Extracto
Aplicaciones
Los nuevos agentes contra el cáncer que se dirigen a un solo receptor de la superficie celular, o hasta reguladas producto del gen amplificado, o gen mutado, se han encontrado con algún éxito en el tratamiento de cánceres avanzados. Sin embargo, los tumores de los pacientes sigue siendo finalmente progresar en estas terapias. Si fuera posible identificar un mayor número de vulnerabilidades dirigibles en el tumor de un individuo, múltiples objetivos podrían ser explotadas con el uso de agentes terapéuticos específicos, por tanto, capaces de dar las alternativas terapéuticas viables paciente.
Diseño Experimental
en este estudio exploratorio, hemos utilizado las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), incluyendo la secuenciación de todo el genoma (WGS), y siempre que sea posible, la secuenciación del transcriptoma conjunto (WTS) para identificar eventos genómicas y asociados los cambios de expresión en pacientes con cáncer avanzado.
resultados
WGS el tumor emparejado y muestras normales de nueve pacientes con cáncer avanzado y WTS en seis de los tumores de estos pacientes se completó. Un tratamiento del paciente fue basado en objetivos y las vías identificadas por NGS y el paciente tuvo una respuesta de corta duración PET /CT con una reducción significativa de su dolor relacionado con el tumor. Diseñar planes de tratamiento basados en la información obtenida a partir de NGS, se encontraron varios retos: NGS retrasos en los informes, la comunicación de los resultados a los participantes de fuera del estado y sus oncólogos que tratan, y la cadena de custodia manejo de muestras de biopsias frescas para la Ley de Mejoras del Laboratorio Clínico ( CLIA) la validación de dianas.
Conclusión
Mientras que el esfuerzo inicial fue un proceso más lento de lo previsto debido a una variedad de temas, se demuestra la viabilidad de la utilización de NGS en pacientes con cáncer avanzado de modo que los tratamientos para pacientes con tumores que progresan se pueden mejorar
Visto:. GJ Weiss, Liang WS, Demeure MJ, Kiefer JA, Hostetter G, Izatt T, et al. (2013) Un estudio piloto Usando Next-Generation Sequencing en los cánceres avanzados: Viabilidad y retos. PLoS ONE 8 (10): e76438. doi: 10.1371 /journal.pone.0076438
Editor: Patrick Tan, Duke-Universidad Nacional de Singapur Escuela de Medicina de Graduados, Singapur
Recibido: 24 Abril, 2013; Aceptado: 23 Agosto 2013; Publicado: 30 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Weiss et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionado por la Fundación Nacional de Investigación del cáncer (www.nfcr.org) y el Fondo de Lee T. Hanley para la Investigación del cáncer de páncreas (http://www.tgenfoundation.org/netcommunity/page.aspx?pid=1196). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los pacientes con cáncer avanzado opciones de tratamiento a menudo de escape. Pueden participar en II de los ensayos de nuevos fármacos anticancerosos las fases I o si cumplen con los estrictos criterios de elegibilidad normalmente y tener acceso a los centros que se pueden administrar fármacos en investigación. Cuando los pacientes participan en estos ensayos, los nuevos agentes, en promedio, dan tasas de respuesta de entre 5% y 10% en la Fase I de establecer y 12% en un entorno de fase II [1] - [3]. Los pacientes también tienen una opción para la mejor atención de apoyo en un intento de hacer frente a sus síntomas.
Recientemente, ha habido una explosión de interés en el desarrollo de nuevos agentes contra el cáncer que están más específico, por lo general en contra de un receptor de la superficie celular o una hasta reguladas o amplificados producto génico o gen mutado. Este enfoque se está reuniendo con cierto éxito (por ejemplo trastuzumab contra HER2 /
neu
en células de cáncer de mama, erlotinib contra el cáncer no microcítico de pulmón de células EGFR mutante, etc.). Sin embargo, los tumores de los pacientes sigue siendo finalmente progresar en estas terapias, ya que contienen múltiples anomalías genómicas, y dirigidas a un único anormalidad no es suficiente para prevenir la progresión. Si fuera posible identificar un mayor número de objetivos en el tumor de un individuo, donde existen agentes que potencialmente podrían dirigirse ellos, varios objetivos podrían abordarse mediante agentes terapéuticos específicos, y tal vez reducir el riesgo de progresión. En última instancia, la mayoría de los investigadores imaginan la utilización de varios agentes para golpear objetivos múltiples presentes en el tumor de un paciente. Sin embargo, la identificación y aplicación de las terapias apropiadas sigue siendo un desafío.
previamente realizó un estudio prospectivo, multicéntrico, utilizando perfiles moleculares de los tumores por inmunohistoquímica (IHC), hibridación in situ fluorescente (FISH), y microarrays de ADN para encontrar dianas de fármacos potenciales y tratamientos seleccionados en consecuencia [4]. Sesenta y seis de los 84 pacientes fueron tratados con base en el perfil molecular del tumor. Para 18 de estos 66 pacientes, el tratamiento derivado de perfiles moleculares, dio lugar a una tasa de supervivencia libre de progresión ≥1.3, lo que sugiere un beneficio de tratamiento. Las características moleculares apoyó la indicación de un nuevo tratamiento no prevista inicialmente por el investigador, en una población de pacientes que fue fuertemente pretratados y refractarios a los tratamientos anteriores.
Para aprovechar este paso inicial hacia la terapia personalizada, hemos utilizado de próxima generación de tecnologías de secuenciación (NGS), incluyendo la secuenciación de todo el genoma (WGS), y siempre que sea posible, la secuenciación del transcriptoma conjunto (WTS) para identificar eventos genómicos asociados y los cambios de expresión en pacientes con cáncer avanzado. Utilizamos WGS para secuenciar ADN biopsia del tumor y se correspondía con el ADN germinal a partir de nueve pacientes con cáncer avanzado para identificar los cambios somáticos clave. El ADN de la línea germinal se tomaron muestras de las células blancas de la sangre y el ADN del tumor se tomaron muestras de las células tumorales. Para seis de estos pacientes, que también se utiliza WTS para secuenciar ARN total aislado de tumor, junto con los controles de ARN total de no paciente. Dado que los perfiles de expresión génica difieren entre los tipos de tejido, y el tejido sano no podía ser una biopsia del paciente para la comparación, comprado comercialmente RNA normal para el tejido correspondiente se comparó con ARN aislado de tumor. A continuación, evaluaron los cambios de transcriptómica y genómica realizó análisis integrados [5] con los datos WGS para identificar posibles dianas druggable. Aquí, demostramos la viabilidad y poner de relieve los retos de la utilización de tecnologías NGS de manera prospectiva en pacientes con cáncer avanzado.
Métodos
Ética Declaración
El estudio se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional occidental (Protocolo WIRB®#20101288) (NCT01443390). escrito el consentimiento informado se obtuvo de los pacientes, incluido el consentimiento por escrito para la publicación de los datos clínicos e imágenes.
Objetivos del estudio
El objetivo principal de este estudio fue identificar el mayor número de cambios genómicos como sea posible en cánceres avanzados, a fin de ampliar la gama de posibles objetivos de acciones concretas con las terapias que eran comercialmente disponibles o ensayos clínicos. El objetivo secundario fue desarrollar un proceso de flujo de trabajo de la biopsia del tumor al tratamiento; de hecho, este proceso debe ocurrir en un plazo de tiempo lo suficientemente corto como para que los pacientes puedan beneficiarse de esta información adicional en el desarrollo de un plan de tratamiento. Esto incluyó la medición del tiempo de biopsia para la terminación y análisis final de NGS en muestras tumorales del paciente y no tumorales, el examen de la frecuencia con la que se obtiene la secuencia de datos utilizable como una función de la participación por ciento tumor en la biopsia, y la evaluación de la correlación entre los anti El tumor actividad de los tratamientos identificados por NGS.
Diseño del estudio
La justificación de este estudio es que NGS podría utilizarse para identificar no sólo una, sino muchas alteraciones genómicas que podrían ser objeto utilizando potencialmente disponibles terapias en pacientes con cáncer avanzado. Este solo centro, prospectivo, de un solo brazo estudio piloto se llevó a cabo en pacientes con cáncer avanzado que progresaron en la terapia sistémica estándar o si su tipo de tumor no tenían una terapia sistémica estándar. Este estudio fue de naturaleza exploratoria. Para participar, los pacientes deben haber sido la edad ≥18 y dispuesto a someterse a una biopsia quirúrgica o procedimiento para obtener tejido, a menos que un tumor congelado obtenido menos de 8 semanas antes estaba disponible. Los participantes interesados fueron informados de que la obtención de una nueva biopsia puede no ser una parte de la atención habitual del paciente por su malignidad. Otros criterios de elegibilidad incluyeron: datos de laboratorio básico que indique la reserva aceptable de la médula ósea, el hígado y la función renal, el estado funcional de Karnofsky ≥80%, y la esperanza de vida & gt; 3 meses. Se dejó Participación en otro ensayo clínico con el tratamiento antes de o durante la participación en este estudio. criterios de exclusión principales fueron metástasis sintomáticas o no tratados sistema nervioso central (SNC), infecciones activas conocidas que requieren terapia intravenosa antimicrobiana, las mujeres embarazadas o en periodo de lactancia, o un tumor que era inaccesible para una biopsia. También se excluyeron los individuos con infección por VHB conocida, VHC, o infección (s) del VHC que requiere terapia antiviral ya que esta población es a menudo excluidos de los ensayos clínicos primera vez en seres humanos oncología; lo que limita las posibilidades de posibles opciones de tratamiento para este grupo. Todos los pacientes elegibles tenían sangre entera y una muestra de tumor fresco congelado recogido y enviado para su análisis. Estos métodos e información sobre la secuencia de datos en bruto se describen adicionalmente en la sección complementaria. Al principio nos anticipamos aproximadamente 100 días a partir de la biopsia del tumor fresco a la finalización de NGS. Después se realizó un análisis de NGS, los principales investigadores examinaron los resultados, y cuando sea clínicamente apropiado, elegir objetivos para la validación de un (Clinical Laboratory Improvement Amendments) de laboratorio certificado por CLIA. Durante cinco muestras de pacientes con bajo porcentaje de tumores, se añadió la secuenciación del exoma para identificar posibles dianas viables. Después de la validación de dianas, se presentó un informe al tratamiento de un oncólogo con las recomendaciones de tratamiento posibles, que pueden ser utilizados en su /su discreción.
Resultados
Características de los pacientes
A todos los pacientes fueron vistos y evaluados para su inclusión en este estudio entre octubre de 2010 y febrero de 2012 en un solo centro. Para evitar demoras de flujo de trabajo en las máquinas disponibles NGS, la detección de los pacientes fue espaciados para no permitir más de dos candidatos potenciales al mes. A medida que el centro de la realización del estudio recibe referencias de todo el país para los estudios de fase 1, algunas personas llegaron de fuera del estado para una selección y evaluación programada consentimiento, y después de la confirmación de la elegibilidad, procedieron con una biopsia del tumor fresco dentro de las 24 horas. Esto se hizo para la conveniencia del paciente para permitir el viaje de vuelta a casa poco después de la evaluación inicial. Se hizo crear problemas logísticos con el seguimiento y la comunicación de los resultados de vuelta al médico tratante. Para los pacientes que viven a poca distancia, el proceso de inscripción fue similar, aunque la biopsia no siempre estaba prevista para el día siguiente.
La Tabla 1 muestra las características de los 11 pacientes que dieron su consentimiento para este estudio. La mayoría de los pacientes eran hombres, con una edad media de 59 años (rango, 20 a 69 años). Es de destacar que, en el momento del consentimiento, todos menos un paciente (paciente 9) habían progresado en al menos un tratamiento sistémico previo para la enfermedad avanzada (3, rango 0-8). Paciente 9, con diagnóstico de carcinoma de adenoescamosa avanzado de páncreas, se sometió a la terapia sistémica y posteriormente evolucionó luego de NGS resultados estuvieron disponibles.
Figura 1 se detallan las Normas Consolidadas de comunicación de los ensayos diagrama (CONSORT) que demuestra el flujo de los 11 pacientes que dieron su consentimiento y se evaluaron para el estudio. Dos pacientes (pacientes 1 y 5) fueron sometidos a biopsia del tumor y tenía ADN suficiente disponible para el análisis de NGS, debido a la falta de una adecuada celularidad tumoral observada en las muestras recogidas (Tabla 1 y Tabla S1). Para los nueve pacientes restantes con cáncer avanzado, se realizó WGS en tanto el ADN del tumor, así como el ADN germinal aislado de la sangre entera con el fin de identificar tanto cambios somáticos; respectivamente. WGS métricas y estadísticas de resumen para cada uno de los nueve pacientes se muestran en la Tabla S1. Seis pacientes tenían ARN del tumor disponibles, que se analizaron con éxito por WTS. Durante los últimos tres pacientes (pacientes 9, 10 y 11) matriculados en este estudio, se realizó un análisis biológico más involucrados de los datos genómicos reunidos para discernir las vías biológicas notables que pueden ser afectados en el cáncer del paciente para identificar posibles dianas terapéuticas.
* - enriquecimiento de análisis prospectivo se llevó a cabo antes de discutir los resultados con el paciente y el tratamiento de un oncólogo en los últimos tres pacientes incluidos
de los 9 pacientes con WGS y /o exoma. secuenciación y /o análisis WTS disponibles, hemos identificado posibles objetivos y las vías para todos, pero el paciente 2 (88,9%) (Tabla 1). Para nuestros objetivos secundarios, el tiempo medio de biopsia para la terminación y análisis final de NGS en muestras tumorales de pacientes y no tumorales fue de 91 días (rango 46-243 días). Las principales razones de los valores atípicos eran o problemas con los instrumentos de secuenciación o un resultado de bajo porcentaje de tumores en el espécimen que requieren la secuenciación del exoma para identificar posibles dianas viables. Para el protocolo utilizado, la secuenciación del exoma requiere más ADN de entrada (3 ug) que WGS (1 ug) y proporcionó información sobre la codificación de las regiones y de acompañamiento regiones no traducidas del genoma. En siete de los casos, las muestras de tumores iniciales fueron sometidos directamente a nuestra institución para la evaluación de la patología tumoral de manera que el porcentaje podría ser comprobada. El contenido mínimo de la celularidad tumoral para el éxito de NGS fue del 30% (Tabla 1).
secuenciación del genoma entero
En el estudio piloto completa, la secuenciación se realizó mediante la tecnología de síntesis y 100 pb química de acabado emparejado . Hemos generado más de 19 mil millones totales lee de WGS para coberturas promedio mapeadas que van desde 17 × 71 × a. SNP (polimorfismo de nucleótido simple) llamada se realizó mediante dos llamadas separadas para reducir la tasa de falsos negativos. Para evaluar la calidad general de los datos de variante, SNPs línea germinal fueron llamados y la transición a transversión y [6] Se calcularon los coeficientes de concordancia 129 dbSNP (Base de Datos de polimorfismo de nucleótido simple). Para todos los pacientes, las relaciones de transición /transversión estaban en el rango de 02/01 a 02/24, y la tasa de concordancia dbSNP 129 oscilaron desde 86,0 hasta 89,4 (Tabla S1). A partir de estos análisis no se detectaron sesgos con respecto a las sustituciones de nucleótidos, los SNPs identificados fuertemente correlacionar con variaciones genéticas comunes, y se realizó variante de alta calidad de llamada. Para todos los pacientes hubo un total de 5.778 eventos de codificación genómicas identificadas (mediana = 15,5). El paciente 2, una mujer no fumadora con adenocarcinoma de pulmón metastásico, albergaba la mayoría de estos eventos genómicas que codifican (n = 4,137) que incluye una mutación TP53 no sinónima (G226V) con 100% de alelo mutante expresión específica, y un 8q intersticial CNV (número de copias variación) que abarca ganar MYC. Paciente 11, una hembra con carcinoide bronquial metastásico, tenía los sucesos genómicos menor cantidad de codificación (n = 4). secuenciación Exoma se realizó en muestras de tumores de pacientes 6, 7, 8, 10, y 11 con las métricas proporcionados en la Tabla S1. Los resultados de la CNV se proporcionan en la Tabla S2.
secuenciación del transcriptoma Total
WTS se llevó a cabo en seis pacientes (Tabla 1 y Tabla S1) y ARN correspondiente tejido normal no paciente basada en el origen del tumor primario . Dado que el tejido normal adyacente no se recogió de los pacientes durante la biopsia, el ARN total para el tejido relevante se adquirió comercialmente. bibliotecas de ARN se prepararon para estas muestras y se secuenciaron con bibliotecas de ARN tumor respectivos. Tumor de datos WTS se comparó con los datos correspondientes de WTS tejido normal para identificar los cambios de expresión en las biopsias de tumores. Cada uno de los tumores analizados tenían genes con los cambios de expresión significativos con q. & Lt; 0,05, corregido para múltiples ensayos (mediana del número de genes expresados diferencialmente 1.731, rango 495-2,323) (Tabla S3)
Copy Number Variación
amplificaciones y deleciones se detectaron mediante la identificación de regiones en las que había un delta (+/-) en log2FC (como se describe anteriormente) de más de 2 desviaciones estándar de la mediana log2FC través del brazo del cromosoma siendo interrogado. Delta se calcula restando los puntos finales de aproximadamente 1 MB de ventana deslizante. Además, las regiones detectadas tenían que ser menos de 14 MB de longitud para ser marcado como un evento focal. Tabla S2 contiene todos los eventos de coordinación que contienen genes cósmico por los pacientes 2, 3, 4, 7 y 8. Los pacientes 9 y 11 no tiene eventos focales que contenían genes cósmico. Los pacientes 6 y 10 no tenían ninguna eventos focales (ver Tabla S3 y S7 Figura)
prospectivo Enriquecimiento Análisis
En los últimos tres pacientes incluidos, se realizó un análisis de enriquecimiento del WGS y /o exoma secuenciación y WTS. Los detalles de cada paciente individual son los siguientes:
Paciente 9 carcinoma adenoescamosa del páncreas
De los nueve pacientes que tenían tumores analizados por NGS, 9 pacientes (cáncer de páncreas adenoescamosa) es el único individuo cuyo tratamiento se basa en los objetivos y las vías identificadas por NGS. Sólo dos tipos de datos disponibles para el análisis en tejidos de este paciente, las variaciones de nucleótido único (SNV) y WTS. No se observaron regiones significativas de alteración en los datos de número de copias.
Las 20 mejores mapas canónicos enriquecidas en los datos WTS se muestran en la Figura S1. mecanismos biológicos comunes asociados con estos 20 primeros mapas enriquecidos incluyen la adhesión, la remodelación del citoesqueleto y los procesos inmunes /quimiotaxis. Tales enriquecimientos implican una activación generalizada de la remodelación de la matriz extracelular que puede estar relacionado con el fenotipo de este tipo de tumor raros. Dos mapas de la nota en los veinte primeros mapas vía enriquecimientos son mapas de cáncer de páncreas específicos construidos específicamente para los procesos de captura alterados en el cáncer de páncreas. Estos mapas, titulado 'interacciones tumor-estroma en el cáncer de páncreas "y" Papel de las células estrelladas en la progresión del cáncer de páncreas ", destacan en mayor interacción posible del estroma /ECM dentro de este tumor. "La función de las células estrelladas en la progresión del cáncer de páncreas 'mapa se presenta en la Figura S2.
Una observación adicional de la inspección de los datos superpuestos en WTS mapas de señalización es la posible participación de TGF-beta mediada epitelial a mesenquimal en este tumor. El "Reglamento de desarrollo de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) 'mapa (Figura S3), pone de relieve los datos WTS superpuestos como se representa por los termómetros lado de los nodos en el diagrama. Un termómetro rojo significa que el gen se sobreexpresa y azul significa que el gen está underexpressed.
Dos ligandos, TGF-beta 1 y TGF-beta 2 son ambos upregulated junto con su receptor afín, TGF-beta receptor tipo II. La regulación al alza combinada de factores de crecimiento /puntos pares de receptores de potencial importancia de este par de señalización de ser "activa" en este tumor. La evidencia adicional que une la señalización de TGF beta de EMT se destaca por la regulación al alza de los factores de transcripción E2A Lef-1, y TCF8. Estos factores de transcripción funcionan aguas abajo de TGF beta para señalar para la EMT. Otra prueba de su activación es la baja regulación de la E-cadherina, que es un sello distintivo de la EMT fenotipo. La presencia del fenotipo EMT sería presagiar relativa resistencia a muchos agentes terapéuticos y significar un tumor metastásico.
Además inspección de los datos WTS revela la sobreexpresión de posibles objetivos para la intervención. Como se mencionó anteriormente, la regulación de par ligando /receptor sugiere la activación y regulación al alza de neuropilina 1 y VEGF-A. Esto puede representar la vulnerabilidad a las terapias anti-angiogénicas. objetivos adicionales que se upregulated son ESR1, ABL1, GART, VDR y ErbB2.
tumorales del paciente de 9 tenían mutaciones en KRAS notables (G12R) y PIK3CA (R93W). Ambas mutaciones activar la señalización para el crecimiento y la proliferación. Estas mutaciones coexistentes sugieren que combinado la orientación de MEK /ERK y PI3K /AKT para el tratamiento de este tumor sería más eficaz que la orientación sólo una de las dos mutaciones. Mientras que la mutación KRAS fue validado mediante pruebas CLIA, la región que contiene la mutación PIK3CA no era parte de una prueba comercial y por lo tanto no confirmado en condiciones de CLIA. Otro prominente SNV es en el gen RAD50 (Q737R), que codifica para una proteína que está implicada en la reparación del ADN de doble filamento romper. función defectuosa de RAD50 se ha relacionado con la sensibilización a cisplatino y aumento de la sensibilidad a los inhibidores de PARP [7].
El paciente fue tratado inicialmente con cisplatino y gemcitabina y luego progresó. En ese momento los resultados WGS /WTS llegaron a estar disponibles y el paciente inscritos sobre una fase I PI3K inhibidor y MEK inhibidor combinación estudio. El paciente tuvo una respuesta de corta duración PET /CT en este estudio (Figura 2) y esto también fue acompañado por una disminución dramática en su dolor de moderado a ninguno (4/10 a 0/10 en la escala visual de dolor).
18-FDG tomografía por emisión de positrones /tomografía computarizada (PET /CT) imágenes que muestran (a) corte axial al inicio del estudio y (B) corte axial después de 30 días de tratamiento. La flecha amarilla que apunta a dos ganglios linfáticos de hipermetabolismo en B y C. En B, el valor de captación estándar (SUV) de los ganglios linfáticos de la izquierda es 9,8 y el ganglio linfático de la derecha es de 7,5, mientras que el SUV del nodo linfático izquierdo es de 3.1 y el ganglio linfático de la derecha es 3,5 en C.
paciente 10 metastásico carcinoma papilar de células renales
los datos para el análisis de este paciente consistió solamente en SNVS y WTS como ninguna se identificaron número de copias aberraciones. Las 20 mejores mapas canónicos revelan temas comunes en todo el ciclo celular, los cromosomas /función de cabezal, la adhesión celular, y la transición de EMT. Una de las rutas de la nota es el "ciclo celular conjunto del husillo y el cromosoma separación" mapa (figura S4). Un número de genes implicados con este mapa son upregulated en este tumor, incluyendo el AURKB objetivo druggable (log2ratio = 6,3). El conjunto de eje y la separación de los cromosomas son vitales para la división celular con un número de dianas de medicamentos oncológicos asociados con este proceso. Dos SNVS también están presentes en los genes (STAG1 (F802Y) y NUMA1 (L1400P)) en esta vía y sugieren la importancia de estas alteraciones en este tumor.
Otras vías con significación estadística que contienen observaciones importantes relativas a la se tomó nota de la biología de este tumor y a las posibles opciones terapéuticas. El 'EGF y dependiente de HGF estimulación de la metástasis en el cáncer gástrico "mapa reveló la regulación positiva de HGF y su receptor MET. Este mapa se construye a partir de la información específica del cáncer gástrico, aunque muchos tipos de cáncer comparten vías de señalización similares y moléculas. Tener tanto el receptor y el ligando upregulated sugiere un mecanismo de señalización autocrina. Como se muestra en la Figura S5, alfa-6 /beta-4 componentes integrina son upregulated y función en concierto con MET para activar la transducción de señales aguas abajo. La posible implicación de MET es una observación importante ya que actualmente es un objetivo atractivo de fármacos oncológicos.
inspección adicional de los datos reveló la presencia de alteraciones en el nivel de ARN de los posibles objetivos farmacológicos. El ligando de señalización angiogénica ARNm VEGFA, TOP2A, y las adn son upregulated. Estos tres genes son dianas de agentes oncológicos actuales. Además, MGMT mRNA, que es un gen de reparación del ADN que transmite resistencia a la temozolomida, es downregulated, lo que sugiere la temozolomida como opción de tratamiento. Por último, este tumor tiene un SNV en el gen que codifica APTX para una proteína implicada en la reparación del ADN que podrían transmitir sensibilidad al irinotecan [8].
Paciente 11 metastásica del cáncer neuroendocrino bronquial
Tres tipos de la información genómica disponible para el análisis de los tejidos de esta paciente incluían WTS, CNV (Tabla S2), y los datos del SNV. Sólo cuatro SNVS en dos genes, KRT4 y GOLGA6L10, fueron identificados, lo que resulta en los datos de la CNV WTS y conducir la narración biológica de este tumor. Figura S6 muestra las 20 mejores mapas vía canónica de enriquecimiento de análisis de datos de pacientes de 11. Los temas representados por los títulos de estos mapas no son tan concisa como en el paciente 10, pero una vez más, observamos citoesqueleto y mapas adhesivas dominando. Es de destacar que no hay ciclo celular o cromosómicas mapas céntricas se enriquecen, posiblemente, lo que sugiere un tumor mínimamente mitótico. En cuanto a los objetivos de genes, hubo varios genes sobreexpresados específicos, incluyendo KIT, PDGFRB, EGFR, FGFR1 y SPARC. Cabe señalar que no hay variaciones del número de copias se observaron en estos genes.
Discusión
En este estudio piloto exploratorio, nos basamos en nuestra experiencia previa con el perfil molecular prospectivo. Como se trata de una tecnología emergente, no se esperaba y desafíos imprevistos encontrados durante el transcurso de la realización del estudio. La población de pacientes evaluados en este estudio piloto había avanzado cáncer con progresión de la enfermedad y, por desgracia, por dos individuos, los resultados estuvieron disponibles después del deterioro clínico significativo o muerte (pacientes 2 y 3). Mientras que el estudio estaba en curso, el coste de la secuenciación siguió disminuyendo, y herramientas mejoradas para WTS y la integración del WGS con WTS surgió. Por lo tanto, WTS se añadió de forma prospectiva a partir paciente 7 en adelante. Para el paciente 2, WTS era factible ya que no había tumor disponible para la extracción de RNA. La información adicional de WTS para el paciente 2 se transmite a continuación el oncólogo tratante. Además ADN insuficiente tumoral (pacientes 1 y 5), la tecnología y el flujo de trabajo de procesamiento de muestras mejorado en el que pudimos incorporar la secuenciación del exoma (pacientes 6, 7, 8, 10, y 11) cuando el porcentaje de contenido tumor era inadecuada de la biopsia muestra . Esto, añadido a la secuenciación y el análisis de tiempo total para estos pacientes (Tabla 1) [9] - [12]. Tenga en cuenta que WGS era la modalidad preferida durante la realización de este estudio. WGS proporciona una mejor resolución de número de copias y la capacidad de identificar reordenamientos tales como inversiones que abarcan un solo exón de un gen supresor de tumores. Con este tipo de inversión, no hay desplazamiento del marco y el gen supresor de tumores se expresa en niveles normales. Sin isoforma o análisis de empalme, este cambio se puede perder por IHC, ya que todavía se expresa a nivel de proteínas, a pesar de que la proteína es inactivo debido a los aminoácidos que faltan [5]. Reconocemos que la secuenciación del exoma proporciona una cobertura más profunda para identificar mutaciones de codificación. Las estrategias más recientes pueden capturar lo mejor de ambos grupos de trabajo y secuenciación del exoma por incluyen insertar largo de todo el genoma de poca profundidad y la secuenciación del exoma de profundidad para capturar reordenamientos complejos y alcanzar una mayor sensibilidad para captar las mutaciones de codificación.
Otro desafío dado cuenta después de que el estudio fue en curso era la cadena de custodia para el manejo de las muestras de biopsias frescas. Debido a que los tumores analizados iniciales no fueron sometidos a procesamiento de ADN /ARN en un laboratorio de CLIA, la validación posterior planificada de los objetivos de la misma muestra fresca no pudo ser verificada por una prueba certificado por CLIA. Además, el retraso de aproximadamente 2 semanas para la validación de la CLIA, junto con un tiempo medio de 91 días de NGS se traduce en estar disponible era problemático. Para el tumor del paciente de 9, el (G12R) mutación KRAS fue validado mediante una prueba certificado por CLIA. Para todos los pacientes excepto uno (paciente 2), un objetivo potencialmente druggable se identificó con una terapia, ya sea comercialmente disponibles o en fase de investigación. Para los pacientes 11, WGS no dió un objetivo, y sólo WTS ayudó a identificar objetivos druggable. La integración del análisis epigenomics podría también factores como una capa más a facilitar la identificación de dianas druggable con las terapias existentes.
Incluso si no hay retrasos técnicos o lógicos en NGS, la interpretación y aplicación de esta información a la práctica clínica es lleno de incertidumbre. No todos los SNVS identificados por WGS tendrán un efecto perjudicial sobre la función de la proteína. Así que la mera identificación de SNVS, incluso cuando validado en una prueba certificado por CLIA, no garantiza que la orientación que dará lugar a una estabilización o disminución de la carga tumoral. También debemos reconocer que la heterogeneidad intratumoral y la evolución clonal puede complicar nuestras estrategias de tratamiento para los pacientes ideados en base a los resultados de la biopsia del tumor único [13], [14].
Durante la realización de este estudio, nos dimos cuenta de que con un plazo medio de 91 días para informar de los resultados de NGS, los pacientes con un estado funcional excelente y baja carga tumoral son más propensos a tener objetivos identificados que se puede actuar. Con la mejora de la eficiencia que disminuyen el tiempo para obtener resultados NGS y costos razonables, podemos imaginar NGS se puede aplicar de manera más global a los pacientes con cáncer avanzado. Incluso durante el tiempo relativamente corto que este estudio se inscribe, se observó una mejora significativa en la secuenciación de análisis y redujo los costos de reactivos. Otros informaron recientemente resultados bastante impresionantes con tasa de respuesta del 27% a las terapias dirigidas disponibles utilizando la tecnología de secuenciación más finita para identificar objetivos druggable [15]. En general, se demuestra la viabilidad de la realización de las tecnologías NGS de manera prospectiva en pacientes con cáncer avanzado. Prevemos que en el futuro no muy lejano tecnologías NGS se harán más fácilmente disponible para su incorporación en el cuidado rutinario de los pacientes oncológicos avanzados.
Conclusión
Mientras que el esfuerzo inicial fue un proceso más lento de lo previsto debido a una variedad de temas, se demuestra que NGS puede ser utilizada en situaciones clínicas, ya sea este enfoque dará lugar a un beneficio real y consistente paciente está aún por demostrar.
Información de Apoyo
archivo S1.
información complementaria
doi:. 10.1371 /journal.pone.0076438.s001 gratis (DOCX)
Figura S1. página 9 de datos de pacientes WTS mapas canónicos. Esta figura ilustra los 20 mejores mapas canónicos enriquecidas en los datos WTS para el paciente 9.
doi: 10.1371 /journal.pone.0076438.s002 gratis (TIFF)
figura S2.
Papel de las células estrelladas en la progresión del cáncer de páncreas. Esta figura ilustra el papel de las células estrelladas en la progresión del cáncer de páncreas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0076438.s003 gratis (TIFF)
Figura S3. Reglamento de Desarrollo de Red de transición epitelial a mesenquimal. Esta figura ilustra la posible participación de TGF-beta mediada epitelial a mesenquimal
doi:. 10.1371 /journal.pone.0076438.s004 gratis (TIFF)
figura S4. y mapa canónica seleccionada para el Paciente 10: conjunto de husillo ciclo celular y la separación de los cromosomas. Esta figura ilustra el montaje del ciclo celular husillo y la separación de cromosomas, incluida la meta regulada al alza y druggable, Aurora-B (AURKB)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0076438.s005 gratis (TIFF)
Figura S5 .