Extracto
Con el fin de fomentar la identificación sistemática de nuevos genes con papeles funcionales importantes en el cáncer de páncreas, tenemos ideado una estrategia de cribado de múltiples etapas de proporcionar una base racional para la selección de nuevos genes candidatos muy relevantes en base a los resultados de los análisis de alto contenido funcional. El flujo de trabajo compuesto por tres etapas consecutivas: 1) la expresión génica serie de perfiles de análisis de tejidos pancreáticos humanos primarios, así como una serie de
in vivo
y
in vitro y modelos de características tumorales relevantes con el fin para identificar genes con patrones de expresión conspicuos; 2) el uso de la tecnología «inversa matriz transfección 'a gran escala parallelized análisis funcional de genes candidatos potenciales en ensayos basados en células; y 3) la selección de genes candidatos individuales para un examen más a fondo de sus funciones celulares. Un total de 14 genes, entre ellos 8 de familias de genes "druggable", fueron clasificados como candidatos de alta prioridad para la caracterización funcional individual. A modo de ejemplo para demostrar la validez del método, se presentan los datos funcionales completos sobre genes candidatos ADRBK1 /GRK2, que no ha sido previamente implicado en el cáncer de páncreas, España
Visto:. Buchholz M, Honstein T, S Kirchhoff , Kreider R, Schmidt H, Sipos B, et al. (2015) Un enfoque de detección de múltiple de alto contenido para identificar nuevos genes diana funcionalmente relevante en el cáncer pancreático. PLoS ONE 10 (4): e0122946. doi: 10.1371 /journal.pone.0122946
Editor Académico: Chunhong Yan, Universidad Regentes de Georgia, Estados Unidos |
Recibido: 23 de julio de 2014; Aceptado 30 de diciembre de 2014; Publicado: 7 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Buchholz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Los datos han sido depositado en la base de datos ArrayExpress en el Centro Europeo de Bioinformática (EBI). Los datos se pueden consultar en la base de datos ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress) bajo los siguientes números de acceso: Conjunto de datos en el modelo de metástasis Suit2: E-MTAB-3344; conjunto de datos sobre las células SPC treatmentof PaTuII: E-MTAB-3363; Los datos que figuran en los tejidos pancreáticos humanos primarios: E-MTAB-3365; Los datos que figuran en los Patu-8988s y -t modelo de diferenciación: E-MTAB-3366; Conjunto de datos sobre la influencia de los mutantes RAS en el fenotipo TGFB1 inducida de células PANC-1: E-MTAB-3364; Los datos que figuran en el desarrollo del páncreas: E-MTAB-3368; conjunto de datos sobre el tratamiento con ATRA de las células NB4: E-MTAB-3369; conjunto de datos sobre la resistencia a la apoptosis en las células Capan-1: E-MTAB-3370; Conjunto de datos en 2D y 3D cultura:.-E-3372 MTAB
Financiación: Este trabajo fue financiado en parte por la Unión Europea FP6 LSHB-CT-2006 a 018.771 subvención (Proyecto Integrado "MolDiag-Paca"), el ministerio Federal alemán de educación e investigación (BMBF) en el marco del programa de investigación del genoma médica (PACA-Net; ID del proyecto PKB-01GS08 y 01GS08178), la Fundación alemana de investigación (DFG; conceder Bu 1536 /3-1 a MB), y el 7PM de la UE subvención no. 602783 (proyecto integrado a gran escala "CAM-PAC"). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
INTRODUCCIÓN
PDAC es una enfermedad mortal que tiene una tasa de supervivencia a cinco años por debajo del 6%, que es el más bajo de todos los tumores sólidos [1]. Los síntomas tempranos son raros y no característico, por lo que sólo el 8% de los casos PDAC estará en una etapa localizada y resecable en el momento del diagnóstico, mientras que la mayoría de los pacientes se diagnostica en un avanzado, regional (27%) o a distancia (53 %) escenario. Desde avanzada PDAC es inherentemente resistentes a la mayoría de las terapias disponibles, la mayoría de los pacientes mueren cuatro a seis meses después del diagnóstico [1].
Los pacientes con enfermedad metastásica reciben quimioterapia paliativa sistémica, con gemcitabina siendo el estándar de tratamiento [2]. Se han realizado numerosos intentos inútiles para mejorar el resultado en pacientes con enfermedad metastásica mediante el uso de combinaciones con gemcitabina-espina dorsal. Sólo recientemente, nuevos regímenes de quimioterapia de combinación, tales como FOLFIRNOX [3] lograrse un beneficio de supervivencia significativo, aunque a costa de una toxicidad significativamente mejorada. Múltiples ensayos de nuevas terapias dirigidas no lograron demostrar la superioridad sobre la gemcitabina sola [4], con el inhibidor de la tirosina quinasa erlotinib ser el único agente dirigido a mostrar un beneficio de supervivencia menor, pero significativo de 14 días [5]. Nuevos enfoques para mejorar la administración de fármacos, tales como paclitaxel unido a albúmina [6], se han desarrollado y mostrar resultados prometedores en los primeros ensayos, pero se AVE a ser probada. Por tanto, existe una necesidad continua y urgente de identificar nuevos conceptos y objetivos que pueden proporcionar nuevas vías para luchar contra esta enfermedad.
Como para muchas otras enfermedades, a gran escala genómica, transcriptómica y, en un grado algo menor, análisis proteómicos han sido instrumentales en el establecimiento de catálogos completos de moléculas que son alterados en su estructura y /o abundancia en los tumores pancreáticos (por ejemplo [7-21]. Mucho menos desarrollados son los conceptos y métodos para interrogar las funciones de genes a gran escala con el fin de diferenciar alteraciones "controlador", que contribuyen directamente a la transformación maligna y progresión tumoral, de "pasajeros" alteraciones, que tienen poca o ninguna influencia en la biología del tumor. Como consecuencia de ello, los ejemplos de éxito de la traducción del conocimiento generado a partir de "ómicas" se acerca a la novela conceptos y aplicaciones clínicas son pocos y escasos.
se describe aquí una estrategia de múltiples etapas diseñado para eludir este problema proporcionando una base racional para la selección de nuevos genes candidatos altamente relevantes en función de los resultados de los análisis de alto contenido funcionales . Con este fin, el flujo de trabajo del estudio comprendía tres etapas diferentes: 1) se analizan los perfiles de expresión génica de serie de tejidos pancreáticos humanos primarios, así como un número de
vivo
en y
in vitro y modelos de desarrollo del páncreas, la diferenciación celular, invasión, metástasis, resistencia a la apoptosis etc. utilizando matrices personalizadas de colecciones de ADNc enfocadas a fin de identificar genes con patrones de expresión visibles; 2) el uso de 'matriz transfección inversa' tecnología [22,23] a gran escala de análisis funcional de genes candidatos seleccionados de la etapa 1 en ensayos basados en células microscopio realizadas en formato de matriz de diapositivas paralelizados; y 3) la selección de genes candidatos individuales que muestran los efectos funcionales relevantes en ensayos paralelizados un examen más detenido a fondo de sus funciones celulares. A modo de ejemplo para demostrar la validez de este enfoque, los datos completos sobre las funciones anteriormente desconocidas de un gen candidato seleccionados a través de este proceso (ADRBK1 /GRK2) en las células de cáncer de páncreas se presenta.
El flujo de trabajo completa del gen de varios pasos proceso de selección /caracterización se describe esquemáticamente en la figura 1.
MATERIALES y MÉTODOS
producción de cDNA array y la hibridación
La producción de cDNA arrays, extracción y etiquetado radiactivo de ARN total, así como la hibridación y la cuantificación de las señales de hibridación se realizaron como se ha descrito previamente [24,25]. En resumen, los ADNc se amplificaron por PCR y dispuestas por duplicado a membranas de nylon utilizando dispositivos robóticos.
El ARN total transcripción inversa y radiactively marcado con 33P-dATP usando el kit de RT-Stripez (Ambion) y se hibridaron durante la noche al nylon matrices de membrana en tampón de hibridación ULTRArray (Ambion) a 50 ° C. señales radiactivas se detectaron usando un sistema de imagen de fósforo Storm (Amersham Biosciences, Feiburg, Alemania) y se cuantificaron con el software de ArrayVision (InterFocus, Haverhill, Gran Bretaña). intensidad de la señal se normalizaron a la intensidad de señal media de todas las características en una matriz individuo
Los genes se definen como se expresa diferencialmente entre dos conjuntos de muestras si:. (1) el valor de la expresión media normalizada supera 0,5 en al menos una de los dos conjuntos de muestras, (2) la diferencia entre las medias de los valores de expresión normalizados era al menos dos veces entre los conjuntos de muestra y un valor de p (3) una prueba t de dos lados produjo de menos de 0,05.
Raw los datos de todos los experimentos se puede acceder en http://www.staff.uni-marburg.de/~buchhol3/RevTrans/
Los siguientes perfiles de expresión génica experimentos de tejidos y
in vivo /in vitro se llevaron a cabo y modelos para la caracterización de serie de genes candidatos:.
tejidos humanos primarios
Un total de 16 muestras clínicas de adenocarcinoma ductal, 6 muestras de la pancreatitis crónica, y 4 muestras de morfológicamente se analizaron los márgenes de resección normales de resectates con pancreatitis crónica. Las muestras fueron proporcionados por el departamento de cirugía de la Universidad de Ulm (Alemania), así como el departamento de patología de la Universidad de Kiel (Alemania). El consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes antes de usar las muestras de tejido. El estudio fue aprobado por los comités de ética locales en las universidades de Ulm y Kiel (Ethikkommission der Universität Ulm; Ethikkommission der Christian Albrecht-Universität zu Kiel)
Desarrollo Páncreas
El ARN total.. de páncreas humanos adultos normales y páncreas humanos fetales fueron adquiridos de Clontech. Cada muestra colectiva se marcó de forma independiente y se hibridó 3 veces.
ATRA tratamiento de células de leucemia NB4.
La línea de la leucemia promielocítica aguda derivada de células, NB4 [26], se cultivó a 37 ° C en 5% de CO2 en un medio RPMI suplementado con 2 mM L-glutamina y 10% de suero de ternera fetal descomplementado. Las células fueron cultivadas durante 48 h con o sin 1 M-trans-retinoico (ATRA; Sigma-Aldrich). Se analizaron duplicados de 3 experimentos independientes.
tratamiento de las células SPC Pätu II.
sphingosylphosphorylcholine (SPC) es un lípido bioactivo con múltiples funciones biológicas, incluyendo la regulación de la diferenciación en células embrionarias y el cáncer. células de cáncer de páncreas Pätu II se mantuvieron en DMEM (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (PAA, Pasching, Austria) en una atmósfera humidificada y 5% CO2, 95% de aire a 37 ° C. Las células se incubaron con 15 SPC mu M en suero libre de FPR Medium 2 h o se dejan sin tratar. Se analizaron duplicados de 3 experimentos independientes.
2D y 3D cultivos celulares.
La línea celular de cáncer de páncreas A818-1 fue cultivada en monocapas ya sea en 2D o en "esferas huecas" en 3 dimensiones como se describe [27]. ARN total fue extraído a partir de 3 experimentos independientes y se analizaron por duplicado.
Patu-8988s y t-modelo de diferenciación.
Patu-8988s y Patu-8988t son dos líneas celulares que se derivan de la mismo metástasis hepática de un adenocarcinoma de páncreas humano primario, pero difieren en su estado de diferenciación y la capacidad metastásica [28]. La línea de células pobremente diferenciado Patu-8988t se transfectadas con una construcción de expresión o vector de control de E-cadherina, respectivamente, y los clones individuales se analizó mediante perfiles de expresión. Además, se analizaron 3 preparaciones independientes de las células de tipo salvaje Patu-8988s.
modelo Suit2 metástasis.
S2-007 y S2-028 son líneas celulares derivadas de la misma adenocarcinoma pancreático principal , pero displying fuertes diferencias en su potencial invasivo y metastásico, tanto in vitro como in vivo [29]. Tres preparaciones independientes de cada uno de la S2-007 altamente metastásico y la línea celular S2-028 metastásico bajo crecido en 2D de cultivo celular (DMEM (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% (v v) de suero /bovino fetal (PAA , Pasching, Austria) en una atmósfera humidificada y 5% CO2, 95% de aire a 37 ° C) se analizaron mediante perfiles de expresión.
apoptosis-resistencia en células Capan-1.
pancreático las células de cáncer son inherentemente muy resistentes a la apoptosis espontánea o inducida por quimioterapia. La línea celular de tumor pancreático humano Capan-1 (PRB + /p16-) se transfectó de forma estable con la expresión de p16 construye o plásmidos de control como se describe [30] para inactivar funcionalmente el PRB. Tres experimentos independientes se realizaron y analizaron por duplicado.
Influencia de mutantes RAS en el fenotipo TGFB1 inducida de las células PANC-1.
Hemos descrito previamente perfiles de expresión de la influencia de los mutantes RAS en el fenotipo TGFB1 inducida de la línea celular de cáncer de páncreas PANC-1 [24]. En resumen, las células PANC-1 transfectadas de forma estable con un mutante dominante negativo HRAS (S17N), un mutante constitutivamente activa KRAS2 (G12V), o simulacro de transfectadas con una construcción de expresión de EGFP fueron tratados con TGFB1 o no se tratan, respectivamente. Tres experimentos independientes cada uno se analizaron por duplicado.
líneas celulares para ensayos funcionales paralelizados e individuales
Panc-1 [31] y HEK-293 [32] Se obtuvieron células de la American Type Culture Americana Collection (Manassas, EE.UU.). S2-007 y S2-028 eran de T. Iwamura [33] (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japón). células IMIM-PC1 fueron amablemente proporcionados por F.X. Real [34] (CNIO, Madrid, España).
Las células se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contenía FBS al 10% y 0,05 mg /ml de gentamicina a 37 ° C y 5% (v /v ) de CO2.
Invertir transfección arrays
integral marcos de lectura abierta (ORF) de todos los genes candidatos y de control fueron adquiridos como clones de cDNA a partir Abrir Biosystems (Lafayette, CO, EE.UU.), PCR amplificado utilizando cebadores específicos y se clonó en el vector pENTR (Invitrogen /Life Technologies, Darmstadt, Alemania). ORFs fueron transportados a continuación, en los vectores de expresión y pdECFP pdEYFP [35] utilizando el sistema de clonación Gateway (Invitrogen /Life Technologies, Darmstadt, Alemania). Cada ORF fue por lo tanto disponible como una fusión N-terminal construir con la proteína fluorescente cian (CFP), así como una fusión C-terminal con la construcción de la proteína fluorescente amarilla (YFP).
Para la producción de 'microarrays de transfección inversa' , construcciones de expresión fueron vistos en portaobjetos de vidrio de acuerdo con un protocolo modificado a partir de [22]. 4 g de cada ADN plásmido se mezcló con 11 l de PBS y 2 l Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) en una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Después de 20 min de incubación a TA, se añadió 15 l gelatina (0,1% en PBS) a cada pocillo. mezclas de transfección fueron dispuestos en portaobjetos de vidrio Superfrost Plus (Menzel GmbH, Braunschweig, Alemania) utilizando un procesador de muestras automatizado Tecan Miniprep 75 (Tecan, Männedorf, Suiza), la generación de tamaños de punto de 0,5-1,5 mm de diámetro. Los portaobjetos se secaron y se almacena hasta 3 semanas en una atmósfera seca a 4 ° C. Para la generación de microarrays de células vivas, los portaobjetos se colocaron en placas de quadriPERM (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania), se sembró con 4,5 x 10
5 HEK-293, 4 x 10
5 Panc-1, o S2-007: 5 x 10
4 S2-007 en DMEM /10% FCS y se incubaron durante 48 horas a 37 ° C.
inmunocitoquímica
micromatrices de células vivas se fijaron durante 15-30 min a temperatura ambiente con solución de paraformaldehído al 4% en PBS y se contratiñeron y montado utilizando medio de montaje que contiene DAPI-(vector Laboratories, Burlingame, EE.UU.). La expresión de construcciones de fusión y la localización subcelular de los productos génicos se documentaron utilizando un Zeiss Axiovert 200 microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss GmbH, Göttingen, Alemania). Donde se produjeron las secciones aplicables, ópticas de muestras fluorescentes a 630x aumentos utilizando la tecnología Zeiss ApoTome (http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/apotome-2-for-biology.html).
Antibody de incubación y la detección se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para los anticuerpos individuales, respectivamente. Se utilizaron los siguientes anticuerpos:
anti-Ki67: 1: 400, policlonal de conejo, ab833, Abcam, Cambridge, Reino Unido
anti-ciclina B1: 1: 100, monoclonal de ratón, gato.#4135, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, EE.UU.
anti-ACTIVE-Casapse-3: 1: 150, policlonal de conejo, gato.#G7481, Promega, Madison, EE.UU.
anti-vimentina: 1: 200, ratón monoclonal, ab28028, Abcam, Cambridge, Reino Unido
anti-E-cadherina: 1: 100, ratón monoclonal , gato.#610181, BD Biosciences, Sparks, EE.UU.
anti-IgG de conejo (Cy3) 1: 500, policlonal de cabra, ab6939, Abcam, Cambridge, Reino Unido
IgG anti-ratón (Cy3) 1 : 500, policlonal de cabra, ab97035, Abcam, Cambridge, Reino Unido
aislamiento de ARNm y proteínas de extracción
el aislamiento de ARN se realizó utilizando el kit peqGOLD ARN total (Biotecnología Peqlab GmbH, Erlangen, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las concentraciones se cuantificaron con el NanoDrop ND-1000 (Peqlab Biotecnología GmbH), seguido de la síntesis de ADNc de primera cadena a partir de 1 g de ARN total usando el kit Omniscript y el protocolo (Qiagen, Hilden, Alemania).
Para las proteínas totales extractos, las células se centrifugaron en medio de cultivo (13 000 rpm, temperatura ambiente, 5 min). Los sedimentos se resuspendieron en PBS, suplementado con inhibidor de proteinasa (G-Biosciences, Maryland Heights, EE.UU.) y se sometió a ultrasonidos con un Labsonic U (B. Braun, Melsungen, Alemania). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo de proteínas de Bradford y se miden con el fotómetro Multiskan FC (Thermo Scientific, Langenselbold, Alemania).
QRT-PCR e inmunotransferencia
ADNc de primera cadena se amplificaron en 7500 Fast Sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Warrington, EE.UU.), utilizando la energía SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) y pares de cebadores específicos diseñados con el programa PrimerExpress (Applied Biosystems, para las secuencias ver material complementario).
para Western blot, 10 ng de extractos de proteína total se cargaron y separados por 10 o 15% de SDS-PAGE. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Whatman GmbH, Dassel, Alemania) y se bloquearon durante 4-6 horas a 4 ° C en 1xTBS, 0,1% de Tween 20 y 5% de leche en polvo. Los anticuerpos primarios se diluyeron 1: 1 000 en tampón de bloqueo y se incubaron durante la noche a 4 ° C. se utilizó TBS-T (0,1%) como tampón de lavado. El anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con HRP se diluyó a 1:10 000 y se incubaron durante 1-2 horas a 4 ° C en tampón de bloqueo. Las proteínas se detectaron utilizando el kit de inmunotransferencia ECL (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania).
Construcción y análisis de microarrays de tejidos
Para la construcción de microarrays de tejidos (TMA), 1 mm ( tumor) y 1,5 mm (tejido normal) biopsias de tejido de tamaño se extrajeron de los bloques donantes de parafina y se transfieren en los agujeros previamente perforados en los bloques de parafina receptor una microarrayer de tejidos (Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, EE.UU.) equipado con un refuerzo TMA (Alphelys, Plaisir, Francia). diseños de cuadrícula de tumor y el tejido normal de páncreas TMA fueron diseñados con el software TMA Designer 2 (Alphelys). Los bloques receptores fueron sellados durante 10 minutos a 56 ° C y 30 min a 4 ° C. Este procedimiento se repitió dos veces. Los bloques TMA se cortaron en secciones de 3,5 micras y se colocaron en portaobjetos SuperFrost Plus para la tinción inmunohistoquímica. La utilización de tejidos humanos con fines de investigación fue aprobado por el comité de ética local de la Clínica Universitaria, Tübingen (470 /201BO1), y la Clínica de Cirugía, Universidad de Heidelberg, Alemania (301/2001).
La tinción inmunohistoquímica fue lleva a cabo con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-ADRBK1 (Thermo Fischer,#MA5-15840; dilución 1: 1000) en el sistema referencial XT Ventana (Ventana Medical Systems, Tucson, USA), incluyendo la desparafinación de las secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina y el calor inducido por antígeno de recuperación.
Análisis de la intensidad de la tinción fue realizada por un patólogo con experiencia en tumores pancreáticos (BS) de una manera ciega con respecto a los parámetros tumorales. La proporción de las células positivas que muestran una tinción significativa en las zonas tumorales se calculó en porcentaje y se divide en puntuaciones (1-10% -weak, 11-50% Moderado, & gt; 50% -fuerte
transfección. de siRNAs
Para mediada por silenciamiento de la expresión de ARNi ADRBK1, pre-diseñado Silenciador siRNAs (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX, EE.UU.) se transfectaron en una concentración de 40 nmol de lípido utilizando el Reactivo siLentFect (Bio- Rad, München, Alemania). Accell no director siRNA#1 (Thermo Fisher Scientific, Dharmacon productos, Lafayette, LA, EE.UU.) se utilizó como control no silenciar.
proliferación y viabilidad ensayos
para los ensayos de incorporación de BrdU utilizando el proliferación celular Kit ELISA (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), 5 000 a 7 500 células fueron reseeded las 24 h post-transfección en una placa de cultivo celular Negro ViewPlate-96 (Perkin Elmer, Waltham, MA , EE.UU.). Después de una noche de cultivo, las células se incubaron 4-6 h con BrdU que contiene medio. Después de la fijación durante 1 h, se tiñeron las células durante 1,5 h con el anticuerpo anti-BrdU conjugado con peroxidasa, el sustrato de quimioluminiscencia añadió y la emite luz cuantificado con un Centro LB 960 luminómetro (Berthold Technologies GmbH, Stuttgart, Alemania).
Para los ensayos de MTT, 20 000 a 25 000 células fueron reseeded 24 h después de la transfección en placas de cultivo celular de 24 pocillos. Después del cultivo adicional durante 24 h o 48 h, el sobrenadante se reemplazó por medio que contiene MTT (azul de tiazolilo, Carl Roth GmbH) y las placas se incubaron durante 2 horas a 37 ° C. El medio se reemplazó por solución de solubilización (10% de Triton-100, ácido clorhídrico 0,1 M en 2-propanol). La extinción se midió a 570 nm con el fotómetro Multiskan FC (Thermo Scientific, Schwerte, Alemania).
citometría de flujo
Trypsinized células se centrifugaron a 1.200 rpm durante 3 min. Después de lavar con PBS, sedimentos se resuspendieron a fondo en 50 a 100 l de PBS y la suspensión de células transferidas gota a gota en etanol enfriado con hielo (70%) bajo agitación continua. Después de centrifugar a 1 000 g durante 5 min, se descartó el sobrenadante cuidadosamente, el sedimento se lavó con PBS 500 l de hielo frío y se resuspendió en 500 l de mezcla de propidio-yoduro de (1 mg /ml de propidio-yoduro (Sigma Aldrich) + 500 g /ml de ARNasa libre de ADNasa (Roche Diagnostics) en PBS). Las muestras se incubaron durante 30-45 min a TA en la oscuridad y después se valoran con el citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Para la evaluación de los datos, se utilizó el software ModFit LT (Verity Software House, Topsham, EE.UU.).
RESULTADOS
Caracterización de serie de genes candidatos PDAC por perfiles de expresión utilizando hibridaciones cDNA array, análisis de datos y la selección de genes candidatos
Como un primer paso en la identificación sistemática de nuevos genes candidatos funcionalmente relevantes en el cáncer de páncreas, que produce cDNA arrays personalizados con colecciones de clones de ADNc específicos de cáncer de páncreas (n = 468 a partir de [7] y [36]), que, además, se incrementará con colecciones de gran escala de clones de ADNc (n = 1492) de las familias de genes potencialmente relevantes tales como quinasas, fosfatasas, los genes de respuesta de suero, etc. (ver conjuntos de datos en información suplementaria para los detalles de las composiciones de matriz ). Estas matrices se utilizaron para la expresión génica análisis de tejidos primarios humanos de páncreas, así como un número de
in vivo
y
in vitro y modelos de desarrollo del páncreas, la diferenciación celular, invasión, metástasis, apoptosis resistencia etc. (tenga en cuenta que, dado que las colecciones de clones de ADNc para la generación de las matrices se amplió continuamente en el transcurso de estos estudios, no todos los ADNc se hibridaron con todos los modelos experimentales). Con el fin de ser seleccionado para su posterior caracterización funcional, genes candidatos tenían que ser desregulado de manera significativa en el cáncer de páncreas (sobreexpresa o downregulated en tejidos de cáncer de páncreas primarios en comparación con pancreatitis crónica y muestras de páncreas normal), así como mostrar regulación significativa en al menos una de los sistemas de modelos funcionales (ver material & amp; para obtener más detalles de la cuantificación de la señal de hibridación y la definición de la expresión diferencial Métodos).
Esta lista prima de posibles genes candidatos fue curada manualmente para excluir los genes que previamente habían sido estudiados intensivamente en cáncer de páncreas, así como excluir las etiquetas de secuencias expresadas (EST) de la colección de cDNA específico del cáncer pancreático que mostraron insuficiente homología con genes humanos anotados. Utilizando estos criterios, se seleccionaron un total de 50 genes para la caracterización funcional paralelizado (ver abajo). Esta lista se ha ampliado con 17 genes candidatos que habían mostrado patrones de expresión PanIN específicos en nuestros análisis anteriores de microdissected muestras de los conductos normales, así como las lesiones pre-cancerosas y cancerosas de páncreas humano [11]. Por último, una selección de 14 genes conocidos con diversas funciones celulares se añadieron como controles positivos para los análisis funcionales. La lista completa de los genes candidatos seleccionados y de control se da en la Tabla S1 (información complementaria).
ensayos basados en células paralelizado
Con el fin de cribar rápidamente los efectos funcionales de los 67 genes candidatos en paralelas, construcciones de expresión de los genes candidatos, así como 14 genes de control con funciones conocidas fueron clonados en forma de fusiones N-terminales con la proteína fluorescente cian (CFP), así como fusiones C-terminales con la proteína fluorescente amarilla (YFP). El ADN plásmido, un complejo con reactivos de transfección, se vistió en portaobjetos de vidrio estándar de microscopía y sobrepuesto con suspensiones de células pancreáticas cancerosas (Panc-1, S2-007) o células de control no transformada (HEK-293). Bajo un microscopio de fluorescencia, manchas de células transfectadas se identifican fácilmente debido a las señales fluorescentes específicas de la PPC o YFP proteínas de fusión, que también permite la comparación directa con las células no transfectadas vecinas.
Las matrices inversas de transfección fueron entonces utilizado para análisis funcionales paralelizados el fin de identificar nuevos genes candidatos con funciones potencialmente importantes en las células de cáncer de páncreas. En una primera ronda de evaluación, la localización subcelular de los productos génicos (así como la morfología general en comparación con las células no transfectadas), ambos en presencia y ausencia de suero, se registró y se comparó entre las células cancerosas y de control (véase la figura 2 para ejemplos de diferentes localizaciones). En los análisis posteriores, las matrices de células fijadas fueron incubadas con anticuerpos contra marcadores bien definidos de apoptosis (caspasa-3 escindida), la proliferación (Ki-67, ciclina B) y epitelial-mesenquimal transdiferenciación (EMT; mesenquimal vimentina marcador, marcador epitelial E -cadherin). Ejemplos de resultados de la tinción se muestran en la figura 3. La frecuencia y la intensidad de la tinción se registraron, anotó y se compara entre las células transfectadas y no transfectadas visualmente. recurrentes diferencias entre las células transfectadas y no transfectadas se calificaron como "++" (efectos fuertes), "+" (efectos moderados pero reproducibles) y "(+)" (débiles y /o efectos variables). La Tabla 1 enumera todos los genes para las que al menos una veintena de "++" o, al menos, tres puntuaciones de "+" se registraron en replicar experimentos independientes, y que por lo tanto se define como individuo adecuado para un análisis en profundidad. Los candidatos seleccionados comprenden 3-quinasas (ADRBK1, FASTK, PRKCZ), 3 fosfatasas (PPM1G, PPP2R1A, PPP2R4), 2 factores de transcripción (FRA-2, GTF2F2), 2 proteínas actina-interactuando (CFL1, RRAS), 1 proteína transmembrana ( TM4SF1), 1 histona metil transferasa (SUV39H1), 1 receptor acoplado a proteína G (EBI2) y 1 proteína interferón-inducible con la función celular desconocido (IFI27). Ninguno de ellos había sido asociado con el cáncer de páncreas en el momento en que se incluyeron en las matrices de transfección inversa.
son PPC (A) o YFP (B-C) construcciones de fusión se muestra. Después de la transfección y la fijación de las células en microarrays de transfección inversa, los cubreobjetos se aplicaron usando DAPI que contienen medio de montaje. Para las proteínas de fusión de la PPC, las señales de DAPI se muestran en marrón (color falso) para proporcionar contraste adecuado (A). Se demuestran los ejemplos de puramente citoplasmática (A), uniforme núcleo-citoplasma (B) y localización puramente nuclear (C), así como la localización de endosoma-como las estructuras (D). magnificaciones originales se indican en las imágenes
A:. caspasa-3 tinción (Cy-3, rojo), las células HEK-293 transfectadas con H1F0-YFP (verde); B: tinción Ki-67 (Cy-3, rojo), HEK-293 transfectadas con NKX2-5-YFP (verde); C: La ciclina B tinción (Cy-3, rojo), PANC-1 transfectadas con PRKCZ-YFP (verde); D: tinción con vimentina (Cy-3, rojo), PANC-1 transfectadas con FASTK-YFP (verde); E: E-cadherina tinción (Cy-3, rojo), PANC-1 transfectadas con PPP2R1A-YFP (verde). magnificaciones originales se indican en las imágenes.
Validación funcional /caracterización individual en profundidad del gen candidato ADRBK1
Como una prueba de concepto para confirmar la validez de datos funcionales obtenidos a través de los ensayos basados en células paralelizados, nos muestran a modo de ejemplo detallada
in vitro
datos funcionales de caracterización de un gen, ADRBK1, que fue el primer gen (en orden alfabético) en la lista de candidatos de alta prioridad (Tabla 1). Detallada
in vivo
y en
caracterización in vitro venta de otros genes candidatos a la generación de modelos de ratones de ingeniería genética están ya sea en prensa o en preparación y serán reportados en otros lugares.
localización subcelular de la proteína ADRBK1 /CRK2.
ADRBK1 (adrenérgico, Beta, la quinasa del receptor 1) también conocido como GRK2 (G-receptor acoplado a proteína quinasa 2) se incluyó originalmente en los arrays de cDNA como miembro de la familia de genes de quinasa, que representan genes diana druggable ideales. Se encontró que se sobreexpresa en PDAC durante los experimentos de perfiles de expresión de serie. En los experimentos de transfección de matriz inversa, ADRBK1 /CRK2 había demostrado marcadas diferencias en la localización subcelular en función de la presencia o ausencia de suero (localización citoplasmática en presencia, localización nuclear y citoplasmática en ausencia de suero). Tradicional ( "hacia adelante") la transfección de construcciones de fusión en las células Panc1 ADRBK1 confirmó esta observación, que muestra las señales fluorescentes previstos en el núcleo exclusivamente en las células privadas de suero 24 horas después de la transfección (Fig 4A y 4B). Curiosamente, después de tiempos de incubación prolongados, había una fuerte tendencia de la señal a desplazarse hacia el núcleo independientemente de la presencia o ausencia de suero (Fig 4C y 4D), indicando posiblemente un papel de ADRBK1 en la reacción de las células para el agotamiento de nutrientes y /o factores de crecimiento.
construcciones de fusión
ADRBK1-YFP (señales verdes) se transfectaron en células Panc-1 en cultivo cultivadas en ausencia (a, C) o presencia (B, C) de 10% de suero . Después de 24 h o 48 h de incubación, las células se fijaron y se contratiñeron con DAPI (señales azules). Después de 24 h, las señales ADRBK1-YFP fueron detectables en ambos, citoplasma y los núcleos, de las células cultivadas sin suero (A), mientras que los núcleos de las células cultivadas con suero estaban desprovistas de YFP fluorescencia (B). Por el contrario, después de 48h de incubación, las células cultivadas bajo cualquiera de las condiciones mostraron tinción prominente de núcleos (C, D). http://www.staff.uni-marburg.de/~buchhol3/RevTrans/:
doi:10.1371/journal.pone.0122946.s001
(XLS)
S2 J Clin Oncol. J Clin Oncol. Am J Pathol. JAMA. Int J Cancer. Circ Res. J Biol Chem.