente supresión mutante de TRIP230 (TRIP230ΔRb; esquemática en la Figura 6G) que carece del dominio Rb-interacción [17], un plásmido de expresión Rb cDNA, y una sintética constructo indicador de luciferasa que contiene un promotor multimerizada elemento sensible a la hipoxia (HRE) (Figura 6E). Rb abrogó la inducción hipóxica de la actividad del indicador en las células transfectadas con el tipo salvaje TRIP230, pero fue ineficaz en las células transfectadas con el mutante TRIP230. La transfección de Rb en la línea celular Hepa1c1c7 no tuvo ningún efecto sobre los niveles de proteína TRIP230 endógeno (Figura 6H). De hecho, la titulación de cantidades crecientes de plásmido Rb-expresión reprimida la actividad indicadora inducible por hipoxia en una forma dependiente de la dosis (Figura S2B). La transfección de la TRIP230 mutante en células de cáncer de mama humano MCF7 Rb-positivas mejora aún más la expresión del gen reportero (Figura 6F), actuando así como un probable dominante negativo al competir por HREs con la TRIP230 de tipo salvaje endógeno. Estos datos sugieren colectivamente que los efectos atenuantes de RB en la actividad transcripcional HIF1 parecen estar mediados por TRIP230.
Discusión
Hemos determinado que Rb atenúa la respuesta fisiológica a la hipoxia por HIF1α y que es una parte integral e indispensable del complejo transcripcional HIF1 en virtud de una interacción directa con TRIP230. Este efecto es independiente de otras interacciones proteína-proteína como el efecto represivo de Rb se perdió en las células que sobre-expresan un mutante transcripcionalmente competente de TRIP230 que carece del dominio Rb-interacción (Figura 6E y F) y en las células agotadas de TRIP230 (Figura 3A ). Además, mediada por siRNA knock-down de Rb condujo a un aumento concomitante de conocidos genes diana HIF1 de una manera hipoxia-dependiente en MCF7 mama humano y en líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP humanas (Figura 1). Por otra parte, hemos sido capaces de registrar más de Rb HREs bien caracterizados en las regiones reguladoras de EPO y VEGF (Figura 2) lo que sugiere que Rb puede regular la expresión de estos genes a nivel transcripcional.
El TRIP230 fue co-activador clonado y caracterizado en base a su capacidad de interactuar con el receptor de la hormona tiroidea (TR) y mejorar su función de transactivación [13], [16], y en virtud de su capacidad para interactuar con Rb [16]. En este último informe, se presentó evidencia que apoya el papel de Rb como un atenuador de la transcripción de la función del receptor de la hormona tiroidea, probablemente mediada a través de la TRIP230 co-activador transcripcional. TRIP230 se encontró más tarde para actuar como un co-activador esencial para las actividades de transcripción ARNT-dependientes, incluyendo la expresión génica inducible por hipoxia [12]. Es importante el descubrimiento de que TRIP230 no interaccionan con HIF1α en un ensayo de dos híbridos de levadura (T. Beischlag, datos no publicados). Nuestros estudios de inmuno-precipitación que emplean anticuerpos dirigidos a TRIP230 demuestran que endógena ARNT y Rb interactúan con TRIP230 en las células MCF7 (Figura 6A) más el apoyo a nuestra hipótesis de que Rb es parte de un complejo transcripcional HIF1.
Para definir con mayor precisión la naturaleza de este complejo putativo y para determinar si existen ARNT, TRIP230 y Rb en un solo complejo, eliminamos otras interfaces conocida la interacción proteína-proteína dentro de ARNT y utilizamos una estrategia desplegable GST de afinidad TRIP230 captura y Rb. El análisis exhaustivo por parte de GST pull-down realizado por Elferink y sus colegas no logró demostrar una interacción directa con ARNT y Rb
in vitro
[30]. Además, basado en nuestros estudios anteriores que caracterizan la interacción entre ARNT y TRIP230 [12], Partch y sus colegas identificaron los aminoácidos dentro del dominio PAS-B ARNT que median la interacción ARNT-TRIP230 [31]. Hemos diseñado una fusión GST-ARNT-PAS-B eliminando de este modo otros dominios de interacción de proteínas dentro de ARNT. La capacidad de la región ARNT-PAS-B para tirar hacia abajo Rb apoya la existencia de un complejo multi-meric contiene ARNT, TRIP230 y Rb (Figura 6B). De hecho, el dominio PAS-B se ha convertido en una plataforma de buena fe para la contratación de las múltiples formas de corregulación complejos de transcripción [12], [15], [31], [33].
El HIF1