Extracto
Antecedentes
Es un gran reto clínico para predecir qué pacientes, con la cabeza de etapa avanzada y carcinoma de células escamosas de cuello, no exhibirán una reducción en el tamaño del tumor después de la quimioterapia de inducción con el fin de evitar los efectos tóxicos de la quimioterapia ineficaz y retrasos para instituir otras opciones terapéuticas. Además, es de interés conocer en qué medida una firma genética, que identifica a los pacientes con tumores que no responden a una quimioterapia de inducción en particular, es aplicable cuando se añaden agentes quimioterapéuticos adicionales para el régimen.
Metodología /principales conclusiones
para identificar los genes que predicen la resistencia del tumor a la inducción con cisplatino /5-fluorouracilo (PF) o PF y un taxano, se analizaron las biopsias de tumores de pacientes con microarrays de todo el genoma y cuantitativa la transcriptasa inversa-PCR (TLDA) tarjetas. Una licencia de uno procedimiento de validación cruzada permitió la evaluación de la herramienta de predicción. Un microarray firma de diez genes clasificó correctamente 12/13 7/10 respondedores y no respondedores a PF (92% de especificidad, 82,6% de exactitud). TLDA análisis (utilizando el mismo clasificador) de los pacientes que respondieron correctamente clasificado el 12/12 y 8/10 no respondedores (100% de especificidad, 90,9% de exactitud). Además, el análisis TLDA predijo correctamente la respuesta de 5 nuevos pacientes y, en general, 12/12 y 13/15 respondedores no respondedores (100% de especificidad, 92,6% de exactitud). Los productos proteicos de los genes que constituyen la firma asocian físicamente con otros 27 proteínas, implicadas en la regulación de la expresión génica, que constituyen una red de interacción. Por el contrario, la predicción (con la misma firma de genes) de las respuestas TLDA de base a la inducción con PF y cualquiera de los dos taxanos era pobre (0% de especificidad, 25% de precisión y 33,3% de especificidad, 25% de precisión).
Conclusiones /Importancia
transferencia exitosa de la firma génica basada en microarrays de una tecnología independiente, basado en la PCR sugiere que las firmas basadas en TLDA podría ser una tecnología basada en el hospital útil para determinar las opciones terapéuticas. Aunque altamente específico para la respuesta tumoral a la inducción PF, la firma genética no tiene éxito cuando se añaden los taxanos. Los resultados ilustran la sutileza en el desarrollo de la "medicina personalizada"
Visto:. Tomkiewicz C, Hans S, Mucchielli MH, Agier N, H Delacroix, Marisa L, et al. (2012) Un tumor de cabeza y cuello Cáncer de respuesta específica del gen firma de cisplatino, 5-fluorouracilo quimioterapia de inducción error con el añadido taxanos. PLoS ONE 7 (10): e47170. doi: 10.1371 /journal.pone.0047170
Editor: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de mayo de 2012; Aceptado 10 de septiembre de 2012; Publicado: 9 Octubre 2012
Copyright: © Tomkiewicz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por el CNRS (Centro Nacional de Investigación Científica), el INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), Assitance Pública-Hospitales de París (CRC03017), Universidad de París Descartes. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) es el sexto cáncer más frecuente en todo el mundo [1]. En Francia, se registraron más de 20.000 casos nuevos y aproximadamente 6.000 muertes en 2003 y la tasa de supervivencia a cinco años es todavía baja (50%). Las estrategias de tratamiento para el cáncer avanzado de cabeza y cuello han cambiado durante los últimos 30 años. Estrategias de hoy, sobre todo para la laringe, hipofaringe oro- y el cáncer, se centran en los procedimientos quirúrgicos y no quirúrgicos que conservan un órgano funcional. [2].
Históricamente, dos estudios clínicos, del Departamento de Asuntos de Veteranos (DVA) de laringe Cancer Study Group [3] y el Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) 91-11 [4], han influido en la gestión de cáncer de laringe avanzado. El estudio DVA [3] fue el primero en promover la estrategia de preservación de órganos y para demostrar que la supervivencia del paciente después de neoadyuvante o de inducción de quimioterapia (cisplatino y 5-fluorouracilo) seguida de radioterapia era casi idéntica a la que después de la laringectomía total y radioterapia postoperatoria.
sin embargo, el uso y beneficio de la quimioterapia sigue siendo el tema de debate a continuación de un meta-análisis, en 2000, de los 63 ensayos entre 1965 y 1993, que mostró que la quimioterapia en la cabeza no metastásico y carcinoma de células escamosas del cuello en 10.741 pacientes con carcinoma de la orofaringe, cavidad oral, laringe o hipofaringe dieron sólo una pequeña marcada ventaja de la quimiorradioterapia concomitante [5].
En 2007, un estudio multicéntrico Eastern Cooperative Oncology Group fase II [6] reportado una alta tasa de órganos de conservación con quimioterapia basada en taxanos para el cáncer orofaríngeo, pero no para el cáncer de laringe. Dos estudios clínicos [7], [8] fueron publicados en 2007, que comparó un régimen más intensivo de quimioterapia de inducción; docetaxel se añadió al régimen de cisplatino /5-fluorouracilo convencional. La terapia secuencial con docetaxel inducción, cisplatino y 5-fluorouracilo (TPF) mejoró significativamente la supervivencia y la supervivencia libre de progresión en comparación con cisplatino y 5-fluorouracilo (PF) en la laringe localmente avanzado, cáncer de oro- e hipofaringe [7] lo que sugiere el uso de TPF secuencial seguido de carboplatino quimio-radioterapia como una opción de tratamiento para la preservación de órganos y para mejorar la supervivencia de la laringe localmente avanzado, oro- y el cáncer de hipofaringe. El TAX 323 grupo europeo estudio [8] en comparación TPF con PF como la quimioterapia de inducción en pacientes con locorregional enfermedad en estado avanzado, no resecable y mostró que la mediana de supervivencia libre de progresión fue de 11,0 meses en el grupo TPF en comparación con 8,2 meses en el grupo de PF. Aunque la adición de la docetaxol taxano a cisplatino /quimioterapia de inducción 5-fluorouracilo mejora la respuesta clínica y la supervivencia en comparación con cisplatino /5-fluorouracilo solo o cisplatino /5-fluorouracilo en combinación con radioterapia, puede tener una mayor incidencia de acontecimientos hematológicos adversos (neutropenia y complicaciones relacionadas) [9]. Sin embargo, alrededor del 30% de los pacientes muestran ya sea ninguna mejora o empeoramiento de su estado después de la inducción. Es, por lo tanto, un reto clínico importante para predecir qué pacientes no se beneficiará de inducción i quimioterapia) para evitar los efectos tóxicos de la quimioterapia ineficaz; ii) para evitar retrasos de otras opciones terapéuticas y iii) para minimizar el coste del tratamiento.
investigaciones anteriores de la respuesta a la quimioterapia de inducción en HNSCC mostraron que las diferencias en los genotipos de varias enzimas están asociados con las variaciones en la respuesta a base de cisplatino quimioterapia de inducción [10]. Ciclina A expresión en HNSCC predijo una mejor respuesta a cisplatino /5-fluorouracilo quimioterapia [11]. Además, se encontraron mejores índices de supervivencia para los pacientes cuando la expresión de laminina y syndecan-1 cambió en respuesta a la quimioterapia [12]. Sin embargo, todos estos estudios se centran en sólo uno o unos pocos genes. Microarray basado en perfiles de expresión génica de los cánceres de cabeza y cuello se ha utilizado principalmente para la clasificación de los tumores o para predecir metástasis a distancia o el resultado [13] - [15]. Aunque la expresión de genes análisis han evaluado la respuesta a preoperatoria quimio-radiación [16] o quimioterapia de inducción con 5-fluorouracilo, cisplatino y adriamicina [17] en el cáncer de cabeza y cuello, ningún estudio de microarrays de todo el genoma se ha ocupado de cisplatino /5-fluorouracilo la terapia de inducción. En este trabajo mediante el análisis de microarrays de todo el genoma, hemos tratado de identificar los genes que son predictivos de la respuesta del tumor a la quimioterapia de inducción con cisplatino /5-fluorouracilo. Se buscó además para determinar en qué medida esta firma genética era aplicable cuando adicionales agentes quimioterapéuticos (cisplatino /5-fluorouracilo y un taxano en docetaxel o paclitaxel) se añadieron al régimen de tratamiento.
Métodos
pacientes y quimioterapia de inducción
Entre 2002 y 2007, los pacientes con diagnóstico histológico de carcinoma de orofaringe sin un historial previo de localizaciones de cáncer o tumores múltiples y carente de contraindicaciones para la quimioterapia basada en cisplatino eran incluidos en el estudio en el hospital Georges Pompidou Europea (HEGP), París. Los pacientes, todos los cuales habían avanzado (estadio 3 o 4) tipos de cáncer, recibieron PF (100 mg /m
2 Día cisplatino (D) 1 y 1 g /m
2 5-FU D1-D5) o TPF (ya sea carboplatino (paraplatine) -AUC5 D1 (donde AUC es el área bajo la curva, una fórmula que permite el cálculo de la dosis, adaptándola al valor del aclaramiento de creatinina) y 175 mg /m
2 paclitaxel D1 (T1PF) o PF más docetaxel: 75 mg /m
2 cisplatino D1, 75 mg /m
2 docetaxel D1, y 750 mg /m
2 5-FU como una perfusión continua D1-D5 ( T2PF) la quimioterapia de inducción. Un promedio de 3 cursos (rango 2-5) fue dado con intervalos de 14-21 días entre los cursos y las dosis se ajustaron para tener en cuenta la tolerancia y la respuesta individual. los pacientes fueron evaluados por la cabeza y cuello Junta tumor de la HEGP (compuesto por especialistas de cabeza y cuello, radiólogos y patólogos). Se estudiaron los pacientes en dos de los cuatro grupos en la clasificación ECOG [18], con el fin de tener dos grupos que eran los más "clínicamente" diferente . La respuesta se definió tanto por examen clínico y radiológico; respondedores clínicos completos (CCR) mostraron más de 90% de disminución del tamaño del tumor mientras que el grupo no respondedor (NR) mostró disminución de menos de 50% en el tamaño del tumor o la progresión de la enfermedad.
HES-NR y HES CCR corresponden a la tinción con hematoxilina-eosina-Safran de no respondedor representativo y completas individuos respondedores clínicos, respectivamente, y IHC-p16 y el VPH HIS-oncogénica corresponden a inmunohistoquímica positiva representante para el antígeno p16 (tinción marrón ) y la hibridación
In situ Opiniones de ADN de VPH oncogénico (azul punteada tinción nuclear), respectivamente. La barra representa 40 micras en los paneles superiores y 20 micras en los paneles inferiores.
Ética
El estudio fue autorizado por el comité de ética (CCPPRB París-Broussais-HEGP N ° 2002-035) y la legislación francesa obedecido la investigación biomédica. Consentimiento informado, se obtuvo de todos los participantes.
Recogida de muestras, Histología y Virología
Para el diagnóstico, se obtuvieron muestras de tumor durante la endoscopia bajo anestesia general antes de cualquier tratamiento. Cada biopsia de tumor se puso inmediatamente en RNAlater (Ambion) para evitar la degradación del ARN. La biopsia fue cortado en 2 piezas, una para el examen patológico y el otro se congeló inmediatamente a -80 ° C hasta su posterior procesamiento para la extracción de RNA. Fijados con formalina, se utilizaron bloques de tejido embebido en parafina para preparar los portaobjetos durante 1) hematoxilina-eosina-Safran (HES) tinción para la evaluación del estado de tumor y el porcentaje de células tumorales en la biopsia, 2) la tinción inmunohistoquímica para el antígeno p16 y 3)
In situ
hibridación utilizando el VPH (Virus del Papiloma humano) Familia III 16 Probe B) kit (para detectar los principales ADN del VPH tipos oncogénicos INFORM 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 (Roche Diagnostics, Francia). La tinción se realizó utilizando el aparato ULTRA Ventana Roche Clyde referencia. Se utilizaron protocolos de los fabricantes. El estado del VPH no se pudo determinar por un CCR individual del grupo tratado con PF. Los análisis histológico estableció que todos los tumores eran carcinomas de células escamosas (Figura 1 muestra la tinción representativa HES de biopsias de NR y CCR individuos). Los grupos NR y CCR exhiben grados generales similares de diferenciación tumoral y porcentaje de celularidad tumoral.
El clasificador 10-gen separa claramente los miembros de la NR (esferas azules) y CCR (esferas rojas) grupos. 82-83 por ciento de la variabilidad está contenido en estas tres primeras dimensiones.
Preparación y Evaluación de la Calidad de ARN
"Tripure aislamiento reactivo" (Roche) se utilizó para extraer el ARN de la biopsia. En pocas palabras, la biopsia (menos de 100 mg) se homogeneizó en 1 ml Tripure con 3 perlas de tungsteno estéril en un Retsch MM20 molino mezclador (3 min a una velocidad de molienda 29, 3 veces). Después de la adición de doscientos l de cloroformo, el tubo se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante al menos 5 min y se deja reposar durante otros 5 minutos antes de la centrifugación (15 min, 12.500 rpm, 4 ° C). La capa superior acuosa, se recogió el ARN que contiene. Después de la adición de 500 l de isopropanol e incubación a -20 ° C durante 10 min, el ARN se sedimentó por centrifugación (15 min, 12.500 rpm, 4 ° C). El sedimento se lavó con 1 ml de 75% de etanol, se centrifugó como se describió anteriormente y se secó a temperatura ambiente durante 10 min. El ARN total se resuspendió en 40 l de agua libre de RNasa. RNA se purificó adicionalmente con la DNasa Set libre de RNasa (Qiagen) y RNeasy limpieza MiniElute (Qiagen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los ARN se cuantificarán mediante un NanoDrop ND-1000 y se evaluó su calidad mediante electroforesis utilizando un Bioanalyzer (Agilent).
Etiquetado y purificación de sondas
Para los estudios de microarrays, un total de 23 muestras y una referencia universal de ARN, que comprende ARN a partir de 10 tejidos humanos diferentes (Clontech), se usaron para sintetizar ARNc marcado. En pocas palabras, 200-300 ng de ARN total extraído de las biopsias o de la referencia ARN fueron etiquetados utilizando cyanine3-CTP o cyanine5-CTP y el "kit de amplificación lineal fluorescente bajo el ARN de entrada" (Agilent), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se purificaron las sondas fluorescentes (purificación RNeasy Mini Kit, Qiagen) y la concentración de las sondas y el nivel de incorporación de los colorantes en las sondas se midió (espectrofotómetro Nanodrop D-1000). electroforesis en agarosa de las sondas marcadas (1,2% de gel de agarosa en 0,5 x TBE) realiza en un portaobjetos de microscopio, junto con marcadores de ADN (100 pb, Biolabs) se realizó y la fluorescencia del gel se evaluó en un escáner GeneTac IV (Perkin-Elmer ). Tanto la intensidad de la señal y el perfil de las muestras indicaron la calidad de la etiqueta.
hibridación y el lavado de los microarrays de
Las sondas (1 g cada uno de una muestra de biopsia y de la referencia , diseño directo) se hibridaron a un microarray humana 44K pan-genómico (Agilent) que contiene 41.000 sondas, que corresponden a genes o etiquetas de secuencia expresada, utilizando el protocolo de procesamiento de oligo microarrays 60-mer Agilent (Agilent). La hibridación se realizó durante 17 horas a 60 ° C con rotación en un horno de hibridación (Agilent) como se describe por el fabricante. Los microarrays se lavaron como se describe en el protocolo del fabricante y se seca inmediatamente en una centrífuga Speed-Vac durante 2 minutos.
Escaneado de la matriz y Procesamiento de Imágenes
Los microarrays fueron escaneados utilizando un escáner Axon 4000B ( molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) a 5 micras resolución. voltajes PMT se ajustan automáticamente para equilibrar la distribución de las intensidades de color rojo y verde, y para optimizar la dinámica de la cuantificación de imagen. La tasa de píxeles saturados se limitó a 0,01%. Las imágenes de 16 bits resultantes se analizaron y la cuantificación de las señales en los arrays se realizaron utilizando el software GenePix Pro 6.0 (Axon Instruments, Union City, CA). La segmentación se calculó con el método de "círculo de adaptación" de procesamiento. Fondos no se restaron y no encontraron, saturados y se descartaron los puntos malos. Intramatricial normalización (con exclusión de los puntos de control, 2.615 sondas) se realizó mediante el método de loess con un parámetro de 0,5 lapso.
Análisis estadístico
Los genes expresados diferencialmente entre CCR y NR en el estudio de microarrays fueron identificado por una permutación de prueba mutivariable control de la tasa de falso descubrimiento (una prueba t moderado con el ajuste de los valores de p [19] usando el software de mango fueron seleccionados [20]. los genes tan significativamente diferencialmente expresado cuando el valor de p fue inferior a 0.025 , la variación media veces (las veces el cambio entre las medias de las señales normalizadas de los 13 respondedores clínicos completos y de los 10 no respondedores) superior a 1,3 en valor absoluto y la intensidad media (log
2 (Cy5 * Cy3) /2) mayor que 7. Cada gen tiene al menos un valor entre los dos promedios de registro
2 (NR /ref) y log
2 (CCR /ref) mayor que 0,4 en valor absoluto y al menos un valor entre las dos desviaciones estándar de registro
2 (NR /ref) y log
2 (CCR /ref) inferior a 0,5. Por otra parte, hay una recuperación mínima entre CCR y NR (|mean(log
2(NR/ref))–mean(log
2(CCR/ref))|–[SD(log
2(NR/ref))+SD(log
2(CCR/ref))])>−0.55.
A clasificador, para predecir la respuesta a la quimioterapia de los pacientes futuros de los genes seleccionados como diferencialmente expresados, se ideó un método supervisado predicción (Support Vector Machines con núcleo lineal, SVM) [21], [22] el uso de BRB Herramientas de matriz versión 4.1. 0 desarrollado por el Dr. Richard Simon y BRB Herramientas de matriz Equipo de Desarrollo [23]. Se evaluó el clasificador [23], [24] utilizando un procedimiento de validación cruzada (LOOCV) dejar uno fuera. El escalamiento multidimensional (distancias euclidianas) se realizó con el SMACOF algoritmo [25] y la tensión de Kruskal fórmula [26]. La etapa de validación cruzada permite también la designación, entre los genes seleccionados, de los que dan los mejores puntajes de predicción. Es estos genes cuya firma se utilizará para determinar la respuesta a la quimioterapia. análisis de la curva ROC se realizó con el análisis de datos y software de gráficos paquete Sigma Plot 11. La comparación de las características clínico-biológicos de los grupos NR y CCR se realizó usando la prueba t o una estadística de Mann-Whitney cuando sea apropiado.
La transcripción inversa del ARN para el análisis de PCR
Se preparó ADNc 200 ng de ARN utilizando la alta capacidad de cDNA Archivo kit (Applied Biosystems). Con el fin de comparar el nivel de ARNm en las diversas biopsias, se utilizó la misma referencia RNA universal como que en los microarrays.
Taqman Low Density Array (TLDA) -cuantitativo RT-PCR
Cuarenta y tres biopsias de pacientes tratados con PF (22 de las 23 biopsias que se analizaron con microarrays (había ARN suficientes a partir de uno de los pacientes originales para ser utilizado en el estudio TLDA), más cinco biopsias adicionales de los pacientes que recibieron la misma la terapia de inducción PF), 8 biopsias de pacientes tratados con T1PF y 8 biopsias de pacientes tratados con T2PF se utilizaron en el estudio TLDA. RT-PCR cuantitativa se realizó con Taqman tarjetas de matriz de baja densidad. sonda Taqman prediseñado y conjuntos de cebadores para los genes diana clasificador (en base a los resultados de microarrays) estaban en la matriz de 384 pocillos cargados de fábrica. El formato de matriz se ha personalizado en línea con 2 réplicas por gen diana clasificador. Las muestras de cDNA se analizaron usando un aparato ABI Prism 7900HT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, cada muestra de ADNc (100 ng en 25 l) se combinó con 25 l de agua y se añade a un volumen igual de 2X Taqman PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems). Las mezclas (100 mu l) se inyectaron en un puerto de carga de la TLDA. Para cada TLDA, ADNc a partir de la referencia universal Clontech se utilizó en paralelo con 7 de las muestras para evaluar la reproducibilidad de los experimentos. La matriz se centrifugó dos veces para distribuir las muestras en los pocillos. La tarjeta se selló y la amplificación se realizó como sigue: 2 min a 50 ° C (activación de glicosilasa uracilo-ADN), 10 min a 94,5 ° C (de activación), 40 ciclos de desnaturalización a 97 ° C durante 30 seg y 1 min a 59,7 ° C (hibridación y extensión). la expresión génica valores se calcularon con base en el método de ciclo umbral (Ct), que utiliza la fórmula 2
-ΔΔCt para calcular la expresión de los genes diana normalizados a un calibrador (Clontech referencia universal). Brevemente, se utilizó el C
t datos para todos los genes diana y el gen de GAPDH en cada muestra para crear el? C
t. A partir de entonces, ΔΔC
valores de t se calcula restando la? C
t del calibrador de la? C
t de la muestra. Las cantidades relativas (RQ) se determinaron utilizando la ecuación de RQ = 2
-ΔΔCt. Los valores de la muestra se expresaron en relación a la muestra calibrador
Análisis de interacciones proteína-proteína
Manual de interrogación de bases de datos (PSIQUIC Vista:. Http://www.ebi.ac.uk/Tools /webservices/psicquic/view/main.html; MENTA: http://www.mint.bio.uniroma2.it/mint/; InnateDB: http://ww.innatedb.com; IntAct: http: //www. ebi.ac.uk/Databases; BioGrid: http://www.thebiogrid.org y BioLink Explorer: http://www.diatomsoftware.com/biolink/) se realizó para identificar proteínas interactuantes, que para los que no había evidencia experimental de asociación física directa con las proteínas codificadas por los genes de la firma. A continuación, se buscó evidencia experimental en las mismas bases de datos de pruebas de asociación directa entre los interactuantes. La red resultante se visualiza en Cytoscape:. Http://www.cytoscape.org/
Resultados
Características clínicas y de respuesta a la quimioterapia de inducción
Un total de 44 hombres pacientes fueron incluidos (Tabla 1). Las mujeres fueron excluidas desde la etiología para HNSCC puede ser diferente de la de los hombres. Entre las características clínicas (Tablas 1 y 2) de los pacientes tratados únicamente con PF en el estudio de microarrays, sólo el estado del VPH y los cigarrillos fumados por día diferían significativamente (p = 0,03 y 0,05, respectivamente) entre los dos grupos (grupo CCR exhibido más positividad del VPH y fumado más). Entre los pacientes en el estudio TLDA, no hubo diferencias significativas en las características clínicas de la NR y CCR. NR y CCR fueron divididos de manera uniforme entre los 8 pacientes tratados con PF y paclitaxel (T1PF), mientras que 6 de los 8 pacientes tratados con PF y docetaxel (T2PF) eran CCR (Tabla 3). El análisis discriminante del conjunto de los pacientes utilizando la edad, estadio tumoral, el consumo de cigarrillos y alcohol, y los niveles de hemoglobina no predecir la respuesta a la quimioterapia (puntuación predictiva menos del 70%).
Una firma genética para la respuesta a cisplatino /5-fluorouracilo inducción
Uso de los resultados de los microarrays de las biopsias de los 23 pacientes tratados con PF (base de datos GEO: GSE32877), una firma de diez genes (Tabla 4) para la respuesta al tratamiento fue derivado. Curvas características de funcionamiento (curvas ROC) de cada uno de los diez genes mostraron su importancia para la clasificación de la falta de respuesta a la quimioterapia (figuras S1 y S2). Este clasificador clasificó correctamente a doce de los trece CCR y 7 de la NR 10 (92% de especificidad, sensibilidad 70%, precisión global de 82,6%, Tabla 5). Se utilizó el clasificador, a continuación, para diseñar Taqman arrays de baja densidad (TLDA), una tecnología más fácilmente adaptados a los análisis basados en el hospital que la tecnología de microarrays.
TLDA adición se utilizó el 10-gen clasificador derivados de microarrays para llevar a cabo RT-PCR cuantitativa en un total de 43 biopsias (Tablas 1 y 3 y en la Tabla S1). De los 22 pacientes tratados únicamente con PF, que estaban en el estudio de microarrays, 12 de 12 CCR y 8 de 10 NR fueron clasificados correctamente por TLDA utilizando el clasificador (100% de especificidad, sensibilidad del 80% y la precisión global del 90,9% y la figura S2) . El análisis TLDA también predijo correctamente la respuesta de los 5 nuevos pacientes tratados con PF y, en general (para los 27 pacientes tratados únicamente con PF), clasificados correctamente 12 de 12 CCR y 13 de 15 NR (100% de especificidad, sensibilidad del 86,7% y el 92,6 % de precisión total) (Tabla 5 y Figura S2). El escalamiento multidimensional (3D) muestra que los descriptores del clasificador separan claramente las CCR y NR individuos en dos grupos basados en el microarray (MA) y los datos TLDA (Figura 2). Aunque se encontró el estado del VPH de los individuos a ser diferente entre CCR y grupos NR (22 pacientes), además de la condición de VPH para la firma de 10 genes no mejoró las predicciones para el análisis TLDA y de hecho mal identificado uno de los 5 pacientes nuevos ( la curva ROC se muestra en la Figura S2). No hubo diferencia significativa en el estado de VPH de los individuos en el CCR 27 pacientes y grupos NR. Curiosamente, se encontró evidencia experimental en varias bases de datos para la interacción física directa entre los productos proteicos de los genes de la firma 10 de genes y otras proteínas interactor que forman una red (Figura S3 y en la Tabla S2).
La firma se específica para la quimioterapia de inducción régimen
para determinar su especificidad para el régimen de medicamentos, se investigó el rendimiento del clasificador en 16 pacientes adicionales tratados ya sea con paclitaxel o docetaxel más PF (T1PF y T2PF, respectivamente, las Tablas 1 y 3). Utilizando los resultados TLDA obtenidos con biopsias de pacientes tratados con cualquiera T1PF o T2PF, el clasificador mal predijo la respuesta a la inducción quimioterapéutica (0% de especificidad, sensibilidad 50%, 25% de precisión y 33,3% de especificidad, la sensibilidad 0%, 25% de precisión, respectivamente, Tabla 5). Para la inducción T1PF, el clasificador identifica sólo 2 de 4 NR correcta y 0 de 4 CCR. Ninguno de los 2 NR fue identificado correctamente en el caso de la inducción T2PF y sólo 2 de 6 CCR fueron identificados.
Discusión
orofaríngeos carcinomas de células escamosas (en particular de la base de la lengua y la amígdalas) representan el 35-40% de los cánceres de cabeza y cuello en Francia (4000 casos /año) y su incidencia ha aumentado en los países occidentales durante la última década. A continuación, se estudiaron los cánceres en etapa avanzada de la orofaringe, ya que son los más frecuentes de reclutamiento permitiendo de este modo de un número suficiente de pacientes para comparar respondedores clínicos completos con los no respondedores para la quimioterapia de inducción.
Dado que no se encontró asociación entre las características clínicas y la respuesta a la quimioterapia, una firma genética es relevante. Este estudio es el primero en emplear el análisis del genoma del transcriptoma totalidad de las biopsias de tumores para identificar un conjunto de genes de predicción específicamente para la respuesta del tumor a la quimioterapia de inducción PF para los pacientes HNSCC y la adaptación a dicha firma genética de una tecnología (TLDA) que puede ser adecuado para basado en el hospital utilización. La determinación de esta firma estaba condicionada a la utilización de un subconjunto homogéneo de pacientes masculinos que tenían localizaciones idénticas de su cáncer y que pertenecían a uno u otro de los dos grupos extremos de NR y CCR. El clasificador basado en microarrays es altamente específico para NR.
También diseñado y probado una matriz de Taqman de baja densidad con el fin i) Para comparar, utilizando los mismos pacientes, la sensibilidad, especificidad y exactitud de la microarray- clasificador basado en una tecnología independiente (RT-PCR cuantitativa) más fácilmente adaptada para los análisis basados en el hospital; ii) para evaluar la exactitud de la firma para los pacientes que no estaban en el estudio de microarrays
.
El clasificador derivados de la tecnología de microarrays se ha adaptado con éxito a una tecnología basada en PCR (TLDA tarjetas) y dio resultados predictivos similares. Además, el uso de la tecnología TLDA, el clasificador clasificó correctamente todos los nuevos pacientes. En general, para el ensayo de TLDA, ninguno de los 12 CCR fue clasificado erróneamente como NR y 13 de 15 NR se identificaron correctamente. Estos resultados sugieren que un clasificador de microarrays puede trasladarse a una tecnología que es más apropiado para su uso en hospitales y, si se valida más, la tecnología podría ser potencialmente útil para las decisiones específicas relacionadas con la quimioterapia. Visto desde un punto de vista terapéutico, ya que todos los no respondedores previstos fueron verdaderos no respondedores y sólo 2 de los respondedores predichos fueron, de hecho, no respondedores, esto indica que, potencialmente, que, por un lado, un mínimo de individuos someterse a la terapia de inducción de la que no se beneficiarán de manera positiva y que retrasará opciones terapéuticas alternativas y, por otro lado, la terapia no se ocultaría a individuos que podrían beneficiarse. Sin embargo, la firma informó aquí es apropiado ni para la clasificación ni el diagnóstico de la CECC o para la predicción de las metástasis, el pronóstico o la supervivencia y tiene pocos o ningún genes en común con los estudios de CECC tener estos objetivos.
Importancia funcional de los genes en la firma
no fue posible, ni tampoco era el objetivo de este estudio, para determinar si un gen en el clasificador es causal o simplemente un marcador para la falta de respuesta. La mayoría de los genes en el clasificador (8/10) se sobreexpresa en los tumores de NR. Tres de los genes regulados en NR (TCP1alpha, TXNDC9 y DNAJA1) codifican para las proteínas que participan en el plegamiento de proteínas y montaje celular y organización. TCP1alpha /CCT1 es parte del complejo de chaperonina anillo TCP1 [27], [28]. En varios tipos de cáncer, los miembros de la familia de proteínas TCP1 se sobreexpresa [29] y la quimio-resistencia se ha relacionado con una mayor expresión de la proteína chaperona [30] lo que sugiere que los tumores de rápido crecimiento necesitan una mayor maquinaria para el correcto plegamiento de las proteínas [31]. TXNDC9, también llamado APACD (proteína de unión a ATP asociado con la diferenciación de células), se ha informado a disminuir la actividad de ATPasa complejo TCP1 chaperonina y, por tanto, un impacto negativo en el plegamiento de proteínas [32]. Por otra parte, el gen está regulado en el ovario resistente al oxaliplatino y líneas celulares de carcinoma de cabeza y cuello [33], de acuerdo con nuestros hallazgos. DNAJA1 (HSP40), con HSP70 y co-chaperones, constituye un sistema de mantenimiento Proteostasis. El aumento de expresión de las HSP se encuentra en malignidad y HSP70, con el que asociados DNAJA1, pueden estar implicados en la resistencia a la quimioterapia [34].
Otros dos genes regulados de código (Dll1 y ODZ2) para proteínas que están implicadas en diversos procesos de señalización. DLL1 (Delta-como 1) es un ligando de receptor Notch [35]. Recientemente, las mutaciones en Notch1,2,3 se han descrito en los cánceres de cabeza y cuello [36] y las alteraciones en la expresión de DLL1 se han descrito en varios tumores, incluyendo el carcinoma de células escamosas oral de [37] y el cáncer de vejiga urinaria [38].
por último, los productos proteicos de otros tres genes regulados (morf4l1, SSB y ZNF462) participan en la unión de ácidos nucleicos y de control de la transcripción. Morf4l1 (factor de mortalidad 4) es un miembro de la familia MRG (genes relacionados con Morf) que es importante para el control de la transcripción, reparación de daños en el ADN, la proliferación y el envejecimiento celular. MORF4 es una proteína similar al factor de transcripción que induce la senescencia en células inmortalizadas [39]. MORF4 está regulado en alto grado de inestabilidad de microsatélites carcinoma colorrectal [40].