Extracto
Para identificar los mecanismos moleculares asociados a la agresividad y los candidatos de biomarcadores en el cáncer de vejiga, se realizó un SILAC (isótopos estables de etiquetado de Aminoácidos en cultivo celular) análisis proteómico comparar un T24 invasivo y metastásico una agresiva derivada T24T vejiga línea celular de cáncer. Un total de 289 proteínas se identificaron expresó diferencialmente entre estas células con alta confianza. validación y análisis complementarios comparación incluyó datos de SILAC proteínas con coeficientes de la expresión de ARNm obtenidos a partir de microarrays de ADN, y la inmunotransferencia. Cul3, una proteína sobreexpresada en T24T, que participan en la ubiquitinación y la posterior degradación proteasomal de proteínas diana, fue seleccionado para una mayor investigación. Análisis funcional revelaron que Cul3 silenciar proliferativa disminuida, la migración y las tasas invasivos de células T24T, y restauraron la expresión de las proteínas del citoesqueleto identificadas para ser underexpressed en las células T24T por SILAC, como ezrin, moesina, filamin o caveolina. Cul3 patrones de proteínas inmunohistoquímicos realizados en los tumores de vejiga manchas en microarrays de tejidos (n = 284), se asociaron con la estadificación tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos y la supervivencia específica de la enfermedad. Por lo tanto, el enfoque de SILAC identificó que Cul3 modula el fenotipo agresivo de células T24T mediante la modificación de la expresión de las proteínas del citoesqueleto implicadas en la agresividad del cáncer de vejiga; y jugó un papel biomarcador de la progresión del cáncer de vejiga, metástasis ganglionar y la evaluación del resultado clínico
Visto:. Grau L, Luque-García JL, González-Peramato P, D Theodorescu, Palou J, Fernández-Gómez JM, et Alabama. (2013) Un análisis proteómico cuantitativo descubre la relevancia de la Cul3 en agresividad del cáncer de vejiga. PLoS ONE 8 (1): e53328. doi: 10.1371 /journal.pone.0053328
Editor: John Matthew Koomen, Moffitt Cancer Center de los Estados Unidos de América
Recibido: 19 de mayo de 2012; Aceptado: noviembre 30, 2012; Publicado: 8 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Grau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca (SAF2009-13035) del Ministerio de Educación y Cultura Españolas (a MS-C.). J.L.L.-G. fue apoyado por el programa "Ramón y Cajal", y la concesión CTQ2010-18644 del Ministerio de Economía y Competitividad español. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga representa el cuarto cáncer más común entre los hombres y la octava causa más frecuente de muertes por cáncer en varones [1]. Clínicamente, aproximadamente el 75% de los carcinomas de células transicionales (TCC) son no músculo invasivo (TIS, Ta y T1), 20% de músculo infiltrante (T2-T4), y un 5% metastásica en el momento del diagnóstico [1]. Los tumores de bajo grado son papilar y por lo general no invasivo, mientras que los tumores de alto grado pueden ser papilar o no papilar, y con frecuencia invasivo. Los pacientes diagnosticados con TCC localizado tienen una tasa de supervivencia a 5 años por encima del 90%. Sin embargo, los pacientes con enfermedad metastásica distante y regional tienen una tasa de supervivencia a 5 años por debajo del 50% y 10%, respectivamente [1]. la progresión del cáncer de vejiga sigue los pasos secuenciales complejos, no completamente entendido [2] - [4]. Las diferencias en el comportamiento de agresividad se han descrito entre la línea celular de cáncer de vejiga invasivo T24 y la variante más agresiva T24T que se desarrolla metástasis después de la inyección en la vena caudal [5] - [9]. Identificación de proteínas expresadas diferencialmente entre estas células podría descubrir mecanismos moleculares asociados con la agresividad del tumor in vitro que puede conducir a metástasis. Las proteínas que participan en tales vías pueden servir como marcadores biológicos, ya sea para la identificación temprana de resultado agresiva y /o potencialmente ser terapéuticamente objeto de orientación.
proteómica cuantitativa contribuye al descubrimiento de biomarcadores diana y específica de la enfermedad candidato. Mientras que las proteínas y anticuerpos matrices permiten la cuantificación diferencial de proteínas conocidas [10], [11], las técnicas de espectrometría de masas conducen a la identificación de proteínas [12]. el etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) implica la adición de (12) C- y (13) C-etiquetados aminoácidos a los medios de crecimiento de las células cultivadas por separado, dando lugar a células que contienen la "luz" o "pesado" proteínas, respectivamente [12] - [31]. Para nuestro conocimiento, SILAC no ha sido reportado en el cáncer de vejiga. A continuación, se aplicó un análisis proteómico cuantitativo de las células T24 y T24T para identificar las proteínas y las vías relacionadas con su agresividad diferencial siguientes nuestro diseño experimental (Figura 1).
Se realizaron análisis funcionales para evaluar el diferencial fenotipo agresivo de T24 y células de cáncer de vejiga T24T sobre: A) la proliferación, B) la invasión, la migración y C). El promedio de los experimentos por duplicado para cada ensayo funcional de estas células en varios puntos de tiempo está representado en cada panel. D) Diagrama esquemático que muestra el flujo de trabajo utilizado para los experimentos basados en SILAC multiplexados. Se llevó a cabo el etiquetado interno
in vitro
, los extractos de proteínas se fraccionaron mediante SDS-PAGE, se digirió con tripsina en gel, y digiere trípticos se analizaron por LC-MS /MS para identificar y cuantificar las proteínas presentes. E) La comparación de los cambios en las proteínas identificadas por SILAC se realizó con las observadas por arrays de oligonucleótidos. F) La validación de los cambios en las proteínas identificadas por SILAC en transferencias Western de extractos proteicos obtenidos a partir de células T24-T24T. G) La inmunohistoquímica en tejidos arrays que contienen los tumores de vejiga sirve para validar las asociaciones de proteínas identificadas con variables clínico en cáncer de vejiga. H) silenciamiento ARNsi de las proteínas identificadas y los posteriores análisis funcionales y de validación inmunotransferencia sirven para evaluar el impacto de los candidatos identificados en el fenotipo agresivo de T24T y la regulación de otras proteínas expresadas diferencialmente identificados por SILAC.
Materiales Métodos y
1. Análisis funcional de las células del cáncer de vejiga T24 y T24T
Cultivo celular.
T24 se obtuvo de la American Type Culture Collection y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [32], [33]. T24T se derivó de T24 en el laboratorio del Dr. Theodorescu [5] - [9]. Las células se cultivaron durante 4-6 pasajes y se recogieron en 75% -90% de confluencia. Los sedimentos celulares se lavaron tres veces en PBS frío, y se congelaron a -20 ° C antes de ARN y proteína de extracción.
Ensayo de proliferación
1.2x10
4 células por pocillo fueron sembradas en 96 -Bueno placas por triplicado en DMEM que contenía FBS al 10%. Después de cultivar durante 24, 48, 72 y 96 horas, la proliferación se midió con el ensayo MTT (Roche, Mannheim, Alemania).
Heridas ensayo de curación.
3.5x10
5 células se sembraron en placas de 6 pocillos, y una herida se hizo en la monocapa usando una punta de pipeta estéril una vez que las células alcanzaron la confluencia. Se tomaron fotografías de las células que invaden la herida en los tiempos indicados.
ensayo de invasión.
Cultivo de células de placas de 24 pocillos insertos (tamaño de poro 8 micras, BD Biosciences, San José, CA) fueron sembró con 2.5x10
4 células T24 y T24T, y también con células T24T después de 24 y 48 horas después de la transfección con Cul3 siRNA (50 nM) en 500 l de medio DMEM con 0,1% de FBS en la cámara superior. Medio con 10% de FBS (500 l) se añadió a la cámara inferior como un agente quimiotáctico. cámaras de invasión Matrigel (BD) se mantuvieron durante 24 horas en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO
2 atmósfera. Las células de ambos lados de la cámara de matrigel se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 minutos, se lavaron con PBS, se tiñeron con 1μg /ml de 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI: Sigma, St Louis, MO) durante 10 minutos , y se analizaron por microscopía confocal (Leica TCS-SP5, Wetzlar, Alemania). El número de células invasoras se evaluó con el software Imaris (plano de bits, Zurich, Suiza), estimando el porcentaje de invasión como:.. Número de células invasoras /número de células totales x 100
Cul3 silenciamiento
Cul3 derribado se realizó en T24T mediante transfección transitoria con Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) a través de control (no-targeting) pequeños ARN de interferencia de doble cadena (siRNA) y la piscina inteligente siRNA dirigidos contra Cul3 (tanto de Dharmacon, Waltham, MA). Cul3 silenciar transfectantes expuestos a 50 nM y 100 Nm de siRNA dirigidos se recogieron a las 24 h y 48 h para los ensayos de proliferación, de migración o invasión, como se describe anteriormente. silenciamiento Cul3 fue confirmada por inmunotransferencia.
2. SILAC proteína de perfiles
cultivo celular y metabólica de etiquetado.
se mantuvieron las células T24 y T24T en lisina y arginina empobrecido en DMEM (Millipore, Billerica, MA) suplementado con 10% FBS dializado (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina (Invitrogen) y ya sea de origen natural abundancias isotópicas ( "luz") (T24) o etiquetada con isótopos ( "pesado")
13C estable
6 lisina y
13 C
6 ácidos aminoácidos arginina (Cambridge isótopos Labs, Andover, MA) (T24T). Los medios de cultivo fueron renovados cada 2 días mediante la eliminación de la mitad del volumen presente en cada placa y su sustitución con medio fresco. Las células se cultivaron durante al menos 6 duplicaciones para permitir la plena incorporación de aminoácidos marcados. SILAC dos réplicas a gran escala (2 × 10
7 células por condición) se llevaron a cabo. incorporación total de
T24T células después de seis divisiones celulares en medio de isótopos pesados (directa e inversa) etiquetado 13C-Arg y
13C-Lys en T24 y se verificó por MS de una proteína de digestión.
de fraccionamiento de proteínas.
Para reducir la complejidad de la muestra, se realizó un fraccionamiento nuclear /citosol. Las células se lisaron en un tampón de lisis (20 mM HEPES, pH 7,0, KCl 10 mM, MgCl 2 mM, 0,5% de Nonidet P40, 1 mM Na
3Vo
4, mM PMSF 1, 0,15 U ml
-1 aprotinina) y se homogeneizó por 30 golpes en un homogeneizador Dounce. El homogeneizado se centrifugó a 1500 g durante 5 min para sedimentar los núcleos. El sobrenadante se resedimentado a 15.000 g durante 5 min, y el sobrenadante resultante formó la fracción no nuclear o citosol. El sedimento nuclear se lavó tres veces y se resuspendió en el mismo tampón que contiene 0,5 M NaCl. El material extraído se sedimentó a 15.000 g durante 10 min y el sobrenadante resultante se denominó la fracción nuclear.
SDS-PAGE y en gel de digestión.
Las proteínas en citosólica y fracciones nucleares fueron separados por SDS-PAGE en 10% de geles de SDS-poliacrilamida. Un total de 80 g de proteína se cargó por carril. Después de la electroforesis, las proteínas se visualizaron por tinción con azul de Coomassie y el carril de gel se cortó horizontalmente en 20 secciones. bandas de gel extirpados se cortaron en trozos pequeños y se destiñeron en 50:50 mM de bicarbonato de amonio 25 /acetonitrilo, deshidratados con acetonitrilo y se secaron. los trozos de gel se rehidrataron con 30 l de 12,5 ng /ml en solución de tripsina de bicarbonato de amonio 25 mM y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Los péptidos se extrajeron usando acetonitrilo y ácido fórmico al 5%, se secó por centrifugación al vacío y se resuspendió en 15 l de 2% de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1%. Todas las muestras se sometieron a ultrasonidos durante 10 min antes del análisis de MS.
nanoflujo LC-MS /MS
.
La mezcla de péptidos a partir de gel digestiones trípticos (utilizando 30 l de tripsina a 12,5 ng /ml ) se analizó utilizando nanoflujo LC-MS /MS. Los péptidos se cargaron en una columna trampa (Reprosil C 18, tamaño
3 m de partícula, 0,3 x 10 mm, 120 un tamaño de poro, SGE) y después se eluyó a la columna analítica (Acclaim PepMap 100, C
18, tamaño de 3 micras de partículas, de 75 micras x 15 cm, tamaño de poro 100 Å, Dionex, LC Packings) con un gradiente lineal de 5-80% de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1%. La muestra fue entregado más de 120 minutos por un ultra-1D nano-LC plus (Eksigent) a un caudal de 200 nl /min a una nano-orificio emisor de acero inoxidable (OD 150 micras, ID 30 micras, Proxeon, Odense, Dinamarca) . Los péptidos fueron escaneados y fragmentada con un ion lineal espectrómetro de masas de trampa LTQ XL (Thermo, San Jose, CA), operado en ZoomScan dependiente de los datos y MS /MS modo de conmutación utilizando los tres precursores más intensos detectados en una encuesta de exploración 400 a 1600 u (tres μscans). ventana de masa ZoomScan se establece en 12 Da que permita el control de toda la envolvente isotópica
12C /
13C de la mayoría de los péptidos cargados doble y triplemente. iones de una sola carga se excluyeron para el análisis MS /MS. energía de colisión normalizada se establece en un 35% y se aplicó la exclusión dinámico durante 3 períodos min para evitar la fragmentación de los iones repetitivas.
Identificación de proteínas y cuantificación.
Los archivos generados .raw se convirtieron a FGM archivos para la base de datos de búsqueda MASCOT. Una base de datos que contiene las secuencias que contienen NCBInr Homo sapiens 34180 entradas de proteínas (a partir del 04-03-2008) Se realizaron búsquedas en el uso de la MASCOTA de software (versión 2.3 Matriz de Ciencia) para la identificación de proteínas. Los criterios de búsqueda incluyen la especificidad de la tripsina con una hendidura perdido permitido, y la oxidación de la metionina,
13C-Arg y
13C-Lys como variable modificaciones. se requiere una precisión mínima precursor fragmento de iones de masa de 1,2 y 0,3 Da, respectivamente, y un requisito de al menos dos negrita rojos (péptidos únicos) por la proteína para la cuantificación de proteínas. Los valores de corte para las puntuaciones de mascota de péptidos y proteínas se fijaron a 39 (
p Hotel & lt; 0,05) y 46 (
p Hotel & lt; 0,01), respectivamente, para considerarlos como identificaciones precisas . La tasa de falsos positivos se calculó la búsqueda de la misma contra los espectros NCBInr Homo Sapiens señuelo base de datos aleatorio. relaciones de cuantificación relativa de las proteínas identificadas se calcularon utilizando QUIXOT (versión 1.3.26). relaciones /T24 SILAC T24T fueron definidos por las intensidades de los péptidos pesados (C
13) dividido por las intensidades de los péptidos ligeros (C
12). relaciones de proteína obtenida por QUIXOT fueron verificadas manualmente para todos los péptidos. Una proporción de
13C
6-Arg se convirtió a
13C
5-Pro que conduce a una reducción en la intensidad del pico de péptido marcado con isótopo; este se corrigió para todos los péptidos que contienen uno o más residuos de prolina mediante la adición de la intensidad encontrado para el péptido que contiene
13C
6-Arg
13C
5-Pro o
13C
6 Lys
13 C
5-Pro para la intensidad del pico que contiene sólo
13 C
6-Arg o
13 C
6-Lys. Una lista combinada de las proteínas identificadas en todos los experimentos se condensó en un 80% de homología con el programa informático ProteinCenter (Proxeon Bioinformática AS, Odense, Dinamarca) para eliminar los ID redundantes tales como secuencias de ortólogos humanos, las entradas de la base de datos redundantes, e isoformas indistinguibles basado en péptido observada cobertura. Localización subcelular y los procesos funcionales de las proteínas identificadas por SILAC se asigna en función del conocimiento biológico disponible en las anotaciones de ontología de genes (GO). El software Ingenuity Pathway (IPA) también se utilizó para dar una idea de las redes biológicas [33], [34].
3. Perfiles de expresión génica con el oligonucleótido matrices
La extracción de RNA.
El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA) seguido de purificación RNeasy. Se evaluó la calidad del RNA basado en 260:280 proporciones de absorbancia, y la integridad se comprobó mediante electroforesis en gel usando el 2100 Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA) [32], [34].
arrays de genes.
ADN complementario se sintetizó por
in vitro
transcripción a partir de 1,5 g de ARN total se purificó usando una T7-oligo (dT) Promotor Primer Ensayo (Affymetrix, Santa Clara, CA), marcado con biotina nucleótidos (Enzo Biochem, Farmingdale, NY), y se hibridaron para probar GeneChips (Affymetrix), para evaluar la calidad de la muestra antes de la hibridación en los GeneChips U133A humanos que contienen 22283 sondas que representan genes conocidos y las etiquetas de secuencia de expresión (Affymetrix) [34].
análisis de los datos.
archivos de imágenes escaneadas fueron inspeccionados visualmente en busca de artefactos y analizados mediante el Affymetrix Microarray suite 5.0 (MAS 5.0). La expresión diferencial se evaluó utilizando la señal como la medida principal respuesta extraída de cada gen en todas las muestras, según lo determinado por los ajustes por defecto del MAS 5,0. Las correlaciones entre las proporciones de genes y proteínas se analizaron mediante la prueba de la tau de Kendall. Para comparar SILAC y oligonucleótidos arrays resultados, la probabilidad acumulada de los resultados esperados y los observados estuvieron representados en el rango de coeficientes de la expresión diferencial.
4. Validación por inmunotransferencia
proteína total fue extraído de células de cáncer de vejiga usando tampón de lisis RIPA y se cuantificó con el ensayo de Bradford utilizando BSA como estándar (ensayo de proteínas, Bio-Rad, Hercules, CA). extractos de proteína total (50 g) se mezclaron con tampón de muestra 5x SDS (62,5 TrisHCl mM [pH 6,8], 2% SDS, 10% de glicerol, 5% β-mercaptoetanol, 0,005% de azul de bromofenol) y se resolvieron por SDS-PAGE en 10 geles% de acrilamida. Las proteínas se electrotransfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MC) y la activación con metanol. Las membranas se bloquearon con 5% de leche seca no grasa en PBS y Tween-20 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios contra: Annexin2 (39 kDa, ratón, 1:2000,#610068 , BD transducción Laboratories, San José, CA Estados Unidos), Bcas2 (26 kDa, ratón, 1:6000,#H00010286-M01, Abnova, Heidelberg, Alemania), L-Caldesmon (80 kDa, ratón, 1:100,#C56520, BD Transduction Laboratories), calreticulin (48 kDa, conejo, 1:5000,#C4606, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), caveolina-1 (20-22 kDa, ratón, 1:100,#C37120, BD Transduction Laboratories) , cdc2 (34 kDa, conejo, 1:1000,#sc-954, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE.UU.), CD44 (80 kDa, ratón, 1:50,#NCL-Cd44v3, Novocastra, Wetzlar, Alemania) , Copine3 (38 kDa, conejo, 1:100, amablemente suministrado por el Dr. Piris, situado en el CNIO, Madrid, España), Cul3 (89 kDa, conejo, 1:100,#RB1575PCS, NeoMarkers, Fremont, CA, EE.UU.) , Cytokeratin18 (48 kDa, ratón, 1:100,#IF14, Oncogene-MERCK, Darmstad, Alemania), ddx21 (87 kDa, conejo, 1:3500,#10528-1-AP, Proteintech, US), DNMT1 (183 kDa, ratón, 1:100,#IMG-261, IMGENEX, San Diego, CA, EE.UU.), Dynactin p50 (44 kDa, ratón, 1:100,#D74620, BD Transduction Laboratories), Dinamina (ratón, 97 kDa, 1:5000,#D25520, BD transducción Laboratories,), EGFR (175 kDa, ratón, 1:100,#GRO1, Oncogene-MERCK), Ezrin (80 kDa, ratón, 1:7000,#E8897, Sigma), Filamina A (250 kDa, ratón, 1:50,#NCL-FIL, Novocastra, RU), gelsolina (47 kDa, ratón, 1:100,#G4896, Sigma), HSP70 (70 kDa, ratón, 1:200,#SC-66048, Santa Cruz), importin 9 (116 kDa, cabra, 1:100, sc-103567, Santa Cruz), MCM6 (92 kDa, conejo, 1:200, amablemente suministrado por el Dr. Méndez, ubicada en el CNIO, Madrid, España), MAPK-4 (65 kDa, conejo, 1:1000, sc-68169, Santa Cruz), Moesin (68-77 kDa, ratón, 1:50,#EM-727-P0, NeoMarkers), MSH6 (152 kDa, ratón, 1:200,#610918, BD Transduction Laboratories), nucleofosmina /B23 (32 kDa, ratón, 1:5000,#18 a 7288, Zymed, San Francisco, CA, EE.UU.), NUP133 (133 kDa, ratón , 1:500,#SC-101290, Santa Cruz), Rab14 (23 kDa, conejo, 1:100,#PRO-873, Avivasybio, San Diego, CA), RCC1 (44 kDa, cabra, 1:300,#SC-1161, Santa Cruz), VDAC (30 kDa, conejo, 1:100,#4866, Señalización celular, Beverly, MA). Las transferencias se lavaron en PBS y 0,1% Tween-20, y se incubaron con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa durante 1 h a temperatura ambiente: anti-ratón (1:1000), anti-conejo (1:2000) y anti-cabra ( 1:2000, todo Dako, Glostrup, Dinamarca). La unión del anticuerpo se visualizó usando un sistema de detección quimioluminiscente intensificado inmunotransferencia (ECL, GE Healthcare). a-tubulina (50 kDa, ratón, 1:4000,#T5168, Sigma) se utilizó como carga y control de normalización. Las inmunotransferencias fueron escaneados y analizados utilizando el software ImageJ1.43u (Wayne Rasband, Instituto Nacional de Salud).
5. Evaluación clínica de la expresión de biomarcadores relacionados con metástasis
Muestras de tejidos y microarrays.
Siete microarrays de tejidos de cáncer de vejiga a medida se construyeron en el Grupo de Marcadores tumorales incluyendo triplicado o núcleos quadriplicate (1,0 mm) de los tumores vesicales primarios (n = 284) después de diseños aleatorios. fueron recogidas y manipuladas tumores embebidos en parafina para la gama de construcción de tejido de forma anónima siguiendo las directrices de protección éticos y legales de los sujetos humanos después de la aprobación y consentimiento por escrito Institucional Review Board (IRB) aprobó los protocolos correspondientes a la SAF2009-13035 proyecto de investigación en instituciones colaboradoras: Fundació Puigvert y Hospital central de Asturias. La información demográfica indica la presencia de 251 hombres y 33 mujeres, con una edad media de 66,0 años (rango: 25-81). distribución estadio tumoral fue: pT1 (n = 87), pT2 (n = 121), pT3 (n = 48) y pT4 (n = 28), y la distribución de grado del tumor fue: bajo grado (n = 58) y alto grado (n = 226), definida según los criterios de consenso [35]. Dos de estos microarrays de tejidos que incluyen un conjunto de 71 de alto grado tumores de vejiga CTP (pT2) + músculo-invasivo conocido con el estado de los ganglios linfáticos metastásicos (N0 = 37, N + = 34). Clínico-patológicas y anotados de seguimiento de información permitidos asociaciones de Cul3 con histopatología y el resultado.
La inmunohistoquímica.
La expresión proteica de Cul3 se evaluó mediante inmunohistoquímica en microarrays de tejidos que utilizan procedimientos de inmunoperoxidasa avidina-biotina. la recuperación de antígeno (ácido cítrico 0,01% durante 15 minutos bajo microondas) fue empleado antes de la incubación durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo de conejo Cul3 utilizado en inmunotransferencia (1:300 dilución). Unión de los anticuerpos se detectó con un anti-anticuerpo de conejo biotinilado de cabra secundario (1:1000, Vector Laboratories). La ausencia de anticuerpo primario se utilizó como control negativo. Testis se utilizó como control positivo. Diaminobencidina se utilizó como cromógeno final y hematoxilina como contratinción nuclear [32] -.. [34]
Análisis estadístico
Medios de hallazgos de dos observadores independientes de todos los núcleos de cada muestra de tumor vestida se utilizaron para los análisis estadísticos. Asociaciones de expresión Cul3 por inmunohistoquímica con el estadio y el grado tumoral histopatológico fueron evaluados utilizando las no paramétricas de Wilcoxon-Mann-Whitney y Kruskall-Wallis pruebas [36]. expresión Cul3 se evaluó como una variable continua basado en el número de células que expresan la proteína en el núcleo. La intensidad de la tinción se clasificó como negativo (-) a bajo (+), intermedia (++) y alto (+++). Además de la localización intracelular, también se evaluó si la proteína estaba presente o no en la matriz extracelular que rodea las células neoplásicas. nivel de corte Cul3 para la evaluación pronóstica fue seleccionado sobre la base de los valores de mediana de expresión entre los grupos bajo análisis. Asociación de Cul3 con la supervivencia específica de la enfermedad se evaluó mediante la prueba de log-rank en los casos en los que se dispone de seguimiento. el tiempo de supervivencia específica de la enfermedad se definió como los meses transcurridos entre la resección transuretral o cistectomía y la muerte como resultado de una enfermedad (o la última fecha de seguimiento). se censuraron los pacientes vivos a la última visita de seguimiento o perdidos durante el seguimiento. Las curvas de supervivencia se trazaron utilizando la metodología de Kaplan-Meier [36]. Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS (versión 17.0).
Resultados
Análisis funcional
in vitro
Varios aspectos agresividad de las células T24-T24T se analizaron inicialmente. T24T tenía mayores tasas de proliferación significativas que T24 en los cuatro puntos de tiempo estudiados (p & lt; 0,05, Figura 1A). Invasión ensayos indicaron que T24 eran en promedio 50% menos invasiva que las células T24T a las 48 h (Figura 1B). Herida ensayos de curación reveló tasa de migración significativamente más rápido para T24T (Figura 1C). I
n vitro
ensayos sugerido que las células T24T tenían fenotipos más agresivos.
Los cambios en la abundancia de proteínas entre las células T24 y T24T utilizando SILAC
Un total de 1830 proteínas se identificaron en los dos experimentos SILAC, de los cuales 831 fueron identificados simultáneamente en ambas réplicas y se pasan los criterios establecidos para la cuantificación de proteínas. La tasa de falso descubrimiento global fue del 2,1% que se calcula por el número de golpes contra la secuencia inversa /accesos totales (p & lt; 0,01). La desviación media relativa estándar (DE) de los coeficientes obtenidos de repeticiones fue de 0,24, lo que indica una buena concordancia entre los experimentos.
En cuanto a la distribución de proporciones SILAC, la mayoría de las proteínas identificadas estaban dentro del intervalo de relaciones SILAC entre 1,5 y 0,67, como se esperaba en el análisis de las líneas celulares estrechamente relacionados en un 01:01 mezcla de proteínas (Figura 2A). El uso de 1,5 como la relación umbral, 289 proteínas se expresaron diferencialmente entre las dos líneas celulares, 88 de las cuales eran más abundantes en T24T. Entre las 289 proteínas expresadas diferencialmente (Tabla S1), Tabla 1 incluye aquellas proteínas previamente relacionados con la metástasis del cáncer de vejiga, y los validados por inmunotransferencia. La lista completa de las proteínas identificadas en las dos repeticiones (n = 831) con SILAC se encuentra en la Tabla S2.
Las proteínas fueron ordenados y se representa por la relación de SILAC. Como era de esperar para una mezcla 01:01, la mayoría de las proteínas mostraron una relación SILAC dentro de los puntos de corte de 1,5 y 0,67. Clasificación de las proteínas identificadas en base a sus anotaciones funcionales utilizando la ontología de genes: B) Función Molecular, C) Los procesos biológicos y D) Los componentes celulares. Estos análisis se realizaron con los 289 proteínas que se encuentran para ser expresados diferencialmente. Cuando se dispone de más de una asignación para una determinada proteína, todas las anotaciones funcionales se consideraron en los análisis. Estas clasificaciones eran redundantes (más del 100%) en forma de proteínas podrían anotarse en más de una asignación.
Clasificación funcional de las proteínas identificadas
La anotación funcional del 289 proteínas expresadas diferencialmente en células T24 y T24T se le asignó inicialmente utilizando el software de proteínas del Centro. Tres tipos principales de anotaciones fueron obtenidos de GO página web del consorcio: los componentes celulares, funciones moleculares y procesos biológicos (Figura 2 B, C, D). Un enfoque GOslim definido específicamente para ProteinCenter reduce las múltiples GO anotaciones a un conjunto manejable de aproximadamente 20 términos de alto nivel que se utilizaron para filtrar la información en las estimaciones porcentuales. funciones moleculares importantes incluyen la proteína de unión (78%) o la actividad catalítica (67%). Los procesos metabólicos (84%) y la organización celular y la biogénesis (54%) eran frecuentes los procesos biológicos. distribución de las proteínas anotación apoyó los
in vitro
ensayos funcionales descritos anteriormente que une la reorganización celular con migración y la invasión fenotipos (Figura 1). Un alto número de proteínas localizadas en el citoplasma (87%) se encontró en comparación con el núcleo (48%). Esta observación nos llevó a centrarse en las proteínas que podrían jugar un papel relevante en la reorganización del citoesqueleto y el fenotipo agresivo de T24T.
comparación de las relaciones de genes y expresión de proteínas
SILAC coeficientes de la expresión de proteínas se compararon con la expresión de ARNm proporcionada por microarrays de oligonucleótidos para los candidatos identificados por ambos métodos (n = 438) (Tabla 1, Tabla S3). se obtuvo (Figura S1 A); Un coeficiente de correlación positiva (Kendalls tau) de 0,206 (0,0005 p & lt). Es importante destacar que la relación de expresión de la proteína SILAC media fue de 0,98 para estos candidatos (rango: 0,16-9,44), que era similar a la mediana de 1,02 observada para arrays de oligonucleótidos (rango: 0,01 a 100,80). Excluyendo dos valores extremos detectados por ambas técnicas aumentó el coeficiente de correlación de 0,210 (p & lt; 0,0005, N = 438: Figura S1B). Para interpretar las diferencias entre la esperada y las correlaciones observadas entre el ARN y la expresión de proteínas, la probabilidad acumulada de la proporción observada para la expresión diferencial fue representado en contra de la relación esperada para ambas técnicas (Figura S1c, D). Las cifras destacan las gamas más amplias de la expresión diferencial observado en arrays de oligonucleótidos en comparación con los mismos candidatos en los análisis de SILAC.
Validación de SILAC identificado candidatos utilizando inmunotransferencia
Para validar SILAC coeficientes de la expresión de las proteínas identificadas en ambas réplicas, inmunotransferencia se llevó a cabo (Figura 3). se observó aumento de la expresión en T24T para gelsolina, Cul3, importins, nucleoporins y EGFR, y la disminución de expresión se encontró para ezrin, moesina, filamina, caveolina o CD44, entre otros. Las inmunotransferencias se cuantificaron en correlación con los coeficientes de expresión obtenidos por SILAC y en arrays de genes. Sobre la base de la buena concordancia de estas observaciones para Cul3, una proteína que se sabe están involucrados en la ubiquitinación y la posterior degradación de proteínas diana, que fue seleccionado para análisis adicionales para: a) evaluar su relevancia clínica como candidato biomarcador para evaluar el comportamiento clínico agresivo y b) para evaluar el impacto Cul3 en el fenotipo agresivo de T24T y en la modulación de la expresión de otras proteínas expresadas diferencialmente identificadas por SILAC. Figura S2 mostró la validación adicional mediante inmunotransferencias de candidatos expresados diferencialmente en las células T24T en arrays de oligonucleótidos que no fueron cuantificados por SILAC, y
viceversa, para el que los anticuerpos estaban disponibles. No se observaron diferencias importantes en los pesos moleculares experimentales en comparación con los tamaños predichos.
(A) Validación de los resultados SILAC de proteínas seleccionadas en inmunotransferencias de extractos de proteínas de las células de cáncer de vejiga analizadas. Los resultados validaron los niveles de expresión de las proteínas identificadas por el enfoque proteómico, incluyendo diferencialmente y los candidatos no expresados diferencialmente. Se aceptaron los anticuerpos que muestran una sola banda predominante en los pesos moleculares esperados: y α-tubulina, se utilizó como control de carga. GSN, gelsolina; Cul3, Cullin 3; IPO9. Importin 9; EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico; NUP133, nucleoporin 133; HSP70, proteína de choque térmico 70 kDa; MCM6, minicromosomas Mantenimiento de componentes Complejo 6; RCC1, Reguladora de condensación cromosoma 1; BCAS2, carcinoma de mama Secuencia 2 amplificada; DNM, Dinamina; NGP, nucleofosmina; DCTN, Dynactin; CALR, Calreticulin; MAPK, activada por mitógenos proteína quinasa; Ddx21, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) polipéptido casilla 21; Ciclo de división celular 2;: CDC2 DNMT1, el ADN (citosina-5) metiltransferasa 1; MSH6, MutS Homólogo 6; RAB14, GTPasa Rab14; VDAC, anión canal dependiente de voltaje; CK18, citoqueratina 18; CALD, Caldesmon; CD44, CD44 isoforma antígeno 1 precursor 2; EZR, Ezrin; MSN, Moesin; ANXA2, anexina A2; CPNE3, Copine 3; FLNA, filamina A;