Extracto
El cáncer colorrectal es uno de los cánceres más comunes en los países desarrollados y es el resultado de factores tanto genéticos y ambientales. Muchas de las lesiones genéticas observadas en el cáncer colorrectal alterar la expresión de genes homeobox, que codifican factores de transcripción de homeodominio. El
MEIS1
es conocido gen homeobox estar involucrado en varias neoplasias hematológicas y tumores sólidos y la evidencia reciente sugiere que la expresión de la
MEIS1 Versión taquigráfica se altera en el cáncer colorrectal. A pesar de esta conexión de potencial, se sabe poco sobre el papel de los genes en los intestinos. Nos probaron muestras de tejidos gastrointestinales murinos con un anticuerpo Meis1 N-terminal, revelando expresión de dos isoformas descritos anteriormente, así como dos productos MEIS1 novedosas. Un producto 32 kD Meis1 se expresó en los núcleos de las células no epiteliales en el estómago y el colon, mientras que un producto 27 kD se expresa en el citoplasma de las células epiteliales en el colon proximal. Nuestros datos sugieren que los 27 kD y 32 kD proteínas MEIS1 son ambas formas de la proteína Meis1d, una isoforma de homeodominio-less cuya transcripción fue identificado previamente en las pantallas de ADNc. Tanto el
MEIS1D Versión taquigráfica y proteínas se expresaron en la mucosa del colon humano. La expresión de la proteína MEIS1D se downregulated en 83% (10/12) de las muestras de cáncer colorrectal primario en comparación con mucosa normal correspondiente, lo que indica que MEIS1D es un biomarcador de la tumorigénesis colorrectal. La disminución de expresión de MEIS1D en los tumores de colon también sugiere que esta isoforma homeodominio-menos conservadas puede actuar como un supresor de tumores en el cáncer colorrectal humano
Visto:. Crist RC, Roth JJ, Waldman SA, Buchberg AM (2011) Un conservadas específicas de tejido Homeodominio-Menos isoforma de MEIS1 es downregulated en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (8): e23665. doi: 10.1371 /journal.pone.0023665
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 20 de mayo de 2011; Aceptado: July 22, 2011; Publicado: 17 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Crist et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud [T32-CA09678 al RCC, T32-CA09683 a JJR] y el Instituto Nacional del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación de este manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal representa aproximadamente el 10% de ambos diagnósticos de cáncer y la mortalidad en los Estados Unidos (www.cancer.org). La tasa de mortalidad ha disminuido en las dos décadas anteriores, lo que refleja principalmente mayores niveles de cumplimiento con colonoscopias recomendadas, así como la mejora de la eficacia de las opciones terapéuticas [1]; Sin embargo, el cáncer colorrectal todavía tiene la segunda mayor incidencia de mortalidad en los Estados Unidos, sólo por detrás del cáncer de pulmón. Como muchos tipos de cáncer, el cáncer colorrectal tiene componentes tanto genéticos y ambientales [2], [3], [4]. Tanto las formas esporádicas y hereditarias de la enfermedad están asociadas con una acumulación de lesiones genéticas múltiples [5], [6], que puede resultar en niveles disminuidos de apoptosis [7], la pérdida de la regulación del ciclo celular [8], y la activación constitutiva de la vía
WNT
ha de señalización [9]. Como reguladores de la activación de la transcripción aguas abajo, factores de transcripción son dysregulated con frecuencia en el cáncer colorrectal [10], [11].
genes homeobox codifican proteínas con dominios de unión al ADN conocidos como homeodomains. Estas proteínas homeodominio actúan como factores de transcripción, regiones promotoras de unión y la activación de la transcripción [12].
HOX Buscar miembros de la familia de genes son los genes homeobox prototípicos.
HOX
genes están involucrados en la segmentación embrionaria y los patrones, así como el desarrollo de numerosos sistemas de órganos, incluyendo el tracto gastrointestinal [12]. Los genes de desarrollo a menudo se expresan ectópica durante la carcinogénesis [13] y varios
HOX
genes se han relacionado con el cáncer colorrectal.
HOXB6
,
Hoxb8
,
HOXC8
,
HOXC9
, y
¿Cuáles son HOXD13 sobreexpresa en ambas líneas celulares de cáncer colorrectal y primaria tumores de colon [14], [15], [16].
HOXB13
, sin embargo, se expresa normalmente en la mucosa del colon, pero es downregulated en el tejido tumoral [10]. La desregulación de la no
HOX genes homeobox
también se ha observado en los carcinomas colorrectales.
CDX1
y
CDX2 ¿Cuáles son downregulated durante la carcinogénesis colorrectal [17], [18], mientras aberrante
PROX1
expresión en los resultados de colon en un aumento de la displasia [19].
Homeodominio factores de transcripción se unen a menudo regiones promotoras, ya sea como complejos heterodiméricos o homodimeric [20]. Esta dimerización proporciona una mayor especificidad de la activación transcripcional [21]. La proteína MEIS1 homeodominio es un socio de unión conocida de varias otras proteínas homeodominio, incluyendo HOXA7, Hoxa9, y PBX1 [22].
MEIS1
juega un papel en el desarrollo normal del linaje hematopoyético y se sobreexpresa en un subconjunto de las leucemias mieloides agudas [23]. El aumento de
MEIS1
expresión también se ha observado en los neuroblastomas y el nivel de expresión de la
MEIS1 Versión taquigráfica es un indicador pronóstico en el cáncer de mama [24]. Regulación a la baja del total de
MEIS1 Versión taquigráfica se observó en los adenomas colorrectales, lo que sugiere un papel para
MEIS1
en la tumorigénesis intestinal [25].
Debido a la relación entre los genes homeobox y colorrectal cáncer, se analizó el estado de Meis1 en el colon. En este estudio, se describen dos productos MEIS1 novedosas expresadas en el tracto gastrointestinal murino. Estas dos proteínas se expresan en diferentes tipos de células y compartimentos subcelulares. Ambas proteínas se traducen a partir del
Meis1d Versión taquigráfica, una variante de empalme homeodominio-menos de
Meis1
.
MEIS1D
, el homólogo humano de
Meis1d
, fue identificado en el tejido de colon humano normal, tanto a nivel de ARNm y proteínas. Por otra parte, observamos la regulación a la baja de
MEIS1D
expresión en los cánceres colorrectales humanos. Estos datos sugieren que
MEIS1D
es una novela supresor de la tumorigénesis colorrectal y una posible diana terapéutica para el cáncer de colon.
Materiales y Métodos
colonia de ratones
/6J (B6) ratones C57BL se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Los ratones se mantuvieron en las instalaciones de animales TJU AALAC acreditados. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo, 343C, fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Thomas Jefferson, número del permiso A3085-01.
se obtuvieron de la infección retroviral
células HCT116 de la American Type Culture Collection (Cat. No. CCL-247), donde la identidad de la línea celular se confirmó mediante análisis de STR. MSCV-
Meis1d Opiniones y MSCV-
Neo
plásmidos se transfectaron en células Phoenix utilizando el kit de fosfato de calcio Profection (Promega, Madison, WI). Las células se incubaron a 37 ° C durante 24 horas para producir los medios de comunicación viral. se añadió medio viral a las células HCT116 en placas de seis pocillos y se centrifugó a 1800 rpm durante 45 minutos. Las células se incubaron a continuación a 32 ° C durante 3 horas, se retiró el medio viral, y se añadió nuevo medio viral. Las células se centrifugaron de nuevo a 1800 rpm durante 45 minutos y se incubaron a 32 ° C durante 3 horas más. medios Viral fue reemplazado con DMEM y las células se trasladó a 37 ° C durante 48-72 horas para permitir la traducción de la secuencia insertada.
Western El análisis de transferencia
ratones B6 a los 120 días de edad fueron sacrificados por CO
2 asfixia seguido por dislocación cervical. Las muestras de tejido y de células se lavaron en 1 x PBS y se homogeneizaron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 150 mM; EDTA 2 mM; 10% de glicerol; 1% de Triton-X-100) con inhibidores de proteasa (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN). La concentración de proteína se cuantificó usando proteína Bio-Rad de ensayo (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). 20 g de cada muestra se separó por SDS-PAGE (10% de acrilamida) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con leche en polvo desnatada al 5% en 1 x TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 150 mM; 0,05% de Tween 20). Los anticuerpos primarios se utilizaron durante la noche a 4 ° C: Meis1-N; Meis1d-C; GAPDH (Abcam, Cambridge, MA); actina, histona H1, y citoqueratina 18 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Vector Laboratories, Berlingame, CA) se utilizó a una dilución 1:2500 durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron utilizando sustrato quimioluminiscente SuperSignal (Thermo Scientific, Rockford, IL).
Fraccionamiento subcelular
Las muestras de tejidos y células se lavaron en PBS 1X y se homogeneizaron en tampón de lisis (Tris 10 mM HCl, pH 7,4; MgCl 5 mM
2; DTT 1 mM; PMSF 1 mM) con inhibidores de proteasa (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Los lisados se pasan entonces a través de una aguja 25½g y se centrifugaron a 600 x g a 4 ° C durante 10 min. El sobrenadante se marcó la fracción citoplásmica. El sedimento se resuspendió en tampón de lisis y se marcó la fracción nuclear.
aislamiento de células epiteliales
proximal y distal muestras de colon se cortaron en tiras de 1 mm de ancho. Las muestras se incubaron en 1 × PBS con 0,15% de DTT durante 30 min a temperatura ambiente con agitación constante por una barra de agitación para eliminar el moco. tiras de la mucosa y barra de agitación se lavaron en 1 x PBS y después se incubaron en 1 × PBS con 1 mM EDTA, pH 7,2 de agitar durante 60 min a temperatura ambiente para eliminar las células epiteliales. Se recogió la solución de EDTA y se centrifugó a 470 xg durante 5 min. tejido restante se incubó en la solución de EDTA para eliminar las células epiteliales residuales y luego homogeneizado en tampón de lisis como se describió anteriormente. El sedimento epitelial se resuspendió en RPMI 1640 y se incubó con colagenasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 50 unidades /ml durante 30 min a 37 ° C, agitación vorticial suavemente cada cinco minutos. Las muestras se centrifugaron a 200 xg durante 5 min. El sedimento se resuspendió en 1 × PBS, se centrifugó de nuevo, y se resuspendió en RPMI. La suspensión de células RPMI se superpone sobre una mezcla de Percoll /PBS 50%. El gradiente de Percoll se centrifugó a 470 xg durante 20 min. Se tomaron las células epiteliales de la parte superior del gradiente, se diluyó con RPMI, y se centrifugaron a 830 xg durante 5 min. El sedimento celular se resuspendió en RPMI y se centrifugó de nuevo a 470 xg durante 5 min. El sedimento celular final se homogeneiza en tampón de lisis de transferencia de Western usando una aguja 25½g.
RT-PCR
Las muestras de tejido se homogeneizaron en 1 ml de solución de reactivo TRI (Ambion, Inc, Austin, TX) y se centrifugó a 12.000 × g durante 15 min a 4 ° C. se añadieron 200 l de cloroformo. Las muestras se mezclaron durante 15 segundos, se incubó a temperatura ambiente durante 3 min, y se centrifugaron a 12.000 xg durante 20 min a 4 ° C. La capa superior se mezcló con 500 l de 2-propanol, se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min y se centrifugó a 12.000 × g durante 20 min a 4 ° C. El sedimento de RNA se lavó con etanol al 75% y se centrifugó a 7500 xg durante 5 min. El ARN se secó entonces al aire y se resuspendió en agua tratada con DEPC. Transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) se utilizó para generar ADNc. Todas las transcripciones MEIS1 fueron amplificados en muestras murinos, mientras cebadores MEIS1D-específicos se utilizaron en muestras humanas.
La inmunohistoquímica
Los tejidos se fijaron en solución de formalina tamponada Formalde-Fresh 10% (Fisher Scientific) durante la noche a 4 ° C y se almacena en 70% EtOH. tejidos fijados fueron incluidos en parafina y tejidos fueron cortadas y montadas en portaobjetos de vidrio por el Fondo para el KCC Investigación traslacional Core. Los tejidos fueron deparaffinized utilizando tampón citrato, pH 6,0 (Vector Laboratories, Berlingame, CA) y se tiñeron con anticuerpos Meis1-N durante la noche a 4 ° C. Se utilizó anti-anticuerpo secundario de conejo (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a una dilución 1:200 durante 1 hora a 37 ° C seguido de Kit ABC Enlazador (Vector Laboratories, Berlingame, CA) durante 30 min a 37 ° C. Las muestras se desarrollaron usando el sustrato de peroxidasa DAB Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). La tinción se visualizó en un microscopio Nikon Eclipse E600, ya sea en 4 × o 20 × magnificación.
Ética
Los pacientes fueron consintieron mediante un formulario de consentimiento quirúrgico escrito que establece los residuos de la cirugía se utilizaría para fines de investigacion. Todas las muestras se obtuvieron en el Hospital de la Universidad Thomas Jefferson. La Junta de Revisión Institucional de la Universidad Thomas Jefferson (IRB) exento este estudio de opinión, ya que consideran que el estudio no era constitutiva de sujetos humanos de investigación y renunciar a la necesidad de consentimiento, debido al hecho de que las muestras recibidas se codificaron para eliminar la identificación.
Resultados
Dos isoformas nuevas MEIS1 están presentes en el tracto gastrointestinal murino
a pesar de regulación a la baja de
MEIS1
en el cáncer colorrectal humano se ha observado recientemente, el papel del gen en la homeostasis gastrointestinal (GI) y la tumorigénesis es poco conocido. Para determinar la expresión de isoformas MEIS1 murinos en el tracto GI, un Western blot se llevó a cabo en ratones C57BL /6J (B6) lisados GI usando un anticuerpo policlonal dirigido al extremo N-terminal de Meis1 (Meis1-N). Se observaron los productos de 43 kD y 51 kD en la mayoría de las muestras (Figura 1a). Estos pesos moleculares se corresponden con los tamaños conocidos de dos isoformas descritas anteriormente, Meis1a y Meis1b, respectivamente. Se observaron dos bandas adicionales en algunas de las muestras: una proteína de ~32 kD presente en el estómago y el colon y una proteína de ~27 kD se expresa en el colon proximal y el ciego (Figura 1a). El producto ~27 kD es el mismo que el peso predicho para Meis1d, otra isoforma Meis1. La transcripción de
Meis1d
fue previamente identificado durante pantallas de ADNc murino [26], [27]. La isoforma carece de todo del exón 8, lo que resulta en un codón de parada prematuro en el exón 9 y un producto teórico truncado de proteína (Figura 1c, d). La existencia de un
in vivo
proteína producto, sin embargo, nunca ha sido confirmada.
A) Western blot de lisados gastrointestinales B6 utilizando el anticuerpo Meis1-N. GAPDH se utiliza como control de carga. PSI, MSI, y DSI indican lisados de los extremos proximal, medio y distal del intestino delgado, respectivamente. PC y DC indican lisados de los extremos proximal y dos puntos distales. B) La amplificación de
MEIS1
isoformas de ADNc de colon proximal B6 utilizando RT-PCR. Se incluyen diagramas de las transcripciones) C y D) los productos de las isoformas Meis1a, Meis1b, y Meis1d. Las ubicaciones de los dos dominios Meinox (M1 y M2) y el homeodominio (HD) están etiquetados.
Meis1d, una isoforma truncada Meis1, se expresa en el ciego y el colon proximal murino
Si el producto 27 kD Meis1 es Meis1d, entonces el
Meis1d
transcripción debe ser detectable en el colon proximal. Para determinar si el
está presente Meis1d Versión taquigráfica,
MEIS1
variantes de empalme se amplificaron a partir B6 proximales muestras de ADNc de colon utilizando RT-PCR. Se diseñaron los cebadores para amplificar a través de exón 8, distinguiendo
Meis1d
de las isoformas de larga duración,
Meis1a
y
Meis1b
. Los productos amplificados por PCR de reacción de aproximadamente 758 y 904 pb de longitud, el tamaño previsto de los productos procedentes de
Meis1d
y
Meis1a /B Opiniones transcripciones (Figura 1b). La diferencia de tamaño entre los dos productos se corresponde con la longitud conocida del exón 8 (146 bp), lo que sugiere que el producto más pequeño que se carece de exón. La extracción y la secuenciación del producto de PCR más pequeño confirmó la ausencia del exón 8 del producto de PCR (datos no presentados), lo que demuestra la presencia de la
Meis1d
transcripción en el colon proximal murino.
Remoción del exón 8 de la
Meis1d
transcripción provoca un desplazamiento del marco en el exón 9. el resultado de este desplazamiento del marco es la producción del producto proteico truncado con cinco nuevos aminoácidos en el extremo C-terminal (Figura 1d). Dado que estos residuos no están presentes en las isoformas de longitud MEIS1 completos, se generó un anticuerpo orientación personalizada al epítopo único (Meis1d-C). Para determinar si el anticuerpo de encargo reconoce el producto ~27 kD Meis1, lisados de colon de ratones B6 se sondearon con los anticuerpos Meis1d-C y Meis1-N. colon proximal y colon distal lisados se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. Como se esperaba, el anticuerpo Meis1-N recogió la banda kD identificada previamente ~27 en el colon proximal, pero no el colon distal (Figura 2a). El mismo patrón de expresión se observó en las muestras sondeadas con anticuerpo Meis1d-C, lo que demuestra que el anticuerpo Meis1d-C detecta el producto ~27 kD Meis1 y que indica que el producto es Meis1d (Figura 2a). Para determinar el patrón de expresión espacial de la proteína Meis1d, lisados de un panel de órganos B6 se sondearon con el anticuerpo Meis1d-C. Meis1d expresión se limitaba hasta el ciego y el colon proximal (Figura 2b, c).
A) Western blot de lisados proximal B6 y colon distal con los anticuerpos Meis1-N y C-Meis1d. Las posiciones de Meis1, Meis1b, y los dos productos novedosos MEIS1 están etiquetados. B) y C) Lisados de un panel de órganos B6 se sondearon con el anticuerpo Meis1d-C. GAPDH se utiliza como control de carga.
modificación postraduccional de Meis1d se correlaciona con la localización subcelular
isoformas Homeodominio-menos de otras proteínas del homeodominio se han demostrado que funcionan a través de dos mecanismos. Las proteínas homeodominio menos pueden secuestrar isoformas de larga duración en el citoplasma a través de interacciones negativas dominantes. isoformas Homeodominio-menos también pueden actuar como parejas de unión nucleares para otros factores de transcripción, la alteración de la activación de los genes diana. Por lo tanto, la localización subcelular de Meis1d puede indicar el papel funcional de la isoforma en el colon. Para determinar la localización subcelular de Meis1d, B6 lisados colon proximal se separaron en fracciones nucleares y citoplasmáticas y se sondaron con anticuerpo Meis1-N. Como era de esperar, de longitud completa Meis1 estaba presente en la fracción nuclear (Figura 3a). El producto 32 kD Meis1 también estaba presente en el núcleo. La proteína de 27 kD Meis1d, sin embargo, se observó sólo en la fracción citoplásmica (Figura 3a). Estos datos de localización indican que Meis1d no está actuando como un factor de transcripción o el secuestro de longitud completa Meis1 fuera del núcleo, lo que sugiere que la isoforma tiene nuevas funciones citoplásmicos.
A) muestras de colon proximales B6 se separaron en fracciones nucleares y citoplasmáticas y probaron con el anticuerpo Meis1-N. Histona H1 se utilizó para confirmar el fraccionamiento subcelular. B) Análisis de transferencia Western de colon proximal B6 y células HCT116 que expresan el ORF Meis1d utilizando el anticuerpo Meis1-N. ) las células HCT116 C se infectaron con retrovirus con la ORF Meis1d o un vector de MSCV vacía. Las células fueron tomadas 72 horas después de la infección, fraccionados, y se sondaron con el anticuerpo Meis1-N. Las posiciones de Meis1a, Meis1d nuclear (Meis1d
32), y citoplasmática Meis1d (Meis1d
27) están etiquetados en su caso.
Para estudiar los efectos de
Meis1d
expresión
in vitro
, el marco de lectura abierta (ORF) de
Meis1d
estaba infectado con retrovirus en la línea celular de cáncer de colon HCT116. El análisis de transferencia Western de lisados de células reveló la presencia de una proteína de 32 kD que se detectó por el anticuerpo Meis1-N, pero no el anticuerpo Meis1d-C (Figura 3b). Este producto
in vitro
Meis1d es de ~ 5 kDa mayor que la esperada proteína de 27 kD predicho por la transcripción y Meis1d observado
in vivo gratis (Figura 3b). Sin embargo, el peso molecular coincide con la novela 32 kD Meis1 isoforma observado previamente en B6 estómago y lisados de colon (Figura 1a). El peso molecular de
in vitro
Meis1d se confirmó en tanto murino 3T3 y de simio COS-1 células, lo que indica que el aumento de tamaño no es específico de la línea celular (datos no mostrados). Modificación postraduccional de los
in vitro de productos
Meis1d pueden ser la causa del peso molecular aumentado, así como la incapacidad del anticuerpo Meis1d-C para detectar la proteína.
A diferencia de los 27 kD producto Meis1d, la 32 kD Meis1 isoforma se localiza en el núcleo en el colon proximal. Para determinar si
in vitro
Meis1d está también localizado en el núcleo, las células HCT116 que expresan Meis1d se fraccionaron. Los 32 kD
in vitro
Meis1d producto estaba presente en los lisados nucleares, recapitulando el
in vivo
localización subcelular de la novela isoforma de 32 kD (Figura 3c). Estos datos sugieren que tanto los 27 kD y 32 kD isoformas MEIS1 observados en el tracto GI murino son traducidos de la
Meis1d
transcripción. La forma citoplásmica (Meis1d
27) es el peso molecular predicho de Meis1d, mientras que la forma nuclear (Meis1d
32) es más grande, muy probablemente debido a la modificación postraduccional.
nuclear y citoplasmática son Meis1d mutuamente excluyentes en el colon
el colon consta de una sola capa de células epiteliales que cubren la lámina propia y varias capas musculares. El cáncer de colon se deriva a partir de células madre localizadas en la capa epitelial [28]. Para determinar si cualquiera de Meis1d
27 o Meis1d
32 se expresan en el epitelio del colon, las células epiteliales fueron aisladas de muestras de colon proximal y distal B6. Los lisados de las células epiteliales aisladas y las capas de la lámina propia /músculo se probaron con anticuerpos Meis1-N. La
proteína Meis1d 27 se expresa exclusivamente en las células epiteliales del colon proximal (Figura 4a). Meis1d
32, sin embargo, se expresó en la lámina propria capas /musculares, tanto de los extremos proximal y distal del colon (Figura 4a). Las isoformas MEIS1 larga duración, Meis1a y Meis1b, también estuvieron presentes en sólo en las muestras propria /lámina musculares (Figura 4a). Estos datos indican que las formas nucleares y citoplásmicos de Meis1d no están presentes en las mismas poblaciones de células en el colon murino. Además, Meis1d
27 se expresa en células epiteliales del colon en ausencia de longitud completa Meis1. Para confirmar aún más la expresión de las células epiteliales de Meis1d
27, muestras de colon B6 se tiñeron con anticuerpos Meis1-N. se observó una fuerte tinción citoplásmica en el epitelio del colon proximal, pero no el colon distal (Figura 4b). Este patrón de expresión recapitula la expresión de Meis1d
27, de nuevo lo que sugiere que Meis1d
27 está presente en las células epiteliales del colon proximal.
muestras A) proximales B6 y colon distal se separaron en epitelial y fracciones no epiteliales. Las fracciones no epiteliales consisten en la lámina propia y musculares capas del colon. Las fracciones y los lisados de células enteras de ambos segmentos de colon se sondearon con el anticuerpo Meis1-N. Se utilizaron células COS-1 que expresan Meis1d comparar el
in vitro y Hoteles en
in vivo
pesos moleculares de Meis1d
32. B) proximal B6 y muestras de colon distal se tiñeron con anticuerpos Meis1-N. La tinción se visualizó a 20 × magnificación.
La expresión de la proteína MEIS1D está regulado por disminución en los cánceres colorrectales humanos
Meis1 está altamente conservada en eucariotas y la eliminación del exón 8 del ARNm MEIS1 humana codificaría un producto proteico predicho con un 99% de homología a murino Meis1d. Sobre la base de la conservación evolutiva de Meis1, hemos tratado de caracterizar la expresión de MEIS1D en el colon humano. Una transferencia Western se realizó en lisados de colon humano utilizando el anticuerpo Meis1-N. Una banda del tamaño predicho de MEIS1D
27 se observó en las muestras de colon humano (Figura 5b). Para confirmar la expresión de la transcripción MEIS1D, RT-PCR se realizó en cDNA de colon humano (Figura 5a). Una banda de 758 pb se amplificó, lo que indica que
MEIS1D
ARNm se transcribe en el colon humano.
A) de amplificación por RT-PCR de
MEIS1D Versión taquigráfica de ADNc de colon humano. B) Análisis de transferencia Western de lisados de tumores colorrectales humanos (T) y la mucosa normal correspondiente (N) utilizando el anticuerpo Meis1-N. GAPDH se utilizó como control de carga. Las muestras representan las cuatro secciones del colon humano:. Ascendente, transverso, descendente y sigmoide
La expresión de MEIS1 longitud completa que se conoce que están alteradas en varios tumores sólidos [29], [30]. Para determinar el estado de MEIS1 en el cáncer colorrectal, transferencias de Western se realizaron en el colon normal emparejado y los lisados de tumores colorrectales primarios utilizando el anticuerpo Meis1-N. Meis1a y MEIS1B se expresaron tanto en tumor y las muestras normales, mientras que MEIS1D
32 no estaba presente en cualquier conjunto de muestras (datos no mostrados). Sin embargo, 83% (10/12) de las muestras normales de la mucosa de colon expresaron niveles detectables de MEIS1D
proteína 27 (Figura 5b). La expresión se reduce o se pierde por completo en todas las muestras tumorales coincidentes de estos pacientes (Figura 5b). Los dos pacientes restantes expresan niveles no detectables de MEIS1D
27, tanto en la mucosa y tejido de tumor normal (Figura 5b). Estos
in vivo
datos indican que MEIS1D
27 expresión es downregulated durante la tumorigénesis intestinal.
Discusión
El empalme alternativo es conocida por producir dos
Meis1
isoformas,
Meis1a
y
Meis1b
, tanto en ratones como en humanos. Tanto las proteínas Meis1a y Meis1b son de longitud completa, que contiene los dos dominios Meinox implicados en las interacciones proteína-proteína y el homeodominio de unión a ADN (Figura 2d). Los productos proteicos de estas variantes de corte y empalme difieren en el extremo C-terminal, debido a la corte y empalme del exón 12 de la
Meis1b
secuenciación de codificación (Figura 2c, d). La evidencia sugiere que las dos isoformas similares pueden activar la transcripción de diferentes subconjuntos de genes [31]. Pantallas de bibliotecas de ADNc indican que un gran número de transcritos adicionales empalmados alternativamente se produce a partir de la
Meis1
locus [26], [27], [32]. A diferencia de
Meis1a
y
Meis1b
, sin embargo, por otra
no se han observado proteínas MEIS1
transcripciones
in vivo
. Por lo tanto, no queda claro si estas transcripciones son artefactos funcionalmente relevantes o simplemente generadas por splicing alternativo incorrecto.
En el presente trabajo, hemos descrito dos productos proteicos de la
Meis1d
variante de empalme, una isoforma previamente identificados en las pantallas de ADNc. La
Meis1d
transcripción carece de exón 8, resultando en una proteína predicha de 27 kD que carecen de la homeodominio (Figura 2c, d). Este producto 27 kD se observó en el citoplasma de las células epiteliales de colon proximal (figuras 3a, 4a). Un segundo, 32 kD producto Meis1d se produce en los núcleos de las células no epiteliales en el estómago y el colon (Figuras 3A, 4A). Las formas citoplasmáticas y nucleares de Meis1d han sido nombrados Meis1d
27 y Meis1d
32, respectivamente. El peso molecular más grande y la localización nuclear de la Meis1d
32 proteínas se recapitulan en las células transfectadas con el
Meis1d
ORF (Figura 3b). También se observó expresión de MEIS1D
27 en muestras de colon humano, lo que demuestra la conservación evolutiva de esta nueva isoforma (Figura 5).
Meis1d
es sólo la tercera
Meis1
isoforma para el cual un producto proteico traducido ha sido confirmado y es también el primer producto Meis1 homeodominio-menos observado, ya sea en ratones o tejidos humanos.
isoformas Homeodominio menos se han descrito para muchos genes homeobox, entre ellos varios miembros de la familia Hox. Sólo unas pocas de estas isoformas, sin embargo, han sido identificados en los genes de la superfamilia del cuento, un grupo que incluye Meis1. La pérdida del homeodominio impide la unión directa a las secuencias diana de ADN y activación de la transcripción normal. isoformas Homeodominio menos de factores de transcripción CUENTO, sin embargo, se han demostrado previamente que todavía regular la transcripción a través de dos mecanismos distintos. Las isoformas truncadas pueden tener efectos negativos dominantes, el secuestro de proteínas de longitud completa en el citoplasma y la prevención de la activación transcripcional de los objetivos de abajo [33], [34]. Las proteínas de homeodominio-menos también pueden interactuar con el ADN indirectamente mediante la unión de otros factores de transcripción para formar heterodímeros. La presencia de las proteínas truncadas altera el sitio de unión a ADN de la proteína compleja, la activación de un subconjunto distinto de objetivos de abajo [35].
Desde isoformas homeodominio-menos de genes relacionados tienen mecanismos distintos en el citoplasma y el núcleo, las localizaciones subcelulares de Meis1d y cualquier compañeros de unión potenciales pueden sugerir una función celular. En el presente estudio, se observó Meis1d ya sea en el núcleo o citoplasma dependiendo del tipo de célula. Meis1d
27 se expresa en el citoplasma de las células epiteliales de colon proximales (Figuras 3, 4). isoformas de longitud completa están presentes en la fracción nuclear de lisados colon proximal, lo que indica que Meis1d
27 no secuestrar otras isoformas MEIS1 en el citoplasma (Figuras 3, 4). Más evidencia indica que Meis1d
27 no se expresa en las mismas celdas que Meis1a o Meis1b, evitando cualquier tipo de interacción negativa dominante (Figura 4). La forma citoplasmática de Meis1d todavía se puede unir otros factores de transcripción desconocida y prevenir la localización nuclear. La isoforma puede tener también una nueva función homeodominio-independiente no relacionada con la activación transcripcional
.
La función potencial de Meis1d
27 no está claro ya que los datos no se ajusta ya sea mecanismo conocido de proteínas homeodominio TALE-menos. La proteína no puede estar actuando como un dominante negativo, ya que no se expresa en las mismas células que otras isoformas MEIS1. Meis1d
27 también puede no estar activando la transcripción aguas abajo en el interior del núcleo, porque la proteína se localiza en el citoplasma. La forma nuclear de Meis1d, sin embargo, todavía puede caber cualquiera de estos mecanismos en la lámina propia o músculo que rodea el colon. La localización nuclear de Meis1d
32 significa que la proteína podría estar actuando como una pareja de unión para otros factores de transcripción. Meis1d
32 todavía mantiene los motivos necesarios para la interacción PBX y homodimerización [36]. Estos datos sugieren que la isoforma truncada aún podría funcionar como un co-factor con estas otras proteínas del homeodominio. El Meis1d
32 proteínas también puede actuar como dominante negativo isoforma el interior del núcleo, lo que impide la asociación entre las proteínas MEIS1 longitud completa y regiones promotoras en el ADN. Además la disección de la lámina propia y la capa muscular subyacente es necesario determinar si Meis1d
32 y cualquier parejas de unión potenciales se expresan en la misma población de células. Identificación de los roles funcionales tanto para Meis1d
32 y Meis1d
27 ayude a explicar la relevancia de
Meis1
empalme de la función intestinal y la homeostasis.
A pesar de la falta de una función definida