Extracto
El antígeno (PSA) prostático específico en suero tiene una alta tasa de falsos positivos. Como un solo marcador, PSA proporciona información diagnóstica limitada. Una prueba de múltiples marcador capaz de detectar no sólo los tumores, sino también a los que potencialmente letales proporciona una necesidad clínica insatisfecha. Usando el sistema de expresión génica nanoString nCounter, se desarrolló una prueba de multiplex 20-gen basado en conteo de genes digital de las transcripciones de ARN en la orina como un medio para detectar el cáncer de próstata. En esta prueba, orina evacuada se centrifuga para sedimentar las células y el ARN purificado se amplifica para la hibridación a probesets preseleccionados. La amplificación de ARN de línea celular de ensayo apareció no introducir un sesgo significativo, y los recuentos coincidentes bien con los niveles de abundancia de genes, medida por microarrays de ADN. Para el análisis de datos, los recuentos individuales se compararon con la de microglobulina β2, un gen de mantenimiento. Se analizaron muestras de orina de 5 casos pre-operatorio y 2 no cáncer. a continuación, se recuperó información Patología. Las señales para la mayoría de los genes fueron bajos para los no-cáncer y bajas puntuaciones de Gleason, y 6/6 marcadores de cáncer de próstata conocidos fueron positivos en los casos. Un caso de Gleason 4 + 5 mostró, en cambio, las señales fuertes para todos los marcadores asociados con el cáncer, incluyendo CD24. Uno no mostró señales de cáncer también para los 6 marcadores de cáncer, y este hombre podría tener una alta cáncer no diagnosticado. Esta prueba multiplex ensayo de un producto de desecho naturales potencialmente se puede utilizar para la detección, detección precoz del cáncer y la estratificación del paciente. La información de diagnóstico se obtiene de las firmas de ARN que están asociados con los tipos de células de tumores de próstata
Visto:. Quek SI, ME Ho, Loprieno MA, Ellis WJ, Elliott N, Liu AY (2012) Un ensayo múltiple de Las transcripciones de ARN medir de cáncer de próstata en la orina. PLoS ONE 7 (9): e45656. doi: 10.1371 /journal.pone.0045656
Editor: Anthony WI. He aquí, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 12 Junio, 2012; Aceptado 21 de agosto de 2012; De publicación: septiembre 20, 2012
Copyright: © Quek et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer - Early Detection Research Network (NCI EDRN) CA111244 subvención. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores desean declarar la afiliación de uno de los co-autores, Nathan Elliott, a la empresa comercial nanoString Technologies. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Con una población que envejece, el número de casos de cáncer de próstata aumenta de manera espectacular en la siguiente dos decadas. La prueba de PSA en suero se utiliza para monitorizar el cáncer de próstata y muchos tumores se han detectado temprana a través de su uso. Sin embargo, casi ¾ de los hombres con PSA anormal llegar a ser negativo para el cáncer en la biopsia [1]. Por lo tanto, muchas de las biopsias realizadas son innecesarios. Además, algunos casos de cáncer son detectados por PSA. Mientras que el PSA es producido abundantemente por la próstata no es específica para el cáncer, aunque las formas moleculares de PSA como [-2] proPSA parecen mostrar un mejor rendimiento [2]. Se necesitan otros marcadores para el diagnóstico de cáncer definitivo. Además, se necesitan marcadores para diferenciar los cánceres de próstata que podrían ser letales de las que no lo son. Se requiere una prueba de varios marcadores. La tecnología nanoString nCounter puede medir directamente múltiples transcripciones de ARN en muestras biológicas, y la lectura es digital en el recuento de genes [3]. En el sistema nCounter, dos sondas de oligonucleótidos están diseñados para cada diana transcripción: un conjugado con biotina y el otro un código de colores con combinaciones de moléculas de colorante. Después de la hibridación solución, las transcripciones capturados se inmovilizan sobre una superficie revestida con estreptavidina, alineadas en un campo eléctrico, y se identifican por sus códigos de color individuales. Los códigos se cuentan con un dispositivo de microscopio /cámara y tabulados en Excel. Por razones técnicas, el número máximo de genes que pueden ser analizados por ejecución es justo por debajo de 800. La tecnología tiene una eficiencia de muestreo de aproximadamente 1% (es decir, 1.800 moléculas producidas 25 cargos), un rango de señal de ~ 25 a & gt; 50.000 cuenta, y buena reproducibilidad [3].
Nuestro objetivo es el desarrollo de esta tecnología nanoString para la detección del cáncer de próstata a través del análisis de orina emitida desde la próstata es drenada por el tracto urinario. Varios tipos de células incluyendo los enfermos puede ser diseminado o liberados de órganos a lo largo de este tramo. Para la probesets NCounter, los genes del cáncer de próstata informativos fueron identificados mediante análisis de transcriptómica de cáncer epitelial y tipos de células del estroma asociadas con el cáncer en contra de su respectiva contraparte no cáncer. Hasta la fecha, los tipos de células relevantes incluyen Gleason patrón 3 CD26
+ células cancerosas, Gleason patrón 4 CD26
+ células cancerosas, CD90
+ células estromales asociadas al cáncer para que contraste con CD26
+ células luminales y CD49a
+ células del estroma [4], [5]. genes marcadores seleccionados se incorporaron en la biblioteca de sondas cáncer de próstata nanoString para producir el nCounter conjunto de códigos. Recolección de orina representa la ruta menos invasiva de obtención de material de prueba, y al ser un producto de desecho, múltiples muestras pueden ser convenientemente recogidos y sin riesgo o estrés en los pacientes. Desde tipos de células de tumores tienen la expresión de genes distintos, su firma gen no debe estar presente en el cáncer no saludable. También existe la posibilidad de que debido a la histoarquitectura anormal de tumores, cánceres, así como células de cáncer asociados tienen más probabilidades de ser liberado en la orina de células en normal, especialmente en los casos en que la matriz extracelular está siendo destruido por derivado de tumor metaloproteinasas.
la prueba de orina PCA3 de Gen-Probe es uno actualmente basado en la presencia de células cancerosas en la orina para el diagnóstico de la enfermedad [6]. Mide un ARN no codificante (PCA3) a través de la captura del objetivo y la amplificación, detección quimioluminiscente de la sonda con lectura en unidades relativas de luz. Una evaluación multicéntrica de la prueba mostró un rendimiento analítico aceptable y una correcta clasificación temática (cáncer
vs
. Biopsia negativa) de poco menos de 70% [7]. Como marcador pronóstico, PCA3 no mostró ninguna relación significativa con la puntuación de Gleason, volumen tumoral, estadio, basado en 70 casos [8]. Otro estudio informó un enlace a estas características clínico-patológicas [9]. marcadores adicionales se pueden incluir el uso de la amplificación toda transcriptoma seguido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [10]. Otros tres marcadores (PSMA, HPN, GALNT3), además de PCA3, por ejemplo, podría distinguir el cáncer de benigna al 100% en un informe [11]. Multiplex PCR, sin embargo, no es una tecnología robusta y engorroso de realizar en un entorno de alto rendimiento. La tecnología nCounter no sólo proporciona una capacidad de análisis multi-marcador, sino también la facilidad de uso. Payton
et al
. [12] informó de la aplicación de nCounter para medir la abundancia de ARN de la leucemia mieloide aguda. Nuestro desarrollo de una prueba de multiplex (PCA3 más otros marcadores) está motivada por pruebas similares que se ofrecen a los pacientes con cáncer de mama para la estratificación [13].
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por la Universidad de Washington Junta de Revisión Institucional. Las muestras de orina anulados y muestras de tejido exceso de cirugías se obtuvieron de donantes con el consentimiento por escrito.
Selección ProbeSet
Los probesets NCounter fueron diseñados y sintetizados por nanoString Tecnologías [3]. De acuerdo con el diseño nanoString conjunto de códigos, cada par sonda se hizo complementario a una región 100-base del ARN diana. La sonda de captura se conjugó con biotina para la inmovilización sobre una placa revestida con estreptavidina después de la hibridación, y la sonda indicadora a una etiqueta con código de color para la detección de la señal. Veinte marcadores de genes fueron seleccionados (Tabla 1). De estos, seis eran los genes reportados por varios grupos para mostrar una mayor expresión en el cáncer de próstata: AGR2 (anterior gradiente de 2) [14], AMACR (α-metilacil-CoA-racemasa) [15], CRISP3 (proteína secretora rica en cisteína 3 ) [16], HPN (hepsina) [17], PCA3 [18], y ERG (
v
-ets eritroblastosis virus homólogo de oncogén E26, que se activa como resultado de la fusión de genes a la regulada por andrógenos
TMPRSS2
) [19]. B2M (microglobulina β2) se utilizó como control para la calidad y la cantidad de ARN. BRE (cerebro y reproductiva modulador TNFRSF1A órgano expresado), IL24, CCL3 [quimiocina (motivo C-C) ligando 3, proteína inflamatoria de macrófagos 1 subunidad MIP1α] se detectaron como hasta reguladas genes en células de cáncer de próstata [4]. ACPP (fosfatasa ácida prostática), AZGP1 (zinc α2-glicoproteína 1), KLK2 [(hK2) y KLK3], ANPEP (aminopeptidasa alanilo, CD13), CD24, CD9, DPP-4 (dipeptidil-peptidasa 4, CD26), MME (membrana metalo-endopeptidasa, CD10) se incluyeron como genes de células de próstata luminal con expresión diferencial entre el cáncer y no cáncer [20]. CD90v (variante CD90 BAD92446, y CD90 /thy1) se incluyó para las células del estroma asociadas con el cáncer [5], [21], y UPK3A (uroplakin 3A) para células de la vejiga [22].
Próstata líneas celulares de cáncer
Las líneas celulares de cáncer de próstata PC3, C4-2, y C4-2B se mantuvieron en medios RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10%. La transcriptomes de PC3 y C4-2 se informó anteriormente [23]. C4-2B se deriva de C4-2 para el crecimiento en el hueso (ratón) [24]. PC3 y C4-2 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). C4-2B [25] fue proporcionado amablemente por el Dr. Robert Vessella en el departamento de Urología.
La tabla muestra los valores del gen normalizadas en una serie de dilución de 10.000 1.000 100 10 células (3x),,,, 1 PC3 de
vs
. C4-2. Los genes se enumeran en la primera columna. La presentación de consulta de datos para los niveles de expresión de estos genes en C4-2 y PC3 se muestra a la derecha.
Colección de orina y Procesamiento
muestras de orina espontánea se obtuvieron de donantes. se requiere ninguna preparación especial antes de la colección de los pacientes. Dentro de 2 h, la orina (20 a 100 ml) se vertió a partir de frascos de recogida en tubos cónicos estériles de 50 ml y se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min. El sobrenadante se conservó (para el análisis de proteínas); el sedimento se resuspendió en la orina residual y se transfirió a tubos Eppendorf de 1,5 mL para & lt; 1 min en una microcentrífuga a velocidad máxima. No se añadió más de 10 l de tampón RLT (Qiagen, Valencia, CA) que contiene 1% β-mercaptoetanol. Los lisados celulares se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis (nCounter hibridación o la extracción de RNA y la amplificación).
Se muestra es el formato de Excel de los datos de NCounter sin amplificar
vs.
Amplificado (marcados con un * ) RNA de las células C4-2B y PC3. POS y NEG son probesets de control. B. recuentos señal obtenida de amplificar
vs
. amplificado (marcado con *) se comparan en la visualización del histograma. recuento génica para B2M se fija en 100 y todos los otros recuentos de genes se comparó con la de B2M de la misma muestra. Nota genes con expresión ausente, no se amplificaron.
La extracción de RNA y la amplificación
La orina ARN fue preparado con RNAqueous Micro (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, CA). Brevemente, se añadieron 90 l de solución de lisis a los 10 lisados de células mu l con mezcla vigorosa. Después, se añadió etanol Cincuenta l, y la mezcla se cargó en una Micro-Filter conjunto de cartucho. El cartucho se lavó, y el ARN se eluyó en 2 x 8 l de solución de elución de precalentado. Dependiendo de la concentración de ARN, se utilizó 3-5 l del ARN eluído (30-50 ng) para la amplificación de ARN usando RiboMultiplier Sense-amplificación del ARN (Epicentre, Illumina, Madison, WI). síntesis de la primera línea de cDNA, marcado oligómero terminal, la síntesis de la segunda cadena de ADNc,
in vitro
transcripción de ARN sentido y la digestión DNasa I se realizaron siguiendo el protocolo del fabricante en un termociclador. ARN amplificado se purificó utilizando RNeasy Mini (Qiagen) y se resuspendió en 30 l de agua libre de RNasa. ARN a partir de líneas de células se preparó con RNeasy Mini.
NanoString nCounter hibridación y Presentación de gen es importante
hibridación de la sonda se realizó con 4-5 l de lisados de células o 100-2.000 ng de ARN para 18 h en una máquina nCounter automatizado. Todos los genes en el conjunto de códigos nCounter se analizaron simultáneamente en la manera verdadera múltiplex. contadores de carga se normalizaron en primer lugar utilizando la media de seis sondas de control positivo pico-a internas para todas las muestras para dar cuenta de las diferencias sistemáticas entre los ensayos. Estos recuentos de control normalizado se compararon con el nivel de expresión de B2M (fijado en 100 por conveniencia). Para la presentación de datos, cada recuento de gen se indica en relación con la de B2M multiplicando un factor de 100 /(recuento de gen B2M). Se obtuvieron los datos NCounter antes de que se recuperó la patología del cáncer, es decir, cegado a la puntuación de Gleason y el estadio de los tumores. Estas características de patología fueron atribuidas a los números de casos en la sección de resultados.
La comparación de los valores de la señal sin procesar obtenidos para (a) PC3 y (b) C4-2 /C4-2B se muestran las células. El panel inferior (c) muestra la comparación de factor de cambio calculado a partir de los valores de los datos obtenidos.
La inmunohistoquímica
Serial-5 micras secciones congeladas de tumores fueron procesados para inmunotinción con anticuerpos a agruparse designación de antígenos (CD) de superficie celular u otros marcadores como se describe [20]. El anticuerpo monoclonal para CD24 (clon ML5, 01:50) se obtuvo de BD PharMingen (San Diego, CA), el anticuerpo monoclonal para CCL3 (4E7 clon, 01:50) era de Abnova (Taiwan), y el anticuerpo para AGR2 (P1G4 clon , 1:50) fue producido en nuestro laboratorio [26]. Las secciones fueron imágenes con inmuno Olympus BX41 (Melville, NY) equipado con cámara digital MicroFire (Optronics, Goleta, CA). Las imágenes fueron procesadas con Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, CA).
La pantalla de datos del histograma muestra los conteos de señal para P08-022N (azul) y P08-027N (magenta). Los altos cargos de B2M fueron excluidos para la visualización de datos. P08-022N no muestra señales de los marcadores de cáncer. Por el contrario, P08-027N muestra los recuentos de estos marcadores.
Resultados
Límite de Detección
ARN a partir de una serie de dilución de las líneas de cáncer de próstata y C4-2 PC3 fue preparado, y se hibrida a una biblioteca de sondas de seis genes seleccionados: KLK3, CD90 /thy1, AGR2, HPN, PCA3, UPK3A. Los contadores de carga se normalizaron, y los datos se analizaron mediante herramientas de software estadístico nanoString. Se encontró que los recuentos de fondo para ser & lt; 15 y el límite de sensibilidad fue ~20-30 células basadas en un gen que se expresa abundantemente como KLK3 en C4-2 (Fig. 1). Los recuentos se encontraban en buen acuerdo con el número de células: 22.100 KLK3 recuentos de 10.000 células; 2.400 cuentas para 1000; 290 recuentos de 100. En una base por célula, C4-2 mostraron una firma de 2,21 KLK3, 0,06 HPN, 0,01 UPK3A, 0 Thy1, 0 AGR2, 0 PCA3, mientras PC3 mostró una firma de 0 KLK3, 0 HPN, 0 UPK3A , 0 Thy1, 0,005 AGR2, 0 PCA3. La firma de C4-2 también podría expresarse en proporciones al número más pequeño recuento: 220 KLK3, 6 HPN, 1 UPK3A. La expresión coincidente con el obtenido por el análisis de microarrays de ADN.
Los conteos de señal para P08-024pre (Gleason 3 + 3), P08-029pre (Gleason 3 + 3, T2c), P08-025pre (Gleason 3+ 4), y P08-046pre (Gleason 3 + 4, T2c) se comparan con los de P08-022N. Tenga en cuenta no sólo los marcadores de cáncer, sino también las señales de los marcadores prostáticos luminales producidos (células cancerosas también producen estos marcadores). B. Dos secciones seriadas de la muestra tumoral 08-052A se tiñeron para CCL3 y expresión AGR2. La ampliación es 100x.
perfil de expresión génica se conservó con amplificación del ARN
Para evaluar la amplificación del ARN, PC3 y ARN C4-2B fueron amplificados y los productos resultantes hibrida con el nCounter 20- gen conjunto de códigos: ACPP, AGR2, AMACR, ANPEP, AZGP1, B2M, CD90v, BRE, CCL3, CD24, CD9, CRISP3, DPP-4, ERG, HPN, IL24, KLK2, MME, de PCA3, UPK3A. Higo. 2A muestra los datos de recuento de ARN obtenidos en formato Excel. Los conteos de señal (a partir de ARN de entrada ~2,000 ng) entre el material sin amplificar y amplificados fueron comparativamente equivalente para estos marcadores (Fig. 2B). La abundancia relativa se mantuvo también. Un sesgo notable no fue visto por cualquier transcripción. Por ejemplo, 2.000 ng C4-2B ARN producido 151,027 cuentas para B2M, 200 ng produjeron 13,335 conteos, y 1.700 ng amplificada ARN producido 120,849 conteos; para AMACR, las mismas cantidades de ARN producidos 114,542 conteos, 12.095 conteos, y los recuentos de 69,311 respectivamente. El resultado más significativo fue que los genes no expresados (recuentos & lt fondo; 25-30) no se han detectado, por ejemplo, el gen de células del estroma CD90v: 40 cargos, 2 recuentos, y 36 cargos, y IL24:23 recuentos, 3 cuentas , 26 cargos, respectivamente, para los tres cantidades de ARN.
La pantalla muestra los datos de los recuentos de alta señal obtenida, en especial la de CD24. B. CD24 inmunohistoquímica muestra las células cancerosas fuertemente manchadas en las muestras de tumor y 01-009E 02-034A. La ampliación es 40x.
La concordancia entre nCounter y DNA microarrays de perfiles
PC3
vs
. PC3 sin diferencia esperada y C4-2B
vs
. C4-2 con algunas diferencias fueron escogidos a propósito para la comparación. Para PC3, una fuerte concordancia (Pearson
r
= 0,78, Fig. 3) se encontró en los niveles de expresión entre los valores del gen y valores de la señal de la matriz. Una correlación más baja (
r
= 0,68) entre C4-2B y C4-2 podría atribuirse a los pocos genes expresados diferencialmente entre los dos, por ejemplo, C4-2B fue positiva para AGR2 y no C4-2. En general, la expresión pliegue diferencia de los 20 genes en PC3
vs
. C4-2B /C4-2 mostró una correlación de
r = 0,77
. Por lo tanto, nCounter podría producir un perfil exacto de genes expresados y su abundancia en tipos de células particulares.
La orina ARN Firma del cáncer no
El primer grupo de muestras de orina espontánea se obtuvieron de voluntarios de laboratorio . Los datos experimentales (no mostrados) demostraron que 1) preparación de la muestra fue adecuado en que no había degradación significativa de ARN, como se indica por las señales de púas en los controles nanoString en las muestras; 2) mayor volumen de orina no se producirá necesariamente más células; 3) Las señales fueron en general bajas y sin amplificación del ARN; 4) la sangre en la orina produce lecturas espurias. Además, la colocación de las células de cáncer de próstata PC3 y C4-2 en la orina durante 6 h produjo ninguna disminución significativa en el recuento de señal (datos no mostrados).
Uso de amplificación del ARN, una segunda cohorte de muestras [obtenido sin rectal digital examen (DRE)] se pusieron a prueba: P08-022N, P08-027N de los hombres sin diagnóstico previo de cáncer, que visitó la conciencia del cáncer de la Universidad de Wisconsin; P08-023, P08-024, P08-025, P08-029, P08-046 de los pacientes antes de la operación (rativa) de cáncer. El uso de un formato de histograma para la visualización de datos, todos los conteos de señal para los genes del cáncer de próstata fueron seleccionados en el fondo de P08-022N: AGR2 = 0,08 [(8 cargos, en relación con B2M = 100 (10.000 conteos)], AMACR = 0,46, CD90v = 0,02, CRISP3 = 0,25, ERG = 0,1, HPN = 0,04, PCA3 = 0,09 (Fig. 4, entrada de datos en azul). también hubo poca representación de próstata células (secreción) en la orina como se infiere de ACPP = 0,2, AZGP1 = 0,14, KLK2 = 0,06.
Esta visualización de datos compuesta ilustra la diferencia entre las puntuaciones de Gleason (cargos de B2M se incluyen).
A N Caso sospechoso
P08-027N (54 años), por el contrario, aparece un cáncer similar a la firma:. AGR2 = 0,61 (61 series), AMACR = 2,33, CRISP = 11.21, ERG = 0,76, HPN = 0,34, PCA3 = 0,53 (Fig 4, entradas de datos en magenta), en comparación con la firma no cáncer de P08-022N. con 6/6 marcadores de cáncer de próstata conocidos anotando por encima del fondo, una buena probabilidad de que el donante albergaba un tumor sin diagnosticar. Además, el cáncer regulen up- CD24 estaba en 7,98. También hubo un mayor número de genes para la próstata: ACPP = 1,4, AZGP1 = 0,91, KLK2 = 1,25
Firmas de Gleason baja Casos
Las señales de recuento obtenidos para P08-024pre (3 Gleason. 3; PSA = 9,3), P08-029pre (Gleason 3 + 3; T2c; PSA = 3,6; el volumen del tumor = 0,6 cc), P08-025pre (Gleason 3 + 4; T2c; PSA = 7; el volumen del tumor = 5 cc ), y P08-046pre (Gleason 3 + 4; T2c; PSA = 26; tumor volumen = 5 cc) en comparación con los de P08-022N no cáncer se muestran en la Fig. 5A. P08-024pre mostró AGR2 = 0,67, AMACR = 1.73, CRISP3 = 1,11, ERG = 0,91, HPN = 0,38, 0,59 y PCA3 = P08-046pre mostró AGR2 = 0,52, AMACR = 1,21, CRISP3 = 2.03, ERG = 0,66, HPN = 0,21, PCA3 = 0,81. Estos recuentos de genes para los seis marcadores de cáncer eran & gt; 3 veces por encima de la de fondo que cuenta en P08-022N no cáncer. Se encontró IL24 (0,80 y 0,43, respectivamente) hasta reguladas en el cáncer [4]. El aumento de CCL3 (3,69 y 3,08, respectivamente) podría indicar la presencia de células tumorales G4 como CCL3 fue uno de los genes regulados positivamente en G4
vs
. células tumorales G3 [4]. Higo. 5B muestra patrón Gleason 4 células tumorales tinción para CCL3 (y AGR2) en 08-052A muestra de tejido. Estas señales de genes también podrían ser aportados por los leucocitos. P08-029pre, que procedía de un pequeño volumen del tumor de 0,6 cc, mostró un aumento marginal (de 2 a 3 veces por encima del fondo) para estos genes a excepción de AMACR: AGR2 = 0,16, AMACR = 0,32, CRISP3 = 0,78, ERG = 0,28 , HPN = 0,12, PCA3 = 0,19. Por otro lado, P08-025pre mostró un recuento bajo de estos genes a excepción de: CRISP3. AGR2 = 0,06, AMACR = 0,16, CRISP3 = 2,27, ERG = 0,04, NPD = 0,03, PCA3 = 0,07
Firma del un caso de alto Gleason
Los conteos de señal para P08-023pre (Gleason 4 + 5; PSA = 5) fueron marcadamente más pronunciada (& gt; 70 veces por encima del fondo) en comparación con N: AGR2 = 10,26, AMACR = 32.61, 38.35 = CRISP, ERG = 17.15, HPN = 5,74, PCA3 = 10,8 (Fig. 6A). En particular, se obtuvo un recuento de CD24 muy alta (111,95). Un gran número de tumores de próstata muestre aumentó CD24 tinción [20], y se tiñó fuertemente patrón de Gleason 5 células se pueden ver en la Fig. 6B para las muestras de tumor en viraje y 01-009E 02-034A. Además, CD90v = 4,19 se detectó para las células del estroma asociadas con el cáncer. Parece que en este caso, más células de cáncer y otros tipos de células se dispersaron en la orina. Esto podría atribuirse a la pérdida de la integridad histoarchitectural en enfermedades avanzadas (que también podría conducir a niveles más altos de PSA sérico). Una pantalla de datos compuesto en la Fig. La figura 7 muestra la diferencia entre la señal de este tipo de cáncer de alto grado y los otros.
Discusión
El uso de la tecnología nanoString, hemos desarrollado una prueba de orina multi-marcador que potencialmente puede ser aplicado para la detección, detección y estratificación de los pacientes de cáncer de próstata. Las firmas de ARN obtenidos a partir de nuestra primera cohorte seleccionado al azar de las muestras clínicas de orina fueron prometedores en que podían detectar el cáncer en cuatro de cinco muestras pre-op a partir de los seis marcadores de cáncer de próstata conocidos incluyendo PCA3, la corriente de marcador basado en la orina. Más importante aún, P08-023pre de un paciente con enfermedad de alto grado mostraron recuentos altos de ARN para muchos marcadores. Con respecto al caso P08-027N sospechoso, más pruebas no se puede hacer como el paradero de esta de una sola vez de los donantes es desconocida.
La prueba de orina PCA3 muestra que las células de cáncer de próstata se encuentran en la orina. A diferencia de la prueba de PCA3, nuestro análisis de orina no requería un tacto rectal atento, aunque DRE podría mejorar las señales por medios mecánicos de inducir más la liberación de células de la glándula [7]. Por lo tanto, la prueba nCounter podría convertirse en una herramienta de detección de cáncer no invasivo. Con este fin, la prueba de una gran cohorte de hombres tomados de la población en general que no tienen diagnóstico de cáncer es de vital importancia como la expresión basal de los marcadores de cáncer de próstata seleccionados en la orina es desconocido.
Muchos de los marcadores de cáncer de próstata también se expresan por tipos de células no prostáticos, por ejemplo, AMACR en células de los túbulos renales [27], CRISP3 en el epitelio secretor de tracto genital masculino [28], ERG ARNm y proteínas en las células endoteliales (aunque fusión ERG es específica para el cáncer de próstata) [29], HPN en el epidídimo y la vesícula seminal (la proteína humana Atlas, http://www.proteinatlas.org), AGR2 en las células del túbulo urotelio y riñón (la proteína humana datos no publicados Atlas y) . PCA3 es una transcripción no codificante, su expresión no ha sido ampliamente estudiada por inmunohistoquímica como los demás. Aunque las firmas de genes de todas las formas de cáncer urogenital /enfermedades son en gran parte desconocidos, los seis conocidos genes de cáncer de próstata de AGR2, AMACR, CRISP3, ERG, HPN y PCA3 están en o por debajo de fondo, por ejemplo, en el cáncer de vejiga [30] . Es probable que cada tipo de malignidad /enfermedad urogenital daría lugar a una firma genética única. El presente conjunto de códigos nCounter está diseñado específicamente para el cáncer de próstata basado en la información disponible hasta la fecha. la orina después de la operación (con emparejado antes de la operación) es informativo para ver si todos los marcadores de cáncer (además de los específicos de la próstata) desaparecerían después de la cirugía. Para los pacientes tratados con radiación enfocado, los marcadores de cáncer, pero no ACPP, AZGP1, KLK3 se perderían si el tumor se realiza la ablación con éxito. Las preguntas adicionales incluyen: ¿cuál es la variación día a día, en su caso, en la firma; hace la firma tiene una asociación con la edad, como el PSA sérico; ¿cuál es el número de la normalidad
vs
. las células tumorales que se desprenden en la orina.
El probeset nCounter se puede ampliar para incluir varios genes más comunes (al lado de B2M) para propósitos de comparación recuento de genes, y otros marcadores para la detección de tipos de células específicas, tales como PTPRC /CD45 para las células blancas de la sangre, PECAM1 /CD31 para las células endoteliales, NCAM1 /CD56, B3GAT1 /CD57, NGFR /CD271 de elementos neurales, UMOD (uromodulin) para células renales (y UPK3A para células de la vejiga). diseño de la sonda no es perfecto, y puede ser necesario a veces nuevos probesets si los primeros mal realizado, por ejemplo, DPP-4 /CD26 en el actual conjunto de códigos. Tanto las células luminales y el cáncer están fuertemente inmunoti~neron para CD26, pero los conteos de señal para DPP-4 fueron en general bajas. Por la especificidad del cáncer de próstata, los hombres con biopsias negativas, hiperplasia prostática benigna, prostatitis, así como los hombres con cáncer de vejiga y riñón son probados. Especificidad se incrementa en el formato de multiplex de nCounter. Los marcadores seleccionados son aquellos con una mayor expresión en el cáncer de próstata tales como PCA3 y AGR2. Muchos estudios han demostrado recientemente que la puntuación de PCA3 orina podría proporcionar una herramienta adicional para los médicos que administran sus pacientes [31]. Bu
et al
. detectado en la orina AGR2 ARN mediante qRT-PCR incluyó a 31 casos (biopsia positiva) y 29 controles (biopsia negativa) para demostrar que la transcripción AGR2 orina superaron PSA en suero [32]. El conjunto de códigos nCounter no sólo contiene PCA3 y AGR2 sino también Probesets a otros marcadores informativos. En teoría, la biblioteca sonda podría contener todos los genes (incluyendo EST) identificados a través de análisis de la expresión génica como hasta reguladas en las células del cáncer de próstata.
La prueba nCounter es ideal para el seguimiento de los pacientes en la vigilancia activa. Estos son los hombres con un diagnóstico de cáncer, pero las características de la patología de su tumor sugerirían un cáncer no letal [33], [34]. Una firma inicial de ARN de orina para cada paciente se obtiene en el momento de la inscripción. Cada paciente puede ser controlado periódicamente por la prueba nCounter para determinar si los cambios en la firma de ARN se corresponden con progresión de la enfermedad medida por el tiempo de duplicación del PSA, Gleason, DRE, o evidencia de diseminación del cáncer.
Como una proyección herramienta, todos los hombres podría obtener una firma a los 40 años y ser seguido anual o bianualmente para los cambios en este perfil ARN orina basal. Un multiplex ELISA para medir las proteínas secretadas cáncer de próstata (por ejemplo, AGR2 y otros) podrían finalmente ser desarrollados para complementar la prueba de ARN. Por lo tanto, una correlación entre el recuento de ARN AGR2 y cantidades de proteína AGR2 de las mismas muestras tiene que ser llevado a cabo. sobrenadante de la orina se concentra por filtración giro para la medición de la proteína AGR2 por el sándwich desarrollado recientemente AGR2 ELISA [26]. Por lo tanto, alternativamente, todos los hombres pudieran ser examinados por AGR2 ELISA. Una señal AGR2 entonces motivo para pruebas nCounter para anotar la expresión de otros marcadores de cáncer de confirmación.
Por último, la prueba nCounter es versátil y puede incorporar marcadores de otros cánceres urológicos tales como la vejiga [30] y el riñón. Además, es posible incluir marcadores para cualquier enfermedad de los órganos del tracto urinario para que sea una prueba clínica de usos múltiples. La recogida y tratamiento de la orina es fácil de realizar y el costo es de bajo costo (estimado en & lt; $ 100 por prueba). Más importante aún, la salida de datos digitales de esta prueba puede ser fácilmente archivada y rastreado, y es fácilmente comprensible para los médicos y pacientes.
Reconocimientos
gracias Deanna González y Jennilee Kho para el paciente y el consentimiento recolección de orina, y Jennifer Noteboom para la recuperación de la información patología.