Extracto
Vías involucradas en la síntesis del ácido gamma-aminobutírico neurotransmisor (GABA) han sido implicados en la patogénesis de los tumores neuroendocrinos de alto grado (NE), así como las neoplasias de un linaje no NE. El uso del Genoma del Cáncer Atlas, la sobreexpresión de la enzima sintética GABA, glutamato descarboxilasa 1 (
GAD1
), se encontró que se asocia con una disminución de la enfermedad de supervivencia libre de adenocarcinoma de próstata y la disminución de la supervivencia global en células renales carcinomas de células claras . Además,
se encontró GAD1
que se expresa en líneas celulares de cáncer de próstata resistente a la castración, pero no las líneas celulares sensibles a andrógenos. Usando una nueva microplaca de ensayo enzimático de fluorescencia acoplado de GABA mediada por la reducción de la resazurina en un carcinoma neuroendocrino de próstata (PNEC) línea celular, el estrés microambiente inducida por ácido aumenta los niveles de GABA mientras que el estrés microambiente inducida alcalina disminuyó GABA mediante la modulación de GAD1 y la glutamina sintetasa (GLUL) actividades. Además, la glutamina, pero no la privación de glucosa disminuyó GABA través de la modulación de GLUL. Consistente con la evidencia en los organismos procariotas y eucariotas que la síntesis de GABA mediada a través de GAD1 puede jugar un papel crucial en sobrevivir estrés, GABA puede ser un mediador importante de la supervivencia estrés en neoplasias. Estos hallazgos identifican la síntesis de GABA y el metabolismo como un camino potencialmente importante para la regulación de la respuesta al estrés celular de cáncer, así como un objetivo potencial para estrategias terapéuticas
Visto:. Ippolito JE, Piwnica-Worms D (2014) una fluorescencia acoplada ensayo para ácido gamma aminobutírico (GABA) revela metabólico modulación inducida por el estrés del contenido de GABA en el cáncer neuroendocrino. PLoS ONE 9 (2): e88667. doi: 10.1371 /journal.pone.0088667
Editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Octubre, 2013; Aceptado 15 de enero de 2014; Publicado: 13 Febrero, 2014
Derechos de Autor © 2014 Ippolito, Piwnica-Worms. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por becas de la Sociedad Radiológica de América del Norte (RR1031; http://www.rsna.org) y los Institutos nacionales de Salud (P50 CA94056). El núcleo HTS está apoyado en parte por una subvención al Centro de Cáncer Siteman (P30 CA091842). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el neuroendocrino (NE) del sistema es una red difusa de células distribuidas a lo largo de diversos tejidos y órganos que pueden producir efectos locales o sistémicos en la fisiología a través de la secreción de hormonas o neurotransmisores. Aunque surgen algunas células de la cresta neural, la mayoría se derivan de células progenitoras multipotenciales epiteliales [1]. Neuroendocrinos (NE) carcinomas, que se cree que se derivan del sistema NE, se producen en casi todos los lugares anatómicos y exhiben una amplia gama de comportamientos fenotípicos de benigno a metastásica [2], [3]. Por ejemplo, los tumores carcinoides "clásicos" o carcinomas NE de bajo grado son bien diferenciados, tienen un bajo índice mitótico, y se asemejan a la hiperplasia de células NE [2], [3], mientras que los carcinomas de células pequeñas o carcinomas NE de alto grado son agresivos y pobremente diferenciado [4] - [9]. Los carcinomas de alto grado NE característicamente tienen numerosas áreas de necrosis, un alto índice mitótico [2], [3], y un mal pronóstico. Las terapias convencionales no mejoran la supervivencia del paciente en pacientes con carcinoma de alto grado NE [10].
adenocarcinomas, que son mucho más comunes, surgen a partir de un origen epitelial y muestran un patrón de crecimiento glandular [11]. Curiosamente, adenocarcinomas pueden exhibir características NE caracterizadas molecularmente como la expresión de productos de genes asociados con el linaje de células NE. Este fenómeno se ha demostrado en muchos tipos de adenocarcinoma, incluidos los de pulmón, próstata y colon, y se correlaciona con la agresividad del tumor, la metástasis, y la supervivencia acortada [12] - [19]. Específicamente, en el caso de cáncer de próstata, la expresión de NE cuenta positivamente se correlaciona con el crecimiento metastásico potencial y resistente a la castración [19] - [21]. Por desgracia, la biología de las células NE, así como sus contribuciones a la homeostasis de órganos permanecen sin ser definido, en parte debido a la escasez de estas células en los órganos normales [22].
Anteriormente, se utilizó una combinación de la expresión génica perfilado, espectrometría de masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear para dilucidar una serie de redes metabólicas implicadas en los cánceres de NE agresivos utilizando un modelo de ratón genéticamente modificado de carcinoma NE de próstata metastásico, y una línea celular derivada de próstata NE carcinoma (PNEC), en el que el cryptdin 2 promotor dirige la expresión del antígeno T grande oncogénico (CR2-TAG) [13], [23] - [25]. Los resultados de estos análisis identificaron la síntesis y el metabolismo de ácido gamma-aminobutírico (GABA) derivado de tanto el ácido (TCA) intermedios tricarboxílicos ciclo y poliaminas (denominados colectivamente como el shunt GABA) como una red metabólica prominente hasta regulada en carcinomas NE agresivos [ ,,,0],13].
instrumentación especializada Modern utilizado para metabólica análisis, tales como la espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética nuclear (RMN) son caros, requieren una formación significativa de operar, y puede no ser fácilmente disponible para muchos laboratorios académicos . Classical cuantificación metabolito basado en enzimática, por otra parte, proporciona un medio económico, fácilmente accesibles, sensibles para el análisis cuantitativo de metabolitos [26]. A pesar de que no puede proporcionar información simultánea sobre las cantidades de varios metabolitos, la cuantificación enzimática ofrece la posibilidad de cuantificar de forma simultánea a través de un metabolito dado muchas muestras en una plataforma de alto rendimiento [27] - [29].
La piridina nucleotide- ensayos enzimáticos basados que par la producción de NADH o NADPH (denominados colectivamente como NAD (P) H) a una reacción bioquímica son atractivas, ya que estos nucleótidos reducidos fluorescencia y por lo tanto se pueden utilizar para la lectura cuantitativa de los niveles de actividad de la enzima o metabolito. Sin embargo, la fluorescencia de fondo en los tejidos biológicos puede limitar la sensibilidad de detección NAD (P) H [26].
múltiples estrategias para mejorar la salida fotónico y mejorar la sensibilidad de las reacciones enzimáticas se han desarrollado [26], [ ,,,0],30] - [32]. Una estrategia implica el acoplamiento de NAD (P) H a la síntesis mitocondrial lipoil deshidrogenasa (diaforasa) que activa sustratos químicos para ensayos cromogénicos o de fluorescencia. La resazurina es uno de tales compuestos que se pueden utilizar para ensayos de viabilidad celular enzimáticamente acoplados a y [27], [33], [34]. Aquí, se presenta un novedoso ensayo enzimático para la cuantificación de GABA y utilizamos con éxito este ensayo para caracterizar los cambios en GABA celular en células PNEC bajo estrés metabólico.
Materiales y Métodos
Reactivos
Todos los reactivos químicos y enzimáticos fueron adquiridos de Sigma.
Cell Cultura y micoplasma
Todas las líneas celulares rutinariamente dieron negativo. Todas las líneas celulares se cultivaron a bajo paso en condiciones convencionales de acuerdo con los protocolos de ATCC en un 95% de O
2/5% de CO
2 incubadora a 37 ° C. Un subclón de auto-fijación de la línea celular de cáncer de próstata neuroendocrino (PNEC) [35] se cultivó como se ha descrito anteriormente [36]. Brevemente, medio DMEM /F12 (Invitrogen) fue suplementado con calor al 10% de FBS inactivado (Gibco), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA, Gibco), B27 suplemento de suero (Invitrogen), 5 ng /ml de EGF (BDBiosciences), 5 ng /ml de bFGF (Sigma), y tampón de 15 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (Gibco). Todas las células se hicieron crecer hasta un máximo de 75% de confluencia. Las células se tripsinizaron, se neutralizó con medio de crecimiento y se pasaron. Los sedimentos celulares de ARN o ensayos bioquímicos se centrifugaron a 125 xg durante 5 min a 4 ° C. Las células se lavaron con hielo frío tampón fosfato salino, y se centrifugaron de nuevo. Los sobrenadantes fueron aspirados y los sedimentos se congelaron en nitrógeno líquido. Todas las muestras fueron almacenadas a -80 ° C hasta su uso posterior.
Evaluación de las curvas de supervivencia de Genoma del Cáncer Atlas (TCGA)
El cBioPortal de Genómica del Cáncer [37], [38] siempre se utilizó a través del portal de datos del Atlas del Genoma del cáncer para acceder y visualizar conjuntos de datos clínicos y de expresión génica de adenocarcinoma de próstata humana [39] y el carcinoma de células renales de células claras humana [40]. Sólo la "expresión de ARNm puntuaciones z vs Normales" opción se comprobó. Se seleccionaron "Todos los tumores" para la consulta. datos RNASeq se utilizó para los conjuntos de datos claros carcinoma de células. Las curvas de supervivencia se evaluaron en base a la expresión de genes dentro de la derivación GABA. Las muestras que exhiben aumentaron
expresión GAD1 gratis (puntuación z & gt; 2 o 3) y la disminución de
GLUL
expresión (z & lt; -2) fueron identificados y la información clínica exporta. Las curvas de supervivencia se construyeron con GraphPad Prism.
Tiempo real PCR Primer diseño em
Los cebadores para PCR en tiempo real fueron diseñados utilizando PrimerBLAST.
GAD1 gratis (NM_000817.2), pero no ARNr 18S (
RNA18S5
; NR_003286.2), fue diseñada a través de una unión intrón-exón. cebadores seleccionados no tenían ninguna amplificación predicho desviado en el genoma humano. temperaturas de fusión de primers fueron diseñados entre 61 ° C y 63 ° C. Los cebadores fueron probados con PCR a partir de ADNc sintetizados a partir de líneas celulares de LNCaP NCI-H660 y. Los amplicones de longitud esperada (GAD1:145 pb; 18S: 182 bp) se obtuvieron a partir de preparaciones de ADNc y no eran evidentes en las reacciones de PCR usando ADN genómico como plantilla o el agua solamente. Derretir curvas y las eficiencias de amplificación de todos los pares de cebadores se realizaron. El primer secuencias son las siguientes:
GAD1 gratis (hacia delante): 5'-ATGGGGTTCGCACAGGTCATCC-3 ',
GAD1 gratis (inversa): 5'-TCCATGAGGACAAACACTGGTGCA-3';
RNA18S5 gratis (hacia delante):.
PCR en tiempo real
: '5' GAATAACGCCGCCGCATCGC-3,
RNA18S5 gratis (inversa) '5'-3-GGGCATTCGTATTGCGCCGC
se aisló ARN de los sedimentos celulares congelados a presión utilizando el kit RNeasy (Qiagen). Después de la extracción de RNA, todas las muestras de ARN se dividen en partes alícuotas y se almacenaron a -80 ° C. Todas las muestras de ARN fueron tratadas con DNasa Turbo (Ambion) para la extracción de ADN genómico. Todo el ARN utilizado para la PCR cuantitativa fue inmediatamente a transcripción inversa con el kit de iScript (BioRad). La pureza del ADNc se evaluó con la amplificación 18S rRNA PCR de la muestra de ADNc y una muestra de control negativo de ARN que carecía de la transcriptasa inversa. Todas las muestras utilizadas para posteriores experimentos de QPCR no tenían contaminación de ADN genómico detectable, como se evidencia por la falta de un amplicón 18S siguiente 40 ciclos de la reacción que carece de la transcriptasa inversa. Cada muestra se ensayó por triplicado a 50 ng de ADNc. PCR en tiempo real se realizó con SYBR mezcla verde master (BioRad) y una concentración de 100 nM del cebador específico fijado en un instrumento Bio-Rad CFX96 PCR (95 ° C durante 10 min, luego 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s , 61 ° C durante 1 min, y 74 ° C durante 1 min). cebadores 18S rRNA fueron utilizados como un estándar interno.
Experimentos estrés metabólico
Para los experimentos de privación de nutrientes, que carecen de la glucosa, se utilizó piruvato y glutamina (USBiological) DMEM media /F12. El medio se complementa con los siguientes componentes: inactivado por calor suero dializado con un corte de 10 KDa de peso molecular (Sigma), aminoácidos no esenciales al 1% (NEAA, Gibco), 5 ng /ml de EGF (BDBiosciences), y 5 ng /ml bFGF (Sigma). La glucosa y glutamina (Gibco) se complementaron con los medios especializados cuando sea necesario. Se añadió glucosa al medio utilizando concentraciones estándar de formulación DMEM /F12 de 17,5 mM. La glutamina se utilizó a 6 mM. Antes de los experimentos estrés metabólico, las células PNEC se sembraron a una densidad de 400.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos con 1,5 ml de medio de crecimiento estándar. Las células se dejaron crecer durante 24 horas. Medios fue entonces intercambiado por 1,5 medios de estrés ml. Para todos los experimentos de tensión de pH, se utilizó un medio de crecimiento convencional sin PNEC tampones de bicarbonato o HEPES y se modificó como sigue. Para el estrés, ácido 2 - (
N
morfolino) etanosulfónico (MES), se añadió pH 6,5, para una concentración final de 20 mM. Para pH convencional, se añadió HEPES, pH 7,4 para una concentración final de 20 mM y bicarbonato de sodio añadido para una concentración final de 0,34 g /L. Para el estrés alcalina, se añadió tris (hidroximetil) aminometano (Tris), pH 8,5 para una concentración final de 20 mM y bicarbonato de sodio añadido para una concentración final de 0,34 g /L. Las células fueron incubadas en una cámara húmeda y sin emisiones de CO
2 a 37 ° C durante 24 horas.
Preparación de muestras
Preparación de muestras para el ensayo enzimático se modificó a partir de métodos descritos anteriormente [13 ], [26]. Para los experimentos de tensión, los medios de comunicación se aspiró rápidamente de los pocillos y las células se lavaron con 1 ml de PBS. De ácido y estrés base de experimentos, los pocillos se enjuagaron con solución salina tamponada al pH apropiado con MES 20 mM o HEPES como anteriores. Las células fueron lisadas en 200 l solución enfriada con hielo de lisis (50 mM de hidróxido de sodio y 1 mM EDTA) y se agitaron suavemente durante 30 s. A continuación, se añadió un volumen igual de ácido clorhídrico 100 mM para acidificar el lisado. Las placas se cubrieron con película de sellado PCR adhesivo y se incubaron en un baño de agua a 60 ° C durante 30 minutos para destruir la actividad enzimática endógena, así como NADH endógeno. Después de la incubación, las placas se centrifugaron brevemente a 100 × g (Allegra 6R; Beckman-Coulter) para eliminar el condensado. La película se retiró y 100 l de 400 mM Tris Base se añadió a cada pocillo, para un volumen total de 500 l de lisado de cada uno (pH final de aproximadamente 8) también. Los lisados se centrifugaron a 15.000 x g durante 5 minutos para sedimentar los restos y se recogieron y se congelaron a -80 ° C hasta su uso posterior sobrenadantes.
ensayo basado en resazurina para GABA y succínico semialdehído Determinación
Tras la optimización de reactivos, la mezcla maestra para la cuantificación de GABA y semialdehído succínico (SSAL) en muestras consistió en 0.063 U /ml GABase, 0.063 U /ml de diaforasa, 6,25 M de resazurina, 100 mM fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido (NADP), 5 mM de alfa-cetoglutarato y 3,125 M de ditiotreitol (DTT) en la base de Tris 100 mM, pH 8,8. La mezcla maestra se hizo fresco antes de cada experimento.
A de mezcla maestra para cuantificar solamente SSAL incluye los reactivos anteriores, así como mM 2-aminoetil sulfato de hidrógeno 50, un inhibidor de la componente GABA transaminasa de la preparación enzimática GABase. El inhibidor se añadió a la mezcla maestra durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la adición de mezcla maestra a las muestras. Una preparación reciente del inhibidor se preparó antes de todos los experimentos.
alícuotas de muestra (10 l) se añadieron a los pocillos de una placa de cultivo negro 96 pocillos de fondo claro (Costar) seguido de la adición de 90 l de Mastermix con una pipeta multicanal electrónica. Dos partes alícuotas de la misma muestra se utilizaron para la determinación de GABA total más SSAL o SSAL solo en la misma placa. A menos que se especifique lo contrario, la reacción se realizó a temperatura ambiente y se protegió de la luz durante 30 minutos. La señal obtenida a partir, el producto fluorescente resorufina de resazurina, se cuantificó utilizando un lector de microplacas FLUOstar Optima (BMG Labtech) con un /590 juego de filtros nm de emisión 544 nm de excitación (ganancia de 1327; 10 destellos por pocillo). Los análisis cinéticos se realizaron con 1 ciclos por minuto.
La señal de GABA total más SSAL en cada muestra se resta de la señal solo SSAL para obtener la señal de GABA. Las curvas de calibración para GABA y SSAL se construyeron para la cuantificación y se corrigieron para la reacción en blanco con y sin la presencia de sulfato de hidrógeno 2-aminoetil. mediciones de GABA y SSAL se normalizaron a la proteína en los lisados, se cuantificó con el ácido bicinconínico (BCA) ensayo (Pierce) usando una albúmina de suero bovino curva estándar. Los datos se procesaron con GraphPad Prism. grupos de nutrientes y de estrés pH se analizaron con un ANOVA manera y Dunnett post-test para el análisis estadístico.
ensayo basado en resazurina para el glutamato Determinación
un ensayo enzimático para la determinación de glutamato se realizó como se descrito anteriormente [41]. En pocas palabras, los componentes de reacción incluyen 10 resazurina mu M, 4 U /ml de glutamato deshidrogenasa, 0,25 U /ml transaminasa glutámico-pirúvica, 100 mM de alanina, 0,5 mg /ml de NAD +, y 0,5 U /ml de diaforasa en 100 mM Tris-HCl, pH 7.5. 10 l de las muestras anteriores se añadieron a 90 l de la mezcla de reacción y ensayos llevado a cabo en la oscuridad a temperatura ambiente. señal de resorufina se midió a los 15 minutos. grupos de nutrientes y el estrés pH se analizaron con un ANOVA Dunnett camino y después de la prueba para el análisis estadístico.
NAD (P) H Basado en la fluorescencia GABase Ensayo
El ensayo se modificó a partir Passoneau [26 ]. La mezcla maestra consistió en 0,08 U /ml GABase, 5 mM de alfa-cetoglutarato, 500 mM NADP, DTT 100 mM y EGTA 4 mM en pirofosfato de sodio 100 mM, pH 8,6. Las alícuotas de muestra (10 l) se añadieron a placas ópticas de 96 pocillos (Falcon 353261), seguido de 90 l de mezcla maestra. La reacción se realizó a temperatura ambiente durante 1 hora y se mide en un FLUOstar Optima con un /450 nm conjunto de filtros de emisión de 340 nm de excitación (ganancia, 2103, 10 destellos por pocillo).
Western Blot de enzimas metabólicas
se sembraron
PNEC células, estresado, y se lavaron como se ha descrito anteriormente. 100 l de tampón RIPA enfriado con hielo (10 mM Tris pH 8,0, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, cloruro 140 mM de sodio, 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,1% desoxicolato de sodio, y 1% de Triton X-100) que contiene se añadió 1 mM de ortovanadato de sodio y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Las células se rasparon de los pocillos en hielo y se añadieron a tubos de microcentrífuga. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 10.000 × g a 4 ° C para eliminar el precipitado insoluble. La proteína se cuantificó con el ensayo de BCA como se describe anteriormente
Un total de 30 g de proteína se cargó en un gel al 4-12% Bis-Tris poliacrilamida (Perno; Life Technologies). Con el agente reductor por especificaciones del fabricante. El gel se transfirió a una membrana Immobilon (Millipore) y se bloqueó con solución salina tamponada con fosfato que contiene 5% de albúmina de suero bovino y 0,1% de Tween-20. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-GAD1 (MAB5406; Millipore) en 1:5000 dilución, anti-ALDH5A1 (HPA029716; Sigma) a 1:1000 dilución, anti-GLUL (MAB302; Millipore) a una dilución 1:1000, y anti-ACTB (ab8226; Abcam) a una dilución 1:4000. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 ° C. a continuación, se utilizó secundaria de cabra anti-ratón o peroxidasa de rábano picante anti-conejo conjugado anticuerpo (Señalización Celular) a una dilución 1:5000. La misma transferencia se utilizó para examinar la expresión de todas las proteínas. Tras el uso de cada anticuerpo, el blot fue despojado con Western Re-sonda (G Biosciences) según las especificaciones del fabricante. Las transferencias se revelaron y la imagen usando el kit de detección WesternBright Quantum (Advansta).
enzimática ensayos
Se sembraron células PNEC, subrayaron, y se lavaron como se ha descrito anteriormente. Las células se rasparon en 100 l de tampón de lisis enfriado en hielo (fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0, 20 mM de fosfato de piridoxal, y 0,1% de Triton X-100) y se repiten por segunda vez por cada pocillo. Las muestras se sometieron a ultrasonidos brevemente (2-3 segundos) en hielo y posteriormente se centrifugaron durante 10 minutos a 10.000 × g a 4 ° C para eliminar el material insoluble. Antes de probar la cuantificación, se evaluaron todos los ensayos para la linealidad con respecto al tiempo y la cantidad de lisado añadido. Todas las actividades de la enzima se normalizaron a tiempo y la cantidad de proteína en el lisado. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo como se describe anteriormente.
ensayo de glutamato decarboxilasa.
El método se modifica a partir de un protocolo original [42]. El tampón de ensayo contenía 100 mM de fosfato de sodio pH 7,0, fosfato 250 mM de piridoxal, glutamato 50 mM, y 0,4% de beta-mercaptoetanol. Un espacio en blanco de reacción se llevó a cabo para cada muestra y no contenía fosfato de piridoxal o glutamato. 50 l de lisado se añadió a 50 l de tampón de reacción en una placa de PCR y se incubó durante hasta 8 horas a 37 ° C en un termociclador sin tapa calentada. El ensayo se terminó con la adición de 17 l de HCl 350 mM y se calienta durante 30 minutos a 60 ° C en un termociclador. La placa se retira y se centrifuga brevemente para eliminar el condensado. se añadieron 17 l de base de Tris 400 mM para neutralizar la muestra y la placa se centrifugó durante 10 minutos a 1000 x g para eliminar precipitado de proteína. Wells se diluyeron diez veces para la medición de GABA, el producto de la reacción enzimática, utilizando el ensayo de GABase-resazurina como se describe anteriormente.
ensayo sintetasa glutamina.
El método se modifica a partir de un original protocolo utilizando la determinación espectrofotométrica de γ-glutamil hidroxamato [43]. El tampón de ensayo contenía 50 mM de tampón de imidazol, pH 6,8, hidroxilamina 50 mM, pH 6,8, glutamina 100 mM, arseniato de sodio 25 mM, 0,2 mM difosfato de adenosina (ADP), y 0,5 mM de cloruro de manganeso. Un espacio en blanco de reacción se llevó a cabo para cada muestra y no contenía arseniato, ADP, o glutamina. 10 l de lisado se añadió a 90 l de tampón de reacción en una placa de PCR y se incubó durante hasta 8 horas a 37 ° C en un termociclador sin tapa calentada. La reacción se terminó con la adición de 100 l de reactivo de desarrollo (cloruro de hierro 0,37 M (III), ácido tricloroacético 0,3 M, M HCl 0,6). Las muestras se centrifugaron para eliminar el precipitado y la absorbancia medida a 505 nm. absorbancia de la muestra se calibró con el estándar hidroxamato γ-glutamil.
ALDH5A1 (SSADH) de ensayo.
El método fue modificado a partir de protocolos anteriores [26], [44]. El tampón de ensayo contenía Tris 100 mM pH 8,8, cloruro de potasio 50 mM, ditiotreitol 1 mM, 2,5 mM de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), SSAL 1,25 mM, y 0,02% de albúmina de suero bovino. Un espacio en blanco de reacción se llevó a cabo para cada muestra y no contenía SSAL. 10 l de lisado se añadió a 90 l de tampón de reacción en una placa de PCR y se incubó durante hasta 8 horas a 45 ° C en un termociclador sin tapa calentada. Las reacciones se transfirieron a una microplaca y la absorbancia de NADH, el producto enzimático, se midió a 355 nm. absorbancia de la muestra se calibró con el estándar de NADH.
Resultados
Implicaciones del GABA derivación
Hemos determinado con la expresión de los análisis que la síntesis de GABA se enriquece en tumores malignos de alto grado NE [13] y validado la presencia de un shunt GABA funcional en el cáncer de próstata NE (PNEC) línea de células utilizando una combinación de perfiles de expresión génica, metabolito y la enzima actividad cuantificación [13], [25]. GABA se puede derivar a partir de ácido tricarboxílico (TCA) los compuestos intermedios de ciclo y de poliamina /productos de aminoácidos catiónicos que el metabolismo de GABA par de múltiples vías en el metabolismo de la energía celular (Fig. 1). En una vía, el GABA es producida por el glutamato descarboxilasa 1 (GAD1) descarboxilación mediada por el glutamato de derivados de glutamina como con alfa-cetoglutarato del ciclo de Krebs. En una segunda vía, los productos de poliamina y la degradación de aminoácidos catiónicos a través de putrescina se someten a la conversión redox mediada por GABA. GABA puede ser metabolizado por transaminasa aminobutyrate (ABAT, GABA-T) y ácido succínico semialdehído deshidrogenasa (ALDH5A1, SSADH) en succinato de entrada en el ciclo TCA
Glud:. Glutamato deshidrogenasa; GLS: glutaminasa; GLUL: glutamato-amoniaco ligasa; GAD1: glutamato descarboxilasa; ODC1: ornitina descarboxilasa; ABP1: diamina oxidasa; ABAT: GABA transaminasa; SSAL: semialdehído succínico; ALDH5A1: succínico semialdehído deshidrogenasa de ácido; ALDH9A1: aldehído deshidrogenasa; SAT1:. Espermidina /espermina N-acetiltransferasa
En primer lugar, para determinar si la sobreexpresión de enzimas shunt GABA fueron detectables en las neoplasias prostáticas humanas y si la sobreexpresión correlacionado con eventos clínicos adversos, se utilizó el cBioPortal [37] , [38] de TCGA para interrogar a un conjunto de datos de expresión génica del cáncer de próstata a disposición del público y su correspondiente información clínica [39] para las cohortes de pacientes cuyo cáncer de componentes del shunt GABA sobreexpresado. Fuera de todas las enzimas que figuran en la Fig. 1,
GAD1
era el único gen cuya sobreexpresión se asoció con la supervivencia libre de enfermedad reducida. Se identificaron un total de 6 pacientes de un total de 216 pacientes (2,8%) cuyos cánceres que se muestra
GAD1
sobreexpresión con una puntuación z mayor que +2. Los pacientes con cánceres que sobreexpresan
GAD1
tenía una enfermedad tiempo de supervivencia libre mediana de 19,8 meses frente a 110,3 meses (p = 0,003) (Fig. 2A). Esta cohorte de pacientes tenía una amplia gama de niveles de antígeno en suero de próstata (PSA) oscila entre 3,5 y el 40,2 mg /dl, que van desde los grados de Gleason 3 + 3 a 4 + 5, y la puesta en escena que van desde T2C a T3B. A pesar de que sólo había un caso documentado de linfadenopatía metastásica en el momento de la cirugía, todas las muestras demostraron extensión extracapsular. Curiosamente, disminución de expresión de glutamina sintetasa (
GLUL
) que potencialmente pueden competir con la enzima GAD1 para el glutamato también se asoció con una menor supervivencia libre de enfermedad. Un total de 14 pacientes con puntuaciones z menor que -2 se identificaron con una supervivencia media de 27,9 meses frente a 110,3 meses (p = 0,006; Fig. 2B).
A.
GAD1
sobreexpresión de ARNm en adenocarcinomas de próstata se correlaciona con una disminución de la supervivencia libre de enfermedad. Los tumores con un
GAD1
expresión z-score pantalla mayor que +2 disminución de la supervivencia libre de enfermedad (mediana de 19,8 meses) con relación a los tumores que no han aumentado
GAD1
de expresión (mediana de 110,3 meses; p = 0,002). B.
GLUL
regulación a la baja en los adenocarcinomas de próstata se correlaciona con la supervivencia libre de enfermedad (mediana de 27,9 meses) con relación a los tumores sin
GLUL
downregulation (mediana de 110,3 meses; p = 0,006). C.
GAD1
la expresión de ARNm en líneas celulares de cáncer de próstata medido con PCR cuantitativa.
GAD1
expresión es detectable en líneas celulares resistentes a la castración NCI-H660, PC3, DU145 y, pero no las líneas celulares sensibles a andrógenos LNCaP y LAPC4. 18S rRNA se utilizó como estándar interno. ? C
t es la diferencia del ciclo de umbral de
GAD1
y el ciclo de umbral de 18S rRNA. ND: No detectado. D.
GAD1
sobreexpresión de ARNm en células claras carcinomas de células renales se correlaciona con la supervivencia global reducida. Los tumores con un
GAD1
puntuación z & gt; 2 pantalla disminución de la supervivencia global (mediana de 52,5 meses) con relación a los tumores que no han aumentado
GAD1
expresión (mediana de 80,6 meses; p = 0,01 ). Los tumores con un
GAD1
puntuación z & gt; 3 muestran una mayor disminución del tiempo de supervivencia media (mediana de 31,1 meses) con respecto al resto de los tumores (mediana de 78,4 meses; p = 0,002) guía
Como la expresión de genes NE ha sido implicado en el cáncer de próstata resistente a la castración, específicamente con respecto al aumento de la expresión de la decarboxilasa marcador NE aromático amino ácido (
DDC
) en la próstata resistente a la castración cáncer [21], se determinó si
GAD1
ARNm se enriqueció en el cáncer de próstata resistente a la castración humana. Curiosamente,
GAD1
expresión mRNA fue detectable solamente en líneas celulares resistentes a la castración (Fig. 2C), con niveles similares de expresión en la línea celular de cáncer del NCI-H660 NE y el PC3 y DU145 líneas celulares de adenocarcinoma. No expresión detectable de GAD1 fue identificado en cualquiera de las líneas celulares LNCaP y LAPC4 sensibles a andrógenos.
Debido a un informe de expresión de la proteína GAD1 en un subconjunto de carcinomas de células renales [45], que interrogado a un recientemente publicado estudio del subtipo de células claras de carcinomas de células renales [40] prestados a través del cBioPortal para determinar si existían características similares de supervivencia. Se identificaron 39 pacientes de un total de 499 pacientes (8%) cuyos tumores sobreexpresan
GAD1
ARNm con una puntuación z mayor que +2. Esta cohorte muestra una significativa disminución de la supervivencia global en relación con la población total del cáncer de células claras con una mediana de supervivencia de 52,5 meses frente a 80,6 meses (p = 0,01). entonces aislamos una cohorte de
GAD1
sobreexpresión de tumores (n = 18) con una puntuación z mayor que 3, y se identificaron una nueva disminución en la supervivencia global con una mediana de supervivencia de 31,1 meses frente a 78,4 meses (p = 0,002) (Fig. 2D). No hubo un efecto significativo de
GLUL
la expresión del ARNm de supervivencia de los pacientes en esta población.
Ensayo Desarrollo
El potencial de GABA que tienen importancia pronóstica en la identificación de subgrupos de pacientes con cáncer con una menor supervivencia nos llevó a desarrollar un ensayo para GABA que podría ser adoptada ampliamente e independiente de la instrumentación técnicamente difícil tal como espectrometría de masas y RMN. El esquema de la reacción de acoplamiento requerido para cuantificar GABA se proporciona en la Fig. 3. La preparación disponible en el mercado "GABase" de
Pseudomonas fluorescens
es una combinación de actividades enzimáticas ABAT y ALDH5A1 que oxidan GABA a través de una serie de dos reacciones en succinato, resulta en la reducción de la NADP a NADPH cofactor. NADPH se oxida entonces a NADP por diaforasa mitocondrial acoplando así la reducción de la resazurina en resorufina producto fluorescente. Aunque ALDH5A1 puede utilizar tanto NAD + y NADP como sustratos, NADP convencionalmente se ha usado como un cofactor con esta preparación de enzima [26].
La preparación GABase, una combinación de enzimas y ABAT ALDH5A1 de
P. fluorescens
convierte GABA a succinato a través de la conversión de alfa-cetoglutarato a glutamato y NADP a NADPH. Aunque NAD o NADP potencialmente pueden ser utilizados como sustratos por ALDH5A1, NADP se utiliza convencionalmente como un cofactor para esta preparación. semialdehído succínico (SSAL), un producto intermedio del metabolismo de GABA también es metabolizado por la preparación GABase. Diaforasa oxida el NADPH y reduce la resazurina a resorufina fluorescente. Aplicación de 2-aminoetil hidrógeno sulfato (2-AEHS), un inhibidor de ABAT se puede utilizar para determinar la contribución de SSAL a la señal total generada a partir de GABA y SSAL en los lisados celulares.
Optimización Ensayo
a fluorescencia NADPH actividad de la enzima de ensayo clásica [26] se utilizó como base para la optimización de los componentes individuales de una lectura basada en la resazurina de GABA. Cada componente se valora durante un intervalo de concentraciones, manteniendo todos los demás componentes constante (Fig. 4). Como era de esperar, el ensayo fue sensible a la resazurina, lo que demuestra un aumento de 5,9 veces en la señal sobre el fondo a una concentración de 6,25 mM.