Extracto

Algunos medicamentos quimioterapéuticos potentes que incluyen agentes de unión a tubulina se habían desarrollado a partir de plantas de la naturaleza, como la podofilotoxina y paclitaxel. Sin embargo, poca selectividad citotóxica, efectos secundarios graves, y la eficacia limitada siguen siendo las principales preocupaciones en su aplicación terapéutica. Hemos desarrollado un derivado de la podofilotoxina totalmente sintético llamado Ching001 y se investigaron sus efectos sobre el crecimiento antitumorales y mecanismos en modelos preclínicos de cáncer de pulmón. Ching001 mostró una citotoxicidad selectiva a diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón, pero no a las células pulmonares normales. Ching001 inhibe la polimerización de microtúbulos que resulta en detención mitótica, como es evidente por la acumulación de proteínas relacionadas con la mitosis, survivin y Aurora B, lo que conduce a daños en el ADN y la apoptosis. Ching001 también activó pro-apoptótica ER vía de señalización de estrés. La inyección intraperitoneal de 2 mg /kg Ching001 inhibió significativamente el crecimiento del tumor de xenoinjerto A549, mientras que la inyección de 0,2 mg /kg Ching001 disminuyó la capacidad de colonización de pulmón de células A549 en un ensayo de metástasis experimental. Estos efectos de inhibición del crecimiento anti-tumor y colonización de pulmón eran más fuertes que los de tratamiento con paclitaxel en la misma dosis. Las manchas de tejido tumoral de xenoinjerto confirmaron además que Ching001 induce la detención de la mitosis y la apoptosis tumoral. Además, las pruebas de hematología y bioquímica de muestras de sangre, así como los exámenes de tejidos indicaron que el tratamiento Ching001 no mostró toxicidad de órganos aparentes en los animales ensayados. Proporcionamos evidencia preclínica que nuevo inhibidor de microtúbulos sintética Ching001, lo que puede provocar daños en el ADN y la apoptosis mediante la inducción de detención de la mitosis y el estrés ER, es un compuesto anticancerígeno potencial para un mayor desarrollo de drogas

Visto:. Chen JY, Tang YA, Li WS, Chiou YC, Shieh JM, Wang YC (2013) Un derivado de la podofilotoxina sintético ejerce contra el cáncer mediante la inducción de efectos mitótico Detención y Pro-apoptótica estrés ER en modelos preclínicos de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (4): e62082. doi: 10.1371 /journal.pone.0062082

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América

Recibido: 31 de diciembre de 2012; Aceptado: March 17, 2013; Publicado: 30 de abril 2013

Derechos de Autor © 2013 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones CMNCKU10107 del Centro Médico Chi Mei, Taiwán (JMS) y NSC 101 hasta 2325-B-006-008 del Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (JOC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Algunos medicamentos quimioterapéuticos potentes habían sido derivados de plantas de la naturaleza. Por ejemplo, podofilotoxina, un componente activo purificado a partir de
Podophyllum peltatum
[1] - [3], se utiliza como un tratamiento estándar para las verrugas venéreas [4]. La podofilotoxina inhibe la polimerización de microtúbulos que lleva al fracaso mitosis y detención del ciclo celular [5] - [7]. derivados semisintéticos de podofilotoxina, por ejemplo etopósido y tenipósido, actualmente se utilizan fármacos contra el cáncer de la leucemia, el linfoma, el glioblastoma, pulmón y cánceres testiculares [8]. Muchos otros fármacos contra el cáncer derivados de hierbas naturales también poseen la capacidad de inhibir la dinámica de microtúbulos [2], [9]. Por ejemplo, taxol (paclitaxel o) y compuestos alcaloides de la vinca son productos naturales purificados a partir de
Taxus brevifolia
o
Catharanthus roseus
, respectivamente. Estudios previos revelaron que los compuestos de alcaloides de la vinca y de paclitaxel pueden interrumpir la dinámica de microtúbulos [9] - [13]

Aunque muchos agentes de unión a tubulina se habían desarrollado, fuerte citotoxicidad hacia las células normales, depresión de la médula ósea y mayor riesgo de. secundaria leucemia mielógena aguda limitan su eficacia clínica [1], [14] - [16]. Así, el desarrollo de nuevos agentes con mejor selectividad citotóxica y efectos secundarios limitados es importante para el tratamiento anti-cáncer. Hemos desarrollado un novedoso derivado de la podofilotoxina totalmente sintético con alta pureza y buen rendimiento llamado Ching001, y encontramos que Ching001 mostró una fuerte citotoxicidad específicamente en líneas celulares de cáncer de pulmón, pero no en las células pulmonares normales. Ching001 inhibe la polimerización de microtúbulos y detuvo ciclo celular en la mitosis. Ching001 induce apoptosis a través de la inducción de daño en el ADN y la activación de la señalización de estrés ER. Ching001 mostró inhibición del crecimiento tumoral y prevenir la colonización tumor sin aparentes efectos secundarios en modelos de xenoinjerto, lo que sugiere que podría ser probado más como un reactivo anti-tumor novela.

Resultados

Ching001 Muestra citotoxicidad selectiva hacia el cáncer, pero no las células normales del pulmón

Ching001 es un compuesto totalmente sintético y su estructura se muestra en la Fig. 1A. Se ensayó la citotoxicidad de Ching001 en diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón y MRC5 línea celular de pulmón normal. La IC50 calculado por análisis de regresión de diversas líneas celulares fueron: CL1-0, 1,99 M; CL1-5, 1,90 M; A549, 1,21 M; H1299, 2,58 M; y MRC5, 8,27 M para el tratamiento Ching001 a las 48 h (Fig. 1B). Ching001 mostró una citotoxicidad selectiva de las células de cáncer de pulmón, pero no a las células MRC5 pulmonares humanos normales.

(A) La estructura del compuesto Ching001. (B) ensayo de citotoxicidad de MRC5 pulmonar normal y varias células de cáncer de pulmón se controló mediante tinción con azul de tripano. Las células se trataron con diferentes concentraciones de Ching001 durante 48 h. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las células MRC5 normales y células cancerosas. ***
P Hotel & lt; 0,001. (C) La citometría de flujo análisis de la distribución del ciclo celular de las líneas celulares de cáncer de pulmón tratados con dosis variables de Ching001 y para diferentes duraciones. (D) La inmunofluorescencia para α-tubulina (verde) y tinción nuclear DAPI (azul) después de 1 tratamiento mu M Ching001 de 2 a 8 h en las líneas celulares de cáncer de pulmón en fase S sincronizada. DMSO se usó como disolvente de control. Las barras de escala: 10 micras

Ching001 inhibe la polimerización de microtúbulos y retrasa la progresión de la fase M.

Desde podofilotoxina es conocido para apuntar a los microtúbulos, su análogo estructural Ching001 también se pueden orientar a los microtúbulos.. ensayo de ensamblaje de los microtúbulos mostró que el tratamiento 1 M Ching001 disminuyó la forma polimerizado insoluble de microtúbulos dentro de 6 horas (Fig. S1 A). La inmunofluorescencia de α-tubulina mostró alteraciones significativas de la organización de los microtúbulos en comparación con DMSO disolvente de control tanto en las células de cáncer de pulmón CL1-5 (Fig. S1B) y A549. Estos resultados sugieren que los microtúbulos es el objetivo potencial de Ching001.

A continuación, se examinó el efecto de Ching001 en la progresión del ciclo celular. De flujo análisis de citometría indicó que la población de fase M G2 /de las células de cáncer de pulmón tratados, incluyendo H1299, A549, CL1-0, y CL1-5, el aumento dependiente de la dosis con 0,5 a 1 mM tratamiento Ching001 durante 6 h. El /la población G2 del ciclo celular M aumentó aún más drásticamente, acompañado por la aparición de la fracción sub-G1 en el tratamiento Ching001 prolongada durante 12 h (Fig. 1C). La citometría de flujo ensayo de análisis y de la proliferación de células de cáncer de pulmón en fase S sincronizada también confirmó que el tratamiento Ching001 detenido la progresión del ciclo celular en G2 /M-fase, por tanto, inhibe la proliferación (Fig. S2).

Para diseccionar adicionalmente el efecto de Ching001 durante G2 /M detención, inmunofluorescencia para los microtúbulos se llevó a cabo en células de cáncer de pulmón en fase S sincronizado tratados por Ching001 (Fig. 1D). Las células tratadas con DMSO comenzaron a entrar pro-metafase después de 2 horas y progresaron a la anafase a las 4 h después de la liberación de la fase S. Las células procedieron a telofase a las 6 horas y alcanzaron la citocinesis tarde para completar la mitosis a las 8 h. Sin embargo, las células tratadas con Ching001 entraron en la fase M a las 2 h, y se mantuvieron en la metafase, incluso a las 8 h (Fig. 1D).

Para proporcionar evidencia molecular de detención de la fase M, se realizó un análisis de transferencia de Western de la llave proteínas que regulan la mitosis celular incluyendo la aurora B, survivina y fosforilados proteínas monoclonales mitótico 2 epítopos (p-MPM2) [17] - [19]. Los resultados mostraron que Aurora B, survivin y p-MPM2 mantuvo alta después del tratamiento Ching001 comparación con el control de DMSO, lo que indica detención de la fase M (Fig. 2A). Además, la tinción inmunocitoquímica mostró que alrededor del 15% de las células tratadas con DMSO estaban en la fase M por su expresión de tanto aurora B y survivina, mientras que el tratamiento Ching001 aumentó significativamente la población de células en fase M que co-expresó aurora B y survivina (Fig. 2B). En conjunto, estos resultados demostraron que Ching001 detiene la progresión del ciclo celular en la fase M. Analiza

(A) de transferencia Western de proteínas relacionadas con la mitosis después de 1 tratamiento mu M Ching001 para los tiempos indicados en líneas celulares de cáncer de pulmón. (B) La desregulación del ciclo celular en fase M inducida por Ching001. líneas celulares de cáncer de pulmón se analizaron con survivina (verde), la aurora B (rojo), y DAPI (azul) después de 1 tratamiento Ching001 M durante 24 h. DMSO se usó como disolvente de control. Las barras de escala: 30 micras

inducida por Ching001 detención de la mitosis conduce al daño del ADN y la apoptosis de las células cancerosas de pulmón

Se ha informado de que los errores en la mitosis generan daños y la fragmentación de la. DNA [20]. Nuestro análisis de transferencia Western mostró el aumento de marcador de daño de ADN γ-H2AX en células de cáncer después del tratamiento Ching001 (Fig. 3A), que se confirmó por inmunofluorescencia para γ-H2AX (Fig. S3). Para examinar adicionalmente si el daño del ADN inducido por el tratamiento Ching001 eventualmente resulta en apoptosis, PS translocación se detectó por inmunofluorescencia después del tratamiento Ching001 (Fig. 3B). Además, el ensayo de escalera de ADN de apoptosis inducida se realizó (Fig. 3C). Un fuerte translocación PS a las 24 h y la inducción de escaleras de ADN de apoptosis a las 48 h en H1299 tratadas con Ching001, A549, las células CL1-0 y CL1-5 sugieren que el daño del ADN inducido por errores de la mitosis durante el tratamiento Ching001 eventualmente resulta en apoptosis.

análisis (a) Western blot para el marcador del daño en el ADN γ-H2AX después del tratamiento 1 M Ching001 en los tiempos indicados. (B) La inmunofluorescencia para principios-apoptótica translocación marcador PS después del tratamiento Ching001 durante 24 h. Barras de escala: 30 m. (C) La fragmentación del ADN-apoptótica específica se detectó mediante análisis de ADN escalera después del tratamiento Ching001 durante 48 h.

Ching001 induce la apoptosis Pro-ER estrés vía de señalización

En particular, la actividad de estrés ER inducida se aumentó la caspasa-4 de una manera dependiente del tiempo en H1299 y líneas celulares de cáncer de pulmón A549 después del tratamiento Ching001 (Fig. 4A). Para investigar los mecanismos de tratamiento Ching001 en pro-apoptótica inducción de estrés ER, western blot de las proteínas que regulan la apoptosis, incluyendo ER señalización se llevaron a cabo las vías de estrés. La activación de estrés ER fue evidente por el aumento de la expresión de p-PREK, p-eIF2α, p-JNK, GADD153 y la caspasa-4 después del tratamiento Ching001 (Fig. 4B). Además, el tratamiento Ching001 disminuyó la expresión de factor anti-apoptótica de Bcl-2 y el aumento de la expresión del factor pro-apoptótica Bax, lo que lleva a la apoptosis a través de la escisión de la apoptosis verdugo caspasa-3 (Fig. 4A). Estos resultados indicaron que Ching001 indujo apoptosis, al menos en parte, a través de la vía de señalización de estrés ER
.
(A) La actividad de la caspasa-4 aumentó en función del tiempo después de 1 tratamiento mu M Ching001 tanto en células A549 y cáncer de pulmón H1299 líneas en los tiempos indicados. **:
P Hotel & lt; 0,01, ***:
P Hotel & lt; 0,001. (B) Western blot análisis de estrés de RE relacionados con las proteínas de señalización (manchas por encima de la línea de puntos) y la apoptosis relacionados con las proteínas de señalización (manchas debajo de la línea de puntos) después del tratamiento Ching001 en los tiempos indicados.

Exposiciones Ching001
In

in vivo
xenoinjerto de inhibición del crecimiento por mitosis y apoptosis de detención sin inducción de la apoptosis en el tejido circundante del xenoinjerto

ensayo de xenoinjertos de tumores se realizó para probar la capacidad de inhibición del crecimiento tumoral Ching001
en

in vivo
. La inyección intraperitoneal de 0,4 mg /kg Ching001 por cinco veces durante el curso inicial del tratamiento mostró que el efecto de inhibición de crecimiento del tumor, que era similar a 4 mg /kg de tratamiento con paclitaxel, un conocido inhibidor de microtúbulos (Fig. 5A, panel izquierdo). La tasa de crecimiento del tumor se inhibió aún más por tratamiento con 2 mg /kg Ching001. No hay pérdida significativa del peso corporal en los animales tratados en comparación con el grupo control se encontró (Fig. 5A, panel derecho).

(A) ratones ICR-desnudos portadores de los tumores A549 establecidos (~ 50 mm
3) fueron tratados con Ching001 (0,4 mg /kg o 2 mg /kg) mediante inyección intraperitoneal en day1, Día 3, Día 5, day7, y day9 (como se indica por puntas de flecha). Un inhibidor de microtúbulos conocido, paclitaxel (4 mg /kg), se utilizó para la comparación. Los volúmenes tumorales (izquierda) y el peso corporal (derecha) se midieron en días alternos hasta day35. Puntos, significan; bares, ± SEM. *:
P Hotel & lt; 0,05, **:
P Hotel & lt; 0,01, ***:
P Hotel & lt; 0,001. (B) La caspasa-3 activada IHC tinción del tejido tumoral de los ratones desnudos ICR-tomadas de grupo de control de disolvente y el tratamiento Ching001 (2 mg /kg) de grupo. Aumento original x 200. (C) La inmunofluorescencia tejido de survivina (verde), aurora B (rojo), y DAPI (azul) de xenoinjerto de tumor de los ratones de control con disolvente y Ching001 ratones tratados (2 mg /kg). Las flechas indican las células mitóticas en el tumor de control de disolvente. La figura ampliada representa cromosomas aberrantes después del tratamiento Ching001. Las barras de escala:. 30 micras

Para investigar si Ching001 la apoptosis inducida por tumor
en

in vivo
, se realizó inmunohistoquímica (IHC) tinción de la caspasa-3 activada. Hemos encontrado un aumento de la expresión de la caspasa-3 activada en xenoinjertos de tumor del grupo tratado Ching001 comparación con el grupo tratado con solvente (Fig. 5B). Además, el Ching001 tratado las células tumorales parecían haber redujo en el núcleo y se burbujeó en la apariencia, que representa la muerte celular apoptótica en nódulo xenoinjerto (Fig. S4A), mientras que ni fenotipo histológico o apoptótico se observó en el tejido sano circundante de xenoinjerto (Fig. S4B ). Para investigar si Ching001 detención de la mitosis inducida por
en

in vivo
, se realizó inmunofluorescencia el tejido de survivina y Aurora B. Los resultados demostraron un aumento de la población de células que co-expresa survivina y Aurora B en Ching001 tratado tejido tumoral en comparación con el tejido tratado con disolvente (Fig. 5C). Es importante destacar que se observó configuración cromosoma aberrante en Ching001 xenoinjerto (recuadro ampliado en la Fig. 5C) a tratar. Estos
en

in vivo
resultados corroboran con
en

Los datos in vitro Windows que Ching001 induce la detención de la mitosis, daño en los cromosomas, y la apoptosis.

Ching001 inhibe el cáncer de colonización Capacidad
en

in vivo
sin afectar normal función vital

Para verificar la
en

in vivo
inhibición de la colonización potencial de Ching001, se realizaron estudios en animales metástasis experimentales. células de cáncer de pulmón A549 se inyectaron intravenosamente en la cola de la vena de los ratones. Los ratones recibieron 0,2 mg /kg Ching001, un décimo de la dosis utilizada para estudios en animales de crecimiento anti-tumorales, intraperitonealmente cada dos días desde el día 1 al día 35. DMSO sirvió como control de disolvente y 0,2 mg /kg de paclitaxel se incluyó como una control positivo. Además, también se realizaron las células A549 tratadas previamente con 1 M Ching001 antes de la inyección de cola vena. Hematoxilina y eosina (H & amp; E) manchas mostraron significativamente menos nódulos tumorales en los pulmones de los ratones tratados por vía intraperitoneal con Ching001 o paclitaxel en comparación con el control de disolvente DMSO. nódulos tumorales se rara vez se encuentran en los tejidos pulmonares de los ratones inyectados por vía intravenosa con células de cáncer Ching001 pre-tratados (Fig. 6A, panel izquierdo). El número medio de nódulo tumoral en los pulmones fue de 88, 29, 18 y 2 en DMSO, 0,2 mg /tratamiento kg paclitaxel, 0,2 mg de tratamiento /kg Ching001, y los grupos de tratamiento previo Ching001, respectivamente (Fig. 6A, el panel superior derecho ). No hubo pérdida significativa del peso corporal en todos los animales tratados (Fig. 6A, panel inferior derecho). Todos los análisis de bioquímica de muestras de sangre de los animales analizados no mostró efectos adversos aparentes sobre las funciones hepática y renal en comparación con el disolvente de control (Fig. 6B). Además, el H & amp; E tinción no mostraron trastorno importante del órgano en corazón, riñón, hígado y pulmón disecados de ratones tratados con Ching001 (Fig S5.). Los datos sugieren que el tratamiento Ching001
en

in vitro
o
en

in vivo
inhibir la colonización de pulmón. células A549 En particular, el tratamiento continuo de Ching001 de 35 días no mostró toxicidad detectable de los animales tratados
.
(A) (1 × 10
6) fueron vena de la cola se inyecta en los ratones BALB /c. Los ratones recibieron 0,2 mg /kg Ching001 o 0,2 mg /kg por vía intraperitoneal paclitaxel cada dos días durante cinco semanas como se indica por puntas de flecha en el panel inferior derecho. También se realizaron las células pretratadas con 1 M Ching001 antes de la inyección en vena de cola. DMSO se usó como disolvente de control. El H & amp; E-tinción del tejido pulmonar (izquierda), la cuantificación de los nódulos tumorales en los pulmones (parte superior derecha), y el peso corporal (inferior derecha) de los ratones inyectados A549 se muestran. Las flechas rojas indican los sitios de nódulos tumorales en el tejido pulmonar. Aumento original x 100. *:
P Hotel & lt; 0,05. (B) Las pruebas de hematología y bioquímica de la sangre de los ratones ensayados. En las pruebas de hematología, WBC, RBC y plaquetas fueron probados. En las pruebas de bioquímica, GOT, GPT, albúmina y bilirrubina total, se utilizan como indicadores de la función hepática; BUN y creatinina como indicadores de la función renal. Los datos indicaron que el tratamiento Ching001 causó ningún cambio aparente en las funciones hepáticas y renales en comparación con los animales tratados con DMSO.

Discusión

Para desarrollar fármacos contra el cáncer con una mejor eficacia y lateral limitada -efectos, hemos diseñado un compuesto totalmente sintético Ching001 y examinamos sus actividades antitumorales
en

in vitro
y
en

in vivo
en el modelo de cáncer de pulmón . Ching001 mostró citotoxicidad específica contra varias líneas celulares de cáncer de pulmón humano a dosis en el rango de sub-micromolar sin aparente citotoxicidad contra la línea de células de pulmón humano normal. Los estudios en animales mostraron que Ching001 inhibió el crecimiento del tumor y la colonización
en

in vivo
sin efectos secundarios significativos en ratones ensayados. El papel molecular de Ching001 en la inhibición del crecimiento del tumor está mediada, al menos en parte, por los microtúbulos de-polimerización que conduce a la detención de la mitosis y el daño del ADN. Estos hechos, junto con la inducción de estrés ER, condujo finalmente a la apoptosis de las células de cáncer de pulmón
en

in vitro
y
en

in vivo gratis (Fig. 7 ).

rápida progresión del ciclo celular es una de las características de la célula de cáncer proliferado. La inhibición de la polimerización de microtúbulos por Ching001 detiene la progresión del ciclo celular en fase M y conduce a daños en el ADN. Además, el tratamiento Ching001 desencadena la activación de ER vía de señalización a través de la activación de PERK y la caspasa-4 cascada de señalización de estrés. detención de la fase M prolongada y estrés ER activado señalización posteriormente inducir la apoptosis en las células cancerosas tratadas con Ching001.

Nuestro análisis de Western blot detectó una expresión sostenida de p-MPM2 que representa la entrada del ciclo celular en fase M [18], [19], lo que indica que las células tratadas Ching001 salieron de G2 y precedidos de la fase M. Además, la aurora B y survivina controlar la disposición y la separación de los cromosomas durante la mitosis. La degradación de aurora B y survivina en M-fase facilita el final de la mitosis [17]. Se observó un aumento de la co-expresión de aurora B y survivina en ambas muestras celulares y animales, lo que sugiere que Ching001 inhibe la salida de M-fase. Nuestra inmunofluorescencia α-tubulina de células sincronizadas en fase S demostró una detención del ciclo celular en la metafase. En conjunto, nuestros resultados apoyan la hipótesis de que Ching001 detiene el ciclo celular en la fase M que puede ser debido a la inhibición de la polimerización de microtúbulos y la interrupción de la organización de los microtúbulos del huso. Prolongar detención de la fase M en los resultados de las células en la insuficiencia de la segregación cromosómica y la posterior muerte de la mitosis [21]. Nuestros resultados actuales celulares y animales proporcionan evidencia de que el tratamiento Ching001 induce detención de la fase M seguido de daño en el ADN y la muerte celular apoptótica.

Insuficiencia de la migración nuclear y la división podría interrumpir la homeostasis de la ER [22]. sensores ER transmembrana conocidas como PERK y IRE1α serán entonces activadas por fosforilación que posteriormente activa la caspasa-4 [23]. Ching001 tratamiento aumentó la expresión de marcadores de estrés ER y marcadores de apoptosis en 6-12 h. Estos resultados sugieren que inducida por Ching001 apoptosis de células de cáncer puede ser causado de forma concomitante a través de la inducción de defectos mitosis y la activación de estrés ER en puntos de tiempo tempranos. Además, no se observaron activación aparente de proteína de señalización intrínseca apoptosis caspasa-9 y la proteína caspasa-8 extrínseca de señalización de apoptosis después del tratamiento Ching001 (datos no mostrados), lo que sugiere que Ching001 la apoptosis inducida por células de cáncer es a través de estrés ER. La atenuación de la apoptosis mediada por ER inducida por Ching001 en sensores ER derribados células es digno de mayor investigación

La podofilotoxina es el análogo de producto natural de Ching001 [5] - [7].. compuestos derivados de podofilotoxina utilizados en el tratamiento del cáncer clínico a menudo muestran una resistencia debido a la expresión aberrante y la mutación de isotipos específicos beta-tubulina durante el curso del tratamiento [24]. Además, la resistencia paclitaxel también se ha informado que se correlaciona con una mayor expresión de las glicoproteínas P [25], [26]. Vale la pena mencionar que el tratamiento Ching001 mostró un efecto citotóxico similar en diversas células de cáncer de pulmón que expresan diferentes niveles de glicoproteínas P (Fig. 1B y Fig. S6). Además, el tratamiento Ching001 mostró una fuerte actividad citotóxica hacia una línea celular de cáncer epidérmico humano resistente a etopósido (Fig. S7). Ya sea Ching001 es un compuesto potente para el tratamiento de taxanes- o etopósido resistente células merece estudios adicionales.

En conclusión, Ching001 exhibe crecimiento anti-tumor y eficacia de inhibición de la colonización sin efectos adversos en nuestros ensayos preclínicos. Estos resultados ponen de manifiesto el potencial terapéutico de Ching001 en el tratamiento del cáncer. Sintético compuesto Ching001 de alta pureza y rendimiento con cáncer de células citotoxicidad específica es un candidato potencial para ser probado como un compuesto farmacéutico para el tratamiento del cáncer de plomo.

Materiales y Métodos

Ética Declaración

Todos los animales se obtuvieron del Centro Nacional de animales de Laboratorio (República de China, Taiwán) con la aprobación del Institutional Animal Care y el empleo Comisión (IACUC), Universidad Nacional Cheng Kung (IACUC aprobación Nº 98099) y se mantuvieron en patógenos condiciones libres. La aprobación del estudio por el comité de revisión ética institución bordo y fue confirmada por la Universidad Nacional Cheng Kung.

Línea celular, cultivo celular, y la sincronización

MRC5 humano normal de las células epiteliales de pulmón y de pulmón humano de células de adenocarcinoma líneas CL1-0, y CL1-5 se obtuvieron del Dr. PC Yang (Departamento de Medicina Interna, Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán) [27]. Los no pequeñas de pulmón de células líneas celulares de cáncer H1299 y A549 humanos se obtuvieron de la American Type Cell Cultura. Las líneas celulares de cáncer epidérmico humano KB y células KB-7D fueron proporcionados por el Dr. Jang-Yang Chang, del Instituto Nacional de Investigación en Salud, Tainan, Taiwán. línea celular KB fue comprado original a partir de la American Type Cell Cultura y KB-7D es una línea celular resistente a etopósido-derivado de la línea celular KB [28]. Todas las células se cultivaron en DMEM (Gibco, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) con 10% de FBS (Gibco) y 1% de penicilina /estreptomicina (Gibco) y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2 atmósfera humidificada. Para sincronizar las células en la fase S, las células se trataron con 2 mg /ml afidicolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 24 h y se liberan en el ciclo celular antes del tratamiento Ching001.

compuestos utilizados

el derivado de la podofilotoxina, Ching001, fue preparado por el co-autor W.-S. Li. Solicitud para el compuesto será enviada a [email protected].

Ensayo de citotoxicidad

Las células (3 × 10
4) se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos y diferente concentración de Ching001 (0,5, 1, 3, 5 M) se añadieron a cada pocillo durante 48 h. El número de células y la viabilidad se determinaron mediante tinción con azul de tripano y el recuento de células.

microtúbulos Asamblea Ensayo

ensayo de ensamblaje de los microtúbulos se realizó de acuerdo con el estudio anterior [29]. Las células (1 × 10
6) fueron sembradas en placas de cultivo de 100 mm y se trató con 1 M Ching001 o control de DMSO durante 6 a 48 h. La fracción sobrenadante de lisados ​​de células totales se recogieron como dímeros delta gamma-tubulina solubles y se cuantificó por el ensayo de Bradford. El sedimento se recogió en forma de proteína insoluble que contiene los microtúbulos polimerizados, que se llevó a ebullición con tampón de muestra de proteína para disolver las proteínas. Alrededor del 50 g de lisados ​​de proteínas solubles se utilizaron como control de carga, y un volumen igual de lisados ​​de proteínas insolubles se utilizaron para la α-tubulina inmunotransferencia. Todos los anticuerpos y sus condiciones de reacción utilizados se enumeran en la Tabla S1.

Citometría de Flujo

CL1-0, CL1-5, A549 y H1299 células (1 × 10
6) eran recogidos después de 6 a 12 h de tratamiento con 0,5 M o 1 M Ching001, se lavó dos veces con solución salina equilibrada de Hank (Sigma-Aldrich) y -20
oC etanol fijación durante la noche. Las células se incubaron con intercalador de ADN yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) en 37
oC durante 1 h con 1 mg /ml de RNasa A y 0,1% de Triton-X100. Alrededor de 3 × 10
4 células fueron detectados utilizando citómetro de instrumento (BD Biosciences, San Jose, CA) para analizar la distribución del ciclo celular.

inmunocitoquímica tinción

Las células (1 × 10
4) se sembraron en portaobjetos de cámara y se trataron con Ching001 o DMSO de control para 48 h. Las células tratadas se hibridó con anticuerpo α-tubulina y DAPI después de la fijación. Los anticuerpos de la survivina y la aurora B se utilizaron para la tinción celular mitótico. El anticuerpo anti-PS se utilizó para la detección de la etapa temprana de la apoptosis. Las células fueron fotografiados en un microscopio confocal Olympus FV1000. Los procedimientos detallados y los anticuerpos se describen en la Tabla S1.

Western blot

Las muestras que contienen cantidades iguales de proteínas (50 g) se separaron en un SDS-PAGE al 10% y electrotransferencia a Immobilon-P membranas (Millipore). Western blot se realizó para medir el nivel de expresión de la proteína. Los procedimientos detallados y los anticuerpos se describen en la Tabla S1.

Escalera de ADN Ensayo

Las células (1 × 10
6) fueron tratados con el control de DMSO o 3 a 5 M Ching001 de 24 a 48 h, se extrajo el ADN utilizando tampón de extracción de ADN (tampón de fosfato-citrato 0,2 M, pH 7,8; ​​37
oC, 1 h de reacción), seguido por la RNasa A y proteinasa K tratamiento. electroforesis en gel de agarosa se utilizó para la escalera de ADN de análisis.

caspasa-4 Ensayo de actividad

caspasa-4 ensayo de actividad se llevó a cabo por la caspasa-4 actividad kit de ensayo (GeneTex, Irvine, CA). En resumen, sobre 200 g de lisados ​​de células totales con el control DMSO o el tratamiento Ching001 durante 6 a 48 h se utilizaron para el ensayo. La actividad de la caspasa-4 se determinó mediante la escisión del sustrato LEVD-AFC y detectado por el lector de ELISA (Ex /Em: 400/505).

cuantitativa de la transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR)

La expresión de mRNA de los genes de la familia p-glicoproteína
ABCB1
y
ABCG2
fueron detectados por QRT-PCR en ambas líneas celulares normales y cáncer de pulmón. ARN total fue extraído de diferentes líneas de células de pulmón humano utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Acerca de 4 g de ARN fueron transcrito de forma inversa en cDNA utilizando superíndices transcriptasa inversa (Invitrogen) a revertir. RT-PCR cuantitativa se realizó para detectar el nivel de expresión de mRNA de los genes diana utilizando el Sistema StepOnePlus ™ Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) con
GAPDH
como control interno. Los cebadores para la
¿Cuáles son ABCB1: sentido 5'-AAATTGGCTTGACAAGTTGTATATGG-3 ', 5'-antisentido CACCAGCATCATGAGAGGAAGTC-3';
ABCG2
: sentido 5'-TCATCAGCCTCGATATTCCATCT-3 ', 5'-antisentido GGCCCGTGGAACATAAGTCTT-3';
GAPDH
: sentido 5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ', 5'-antisentido TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'. Las muestras de ADNc se amplificaron utilizando el verde SYBR (Applied Biosystems) y la condición de ciclo térmico compuesto de 95 ° C durante 10 min seguido de 45 ciclos a 95 ° C para 3 seg y 60 ° C durante 30 seg. ciclo umbral (Ct), se determinó el número fraccional de ciclos en el que la cantidad de diana amplificada alcanza un umbral fijo. Los coeficientes normalizados de genes diana se calcularon utilizando? Ct [? Ct = Ct
gen -target - Ct
-GAPDH]. Los datos se presentan como diferencias de veces en relación con IMR90 expresión normal genes de células de pulmón en base a cálculos de 2
-ΔΔCt. (ΔΔCt = Ct
línea celular -lung - Ct
-IMR90)

MTT Análisis de citotoxicidad

diferentes concentraciones de Ching001 se añadieron en cada placa y se incubaron durante 48 h. viabilidades celulares bajo diferentes concentraciones de tratamiento con compuesto se determinaron por 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT, Sigma, St. Louis, MO) de ensayo. En los controles no tratados, se utilizó 0,1% medio que contiene DMSO.


En vivo
la formación de tumores de xenoinjerto Ensayo

ICR-Foxn1 ratones desnudos (de 5 semanas de edad) fueron adquirida desde el Centro Nacional de Animales de Laboratorio con la aprobación del Institutional Animal Care y el empleo Comisión (IACUC), Universidad Nacional Cheng Kung (IACUC aprobación Nº 98099), y se crió en un ambiente libre de patógenos específicos. Las células A549 (5 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea como xenoinjerto en ratones y se dejan crecer hasta 50 mm
3 nódulo tumoral dentro de 2 semanas. Los ratones fueron luego inyectados con vía intraperitoneal 0,4 mg /kg, o /kg Ching001, o 4 mg /kg de paclitaxel como control positivo 2 mg, o de control de disolvente (etanol: Cremophore: ddH
2O = 02:01:07) al día 1, 3, 5, 7, 9. el volumen del xenoinjerto y el peso de los ratones se midieron y cuantificaron durante 35 días de tratamiento con fármacos. El volumen de xenoinjertos se calculó como (longitud x anchura cuadrado) /2 en mm
3. Los principales órganos, incluyendo el corazón, pulmón, hígado, riñón y nódulos de xenoinjertos fueron disecados y se tiñeron con H & amp;. E para la confirmación adicional


En vivo
metástasis experimentales Ensayo

La los ratones BALB /c fueron adquiridos y criados después de obtener el permiso junta de revisión institucional apropiado como se ha descrito anteriormente. A549 (1 × 10
6) células se inyectaron por vía intravenosa en la cola de la vena de los ratones BALB /c, que luego se les administró por vía intraperitoneal de control de DMSO, 0,2 mg /kg Ching001 o 0,2 mg /kg de paclitaxel cada dos días durante cinco semanas .