Extracto
La proteína MUC1 se expresa de manera aberrante en muchos cánceres de tumores sólidos. En contraste con su agrupación apical sobre las células epiteliales sanas, se distribuye uniformemente sobre las células cancerosas. Sin embargo, una relación mecánica entre la expresión aberrante y el cáncer ha sido difícil de alcanzar. Aquí, nos informan de que un producto de escisión MUC1 unida a la membrana, que llamamos MUC1 *, es la forma predominante de la proteína en las células cancerosas cultivadas y en los tejidos cancerosos. Además, hemos demostrado que la transfección de un fragmento mínimo de MUC1, MUC1 *
1110, que contiene tan sólo cuarenta y cinco (45) aminoácidos del dominio extracelular, es suficiente para conferir las actividades oncogénicas que fueron atribuidos anteriormente a la plena -length proteína. Por comparación de peso molecular y la función, parece que MUC1 * y MUC1 *
1110 son aproximadamente equivalentes. Se presenta evidencia que apoya firmemente un mecanismo mediante el cual la dimerización del dominio extracelular de MUC1 * activa la MAP quinasa cascada de señalización y estimula el crecimiento celular. Estos hallazgos sugieren métodos para manipular este mecanismo de crecimiento para las intervenciones terapéuticas en tratamientos contra el cáncer
Visto:. Mahanta S, SP Fessler, Parque J, Bamdad C (2008) Un fragmento mínimo de MUC1 media la proliferación de células cancerosas. PLoS ONE 3 (4): e2054. doi: 10.1371 /journal.pone.0002054
Editor: Nils Cordes, Universidad de Tecnología de Dresden, Alemania |
Recibido: 17 de diciembre de 2007; Aceptado: March 13, 2008; Publicado: 30 de abril 2008
Derechos de Autor © 2008 Mahanta et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Todos los autores son empleados de una empresa de biotecnología y participa en un plan de opciones sobre acciones
Introducción
MUC1 es un tipo. I de membrana glicoproteína de la familia de mucina que tiene una extensa dominio extracelular que consiste en cientos de unidades de repetición en tándem, un único dominio transmembrana y una cola citoplasmática C-terminal [1] - [5]. MUC1 se expresa normalmente en la frontera apical de los epitelios sana que recubren los tractos respiratorio, reproductivo y gastrointestinal. En agudo contraste con el patrón de expresión saludable que restringe MUC1 a las superficies luminales, tejidos cancerosos muestran un patrón de expresión aberrante en el que MUC1 se distribuye uniformemente sobre toda la superficie del tejido [6], [7]. Actualmente se estima que el 75% de todos los cánceres de tumores sólidos humanos expresan de forma aberrante de la proteína MUC1 [8].
La función de MUC1 en el estado de salud sigue siendo poco clara, mientras que la evidencia está acumulando rápidamente por su papel como una oncoproteína . La introducción de MUC1 en anteriormente MUC1-negativo células da como resultado una tasa de crecimiento el aumento de [9], permite el crecimiento celular independiente de anclaje [10] y hace que las células resistentes a la apoptosis inducida por el tratamiento con agentes de quimioterapia estándar [8]. Las interacciones entre MUC1 y los miembros de la familia ErbB se han reportado [11], [12]. MUC1 está implicado en varias vías de señalización intracelular. Estos estudios se han centrado en la MUC1 cola citoplásmica (MUC1-CT), que es quizás la mejor parte caracterizada de la proteína [13]. La cola de 72 aminoácidos lleva los residuos que pueden ser fosforilados por Zap70, PCKδ, GSK3, ErbB1, c-Src, Lyn, y Lck. Además, los elementos de transducción de señales AP-2, p53, ER-α, β-catenina y Grb2 se han demostrado que se unen a la MUC1-CT, presumiblemente como una función de su estado de fosforilación. De hecho, estudios implican la fosforilación de la MUC1-CT en la activación de la vía de señalización MAP quinasa [12]. En uno de estos estudios [14], la estimulación de anticuerpos del dominio extracelular de una proteína quimérica compuesta de las porciones extracelular y transmembrana de CD8, pero la cola citoplásmica de MUC1, dio lugar a la fosforilación de ERK 1/2. la activación de ERK se demostró que era dependiente de la fosforilación de la MUC1-CT y podría ser abolido por un mutante Ras negativa dominante o por un inhibidor de MEK, argumentando de este modo que la MUC1-CT media la señalización de Grb2-SOS-Ras-MEK-ERK cascada que conduce a la división celular.
los estudios de la MUC1 dominio extracelular (ECD) están complicados por su tamaño cizalla (150-300 kDa), el hecho de que está altamente glicosilada, y que se compone de un número variable de repeticiones en tándem. Además, la proteína puede ser escindida, a continuación, desprende de la superficie celular. Shed MUC1, compuesto en gran parte de repeticiones en tándem, se puede detectar en el suero de los pacientes en estadio II de cáncer de mama [15]. Del mismo modo, las transferencias Western de los lisados de células de cáncer cultivadas MUC1-positivas muestran dos especies MUC1: una especie de alto peso molecular (150 a 300 kDa) que reacciona con anticuerpos que se unen a las repeticiones en tándem y una especie de bajo peso molecular (20 a 35 kDa) que reacciona con anticuerpos que se unen a la cola citoplásmica. Los sobrenadantes celulares contienen sólo las especies de peso molecular alto MUC1. Algunos estudios proporcionan pruebas de que MUC1 auto-escinde a través de un dominio SEA dentro de la proteína [16], [17]. Otros han presentado pruebas de que la TACE (ADAM 17) y MMP14 (MT1-MMP) han pegado MUC1 [18], [19]. Los primeros informes postularon que después de MUC1 escote, los liberados, las porciones de alto peso molecular re-asocia con la membrana obligados fragmento de bajo peso molecular, convirtiéndose así en el ligando para el receptor unido a la membrana [20].
En el presente informe se centra en la expresión y función del producto de escisión de peso molecular bajo MUC1 que permanece unida a la membrana después de la mayor parte del dominio extracelular se ha escindido y liberado de la superficie celular.
resultados
Caracterización de una novela MUC1 anticuerpos
con el fin de investigar los patrones de expresión de MUC1 y su producto de escisión, así como sus respectivas funciones, necesitábamos desarrollar anticuerpos que permiten distinguir el producto de escisión de bajo peso molecular de los de larga duración proteína en las células intactas y muestras de tejido. Los anticuerpos que reconocen los motivos de repetición en tándem (VU4H5, Santa Cruz) y la cola citoplásmica (Ab-5, LabVision) están comercialmente disponibles (Fig. 1A). Sin embargo, los anticuerpos que reconocen la porción extracelular del producto de escisión unido a la membrana no lo son. Para complicar las cosas, el sitio (s) exacto en el que se escinde MUC1 en células de cáncer no está claro. Varios sitios de escisión para MUC1 se han reportado o postulado [21], [22]. De hecho, una de las enzimas que escinde MUC1, MMP14, puede escindir sus sustratos en múltiples sitios [23]. Sin embargo, ningún sitio de escisión que se ha informado o propuesto producir un fragmento unido a la membrana con un dominio extracelular más corta de cuarenta y cinco ácidos (45) aminoácidos. Por lo tanto, nos planteamos un anticuerpo contra el cuarenta y cinco (45) péptido de aminoácidos (N-1110/54-C) que se encuentra inmediatamente N-terminal al dominio transmembrana (fig. 1B). Pensamos que este anticuerpo reconocería los productos unidos a la membrana de todos los sitios de corte reportados o propuestas. Debido a la incertidumbre de la posición precisa de MUC1 de escisión, en el presente documento, que genéricamente se refieren a todos los productos de escisión MUC1 ancladas a la membrana como MUC1 *. Del mismo modo, nos referimos a los anticuerpos generados contra el péptido ácido cuarenta y cinco amino (N-1110-54-C) como anti-MUC1 *. Ambos anticuerpos policlonales y monoclonales se generaron y que esencialmente realizan de forma equivalente.
A. proteína MUC1 de longitud completa se compone de una cola citoplásmica (CT), un dominio transmembrana (TM), un dominio de auto-agregación (SAD), y cientos de repeticiones en tándem (TR). B. La escisión del producto, MUC1 *, consiste en la cola citoplásmica, dominio transmembrana, y al menos 45 aminoácidos del dominio extracelular (ECD). Aunque el sitio exacto (s) de escisión sigue siendo algo incierto, hasta donde sabemos, no hay sitios de corte se ha informado que dejan menos de un ECD ácido 45 amino. sitios de anticuerpos VUH5, Ab-5 y anti-MUC1 * Encuadernación están marcados. C. El análisis Western de lisados de células enteras de células cancerosas cultivadas MUC1-positivo, carriles 1-6, se comparan con células MUC1-negativas, carriles 7-9. Un gel de 6% (superior) se transfirió con VU4H5 y un gel al 12% (inferior) se borró con anti-MUC1 *. D. T47D, las células de cáncer de mama cultivadas MUC1-positivo, se inmunoprecipitaron con Ab-ya sea 5 o Anti-MUC1 *. Las muestras de todo el lisado celular (CMT), carril 1, o los inmunoprecipitados, carriles 2 y 3, se analizaron por Western blot. Los geles se probaron con cualquiera VU4H5 (superior) o anti-MUC1 * (inferior). E. Análisis Western de tres líneas celulares de cáncer de mama MUC1-positivo de desglicosilación antes y después y se transfirieron con Anti-MUC1 * muestra que el peso molecular real de MUC1 escindido es de aproximadamente 16 a 18 kDa. F. La tabla resume las reactividades de anticuerpos para cualquiera de larga duración MUC1 (Hola MW) o troceados MUC1 (Mín MW).
anti-MUC1 * anticuerpos se caracterizaron por Western blot, FACS, y inmunocitoquímica. La Figura 1C muestra una transferencia de Western en el que los lisados de células a partir de un panel de células de cáncer cultivadas MUC1-positiva se probaron con cualquiera VU4H5 (gel superior) o Anti-MUC1 * (gel inferior). Como era de esperar, VU4H5 tiñó el peso molecular alto MUC1 especies de todas las células MUC1-positivo probado: T47D, ZR-75-1, ZR-75-30, BT474, DU145, y Capan 2. Anti-MUC1 * teñidas un bajo peso molecular 20-35 kDa banda de proteína que parece ser específica para MUC1. células MUC1-negativas, HCT116, 3Y1, y HEK293, no reaccionaron con el anticuerpo. Para confirmar que las especies de bajo peso molecular que reaccionaron con anti-MUC1 * era de hecho MUC1, lisados de células tumorales MUC1-positivos se inmunoprecipitaron con cualquiera de Ab-5 (anticuerpo cola citoplásmica) o Anti-MUC1 *, después se analizaron por Western blot ( Fig. 1D). Anti-MUC1 * se une a la misma especie de bajo peso molecular que Ab-5 reconoce, lo que confirma que anti-MUC1 * se une al peso molecular MUC1 producto de escisión baja.
Como se informó anteriormente, por Western blot, las especies de peso molecular alto MUC1 solamente reaccionaron con anticuerpos dirigidos contra las repeticiones en tándem, y no reaccionan con anti-MUC1 * o Ab-5 (datos no mostrados). Sin embargo, ambos anticuerpos son capaces de inmunoprecipitar débilmente las especies de alto peso molecular (Fig. 1D, de gel superior). En estos experimentos, la inmunoprecipitación puede simplemente bajar un hetero-dímero asociado no covalentemente de los dos fragmentos de escisión. Estos resultados también podrían explicarse por el hecho de que VU4H5 se une a una unidad de repetición en tándem que se repite cientos de veces por los receptores, mientras que anti-MUC1 * y Ab-5 se unen a secuencias no repetidos que ocurren sólo una vez por receptor. Alternativamente, estos resultados simplemente podrían explicarse por el hecho de que la especie principal en las células cancerosas es la forma escindida, MUC1 *. La tabla de la Figura 1 se resumen los datos de unión de anticuerpos.
Para explorar aún más el tamaño real de las especies de peso molecular bajo MUC1, lisados celulares se deglycosylated antes del análisis de transferencia de Western. La Figura 1E muestra que después de la desglicosilación, la anteriormente amplia banda de proteína de 20-35 kDa converge a una banda discreta que se ejecuta con un peso molecular aparente de alrededor de 15 a 17 kDa. Observamos que el peso molecular calculado de un producto de escisión MUC1, trunacted después de unos cuarenta y cinco aminoácidos del dominio extracelular es de aproximadamente 16 kDa.
patrones de expresión de MUC1 y su escisión del producto, MUC1 *, en Cultivadas células y Tejidos cancerosos en
células de cáncer cultivadas se analizaron por inmuno-citoquímica para determinar el patrón de expresión de MUC1 y su producto de escisión MUC1 *. células de cáncer de mama MUC1-positivas se tiñeron con doble VU4H5 que se une a las unidades de repeticiones en tándem en el fragmento de peso molecular alto y Anti-MUC1 * que se une a la de bajo peso molecular, producto de escisión unido a la membrana, MUC1 *. formación de imágenes fluorescente reveló que MUC1 * es la forma predominante de la proteína en las células cancerosas cultivadas y se distribuye uniformemente sobre toda la superficie de la célula. Por el contrario, las proteínas que se tiñeron por VU4H5 o bien no estaban presentes en la totalidad o eran las especies menores (Figura 2A). VU4H5 tinción podría indicar que la proteína en la superficie es de longitud completa o MUC1 que es un hetero-dímero unido no covalentemente que consta de dos productos de escisión. En particular, el patrón de expresión de longitud completa MUC1 está agrupado en uno o dos puntos de la superficie de la célula, que es una reminiscencia de la tendencia de MUC1 en el epitelio sano a agruparse en la frontera apical.
A. de imagen fluorescente de células de cáncer de mama cultivadas muestra que el producto de escisión MUC1 * (rojo) es la especie predominante y se distribuye uniformemente sobre toda la superficie de la célula. De larga duración MUC1 (verde) es la especie de menor importancia y está agrupado. Las células se doble teñidas con anti-MUC1 * (rojo) que se une a un epítopo dentro de la membrana proximal primeros 45 aminoácidos del dominio extracelular y VU4H5 (verde) que se une a un epítopo dentro del dominio de repetición en tándem de la proteína de longitud completa . SER. Los pares de secciones contiguas de muestras de tejido humano de los pacientes no tratados se tiñeron con anticuerpos anti-MUC1 * (izquierda) o VU4H5 (derecha). Las imágenes fueron fotografiadas en 10 × o 100 × magnificación. B. Una sección transversal de una trompa de Falopio no canceroso muestra tinción de la superficie MUC1 * en el borde luminal (inferior izquierda). De larga duración MUC1 es citoplasmática (inferior derecha). especímenes de tejido de cáncer de mama. C. especímenes de cáncer de pulmón. D. E. muestras de cáncer de colon. Las flechas apuntan a las partes más involucradas del tejido canceroso donde toda la arquitectura celular se ha perdido y el tejido no está manchado por VU4H5.
A continuación analizamos el patrón de expresión de larga duración contra MUC1 MUC1 * muestras de tejidos humanos sanos y cancerosos de pacientes no tratados. Las secciones seriadas de una trompa de Falopio no canceroso se tiñeron con anticuerpos anti-MUC1 * o VU4H5. Ambos anticuerpos MUC1 tiñeron la superficie luminal de la trompa de Falopio, pero no el tejido circundante (Fig. 2b, paneles superiores). 100 veces de aumento reveló que la forma escindida, MUC1 *, se expresa exclusivamente en el
superficie
de las células epiteliales que recubren el tubo, mientras que la proteína MUC1 de longitud completa parece estar limitada al citoplasma (Fig. 2B, paneles inferiores). secciones de regreso a la espalda de mama canceroso, de pulmón, de colon y los tejidos se probaron de manera similar con los dos anticuerpos (Fig. 2C-E, respectivamente). En agudo contraste con el patrón de expresión de MUC1 en los tejidos sanos, que se limitó a la borde luminal, MUC1 se expresa sobre toda la superficie de los tejidos cancerosos. La tinción con anti-MUC1 * muestra que, al igual que en las células de cáncer cultivadas, la principal forma de MUC1 en los tejidos cancerosos es MUC1 *. imágenes ampliadas muestran que MUC1 * se expresa en la célula
superficie, mientras que de larga duración MUC1 parece ser citoplasmática (Fig. C, D, paneles inferiores). Notablemente, Anti-MUC1 * produce tinción más pesado que VU4H5 pesar del hecho de que el anticuerpo repetición en tándem se puede unir a cientos de epítopos por receptor en comparación con el único epítopo al que Anti-MUC1 * se une. Algunos de los tejidos cancerosos que hemos probado no manchar positiva con el anticuerpo de MUC1. De nueve (9) probaron muestras de cáncer de mama, sólo uno era un cáncer MUC1-negativo, lo que corresponde aproximadamente a los informes publicados que aproximadamente el 90% de todos los cánceres de mama son los cánceres de MUC1-positivo. Observamos que las muestras de tejido que se consideraron cánceres MUC1-negativos mostraron tinción apical normal con ambos anticuerpos MUC1 en las regiones fuera del margen de malignidad (datos no presentados) que confirma que el ensayo se realizó correctamente, pero que estos cánceres no se caracteriza por la expresión aberrante de MUC1.
Es importante destacar que, nos dimos cuenta de que algunas muestras de tejido teñidas positivo para la presencia de MUC1 *, pero negativo para la longitud completa de MUC1. Por ejemplo, un espécimen de cáncer de colon se tiñó por Anti-MUC1 * con la más intensa tinción se produce en las partes más enfermas de la muestra. Por el contrario, VU4H5 ligeramente las zonas cercanas al margen de malignidad manchada pero produjo ninguna tinción en las regiones más enfermas, que se caracteriza por la pérdida de la arquitectura celular (Fig. 2E). Estos resultados son consistentes con la idea de que pueden aparecer los ejemplares más cancerosos ser MUC1-negativo si se sondearon con anticuerpos contra la proteína de longitud completa solo. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que las especies predominantes en MUC1 tejido canceroso, como en las células cancerosas cultivadas, es la especie escindidos, MUC1 *.
MUC1 * media en el crecimiento celular
Después de determinar que la principales especies en la superficie de las células cancerosas y tejidos es MUC1 * y no a la proteína de longitud completa, se decidió estudiar las características de crecimiento de la forma escindida en comparación con los no escindida. células MUC1-negativas, 3Y1 y HCT116, fueron transfectadas con cualquiera de longitud completa o una construcción de MUC1, MUC1 *
1110, cuyo dominio extracelular se terminó después de cuarenta y cinco (45) aminoácidos (N-1210-55-C ) (Fig. 1B). transfectantes estables resultaron ser inadecuados para el estudio porque los transfectantes de larga duración evolucionaron rápidamente en una población dominada por la forma escindida, MUC1 *, que tiene poco o nada de proteína de longitud completa disponible en la superficie celular (datos no mostrados). Por esta razón, los clones de células individuales se generaron y utilizaron en los experimentos descritos en el presente estudio. FACS, inmunocitoquímica y Western blot mostró que los clones de células individuales de larga duración MUC1 producen la proteína de longitud completa, sino también generar el producto de escisión MUC1 * (Fig. S1).
Un ensayo clonogénico se realizó para evaluar la tasa de crecimiento de MUC1 *
1110 frente a MUC1 de longitud completa que se había transfectado en fibroblastos de rata 3Y1 células. Células cultivadas en placas a baja densidad se dejaron crecer durante nueve (9) días. Las colonias resultantes se visualizaron por tinción con cristal violeta. MUC1 *
1110 clones, 3Y1 MUC1 * 3 y * 44 3Y1 MUC1, produjeron más grandes y más densas colonias, que clones de longitud completa, 3Y1 3Y1 MUC1 8 y 17 MUC1 (Fig. 3A). Al cabo de nueve días, los MUC1 *
1110 clones produjeron cinco a diez veces más células que los clones de longitud completa. La diferencia en el crecimiento se cuantificó mediante la medición de la cantidad de cristal violeta que fue liberado de las células en cada placa (3A Fig: gráfico de barras.). Sin embargo, el aumento en el número de células podría haber sido debido a un aumento en la tasa de supervivencia o un aumento en la tasa de crecimiento. factores de supervivencia de la célula se pueden identificar por su capacidad para hacer a las células resistentes a la muerte inducida por la quimioterapia. clones de células individuales de MUC1 o MUC1 *
1110 que había sido transfectado en células MUC1-negativo (3Y1 o HCT116) fueron tratados con AraC, cisplatino o etopósido, a continuación, se ensayaron para medir la cantidad de muerte celular. Las células transfectadas con cualquiera de larga duración MUC1 o MUC1 *
1110 se volvieron resistentes a la apoptosis inducida por estos agentes de quimioterapia. Un experimento representativo se muestra en la Figura 3B. Estos resultados sostienen que MUC1 o MUC1 * la supervivencia celular aumento. Para determinar si también aumentan el crecimiento celular, se realizó un experimento de análisis del ciclo celular. FACS se utilizó para medir el número de células en fase G2 /M (un indicador de la división celular) en comparación con el número en la fase G1. La proporción de células en G2: G1 se midió para las células HCT116 transfectadas con o bien de longitud completa MUC1 o MUC1 *
1110 (Fig 3C.). La introducción de cualquiera de MUC1 *
1110 o de larga duración MUC1 llevó más células en la fase G2 /M de la transfección de control del vector vacío. Sin embargo, la transfección MUC1 *
1110 aumentó la proporción de G2:G1 más que la transfección de la proetin de longitud completa. Recordemos que aunque las células son transfectadas con la proteína de longitud completa, una cantidad considerable se proteolizada a la MUC1 * formulario.
A. Un ensayo clonogénico se realizó en clones de células individuales de células 3Y1 MUC1-negativas que habían sido transfectadas con un vector vacío o bien, de larga duración o MUC1 MUC1 *
1110. Una fotografía de placas de Petri que contienen células cultivadas en placas a 1000 células por 100 mm, que se cultiva durante 9 días, a continuación se tiñeron con cristal violeta. gráfico de barras que cuantifica el crecimiento de cada clon. Crystal violeta absorbido por las células de cada placa se libera y la absorbancia a 590 nm se midió en un espectrofotómetro. mediciones de absorción se normalizaron a la cantidad de cristal violeta liberado del clon de vector vacío. Nomenclatura para nuestros clones de células individuales es "célula madre Nombre /construcción /clon #". B. La resistencia a la muerte celular inducida por el fármaco de quimioterapia AraC se prueba en clones de células individuales de uno u otro vector vacío, de larga duración o MUC1 MUC1 * transfectados en células 3Y1. C. El análisis del ciclo celular se realizó a cada vector vacío, de larga duración o MUC1 MUC1 * transfectaron en la línea celular HCT116 MUC1-negativas. La relación del porcentaje de células en G2 a la fase G1 se representa como una función de la concentración en suero. La relación de% G2:% G1 para los transfectantes vector vacío se ha normalizado a 1. D. El crecimiento de las células de cáncer de mama MUC1-positivo, ZR-75-30, es estimulada por la adición de bivalente (bv) Anti-MUC1 * e inhibida por la adición de la monovalente (mv) Fab. La adición de anticuerpo bivalente produce la curva de crecimiento en forma de campana que es característico de la dimerización del receptor. El crecimiento de las células HEK 293 MUC1-negativo no se vio afectado por cualquiera de los bivalente o monovalente anti-MUC1 *. E. La estimulación del crecimiento por la adición de bivalente anti-MUC1 * se prueba utilizando siRNA transfectadas de forma estable para suprimir la expresión de MUC1 en la línea celular de cáncer de mama T47D. Bivalente anti-MUC1 estimuló el crecimiento en las células transfectadas con ARNsi de control, pero no afectó significativamente el crecimiento en las células MUC1 suprimidas. El análisis de transferencia Western (inserción) muestra que MUC1 siRNA suprimió la expresión de MUC1 en alrededor de 90%. células de cáncer de mama F. MUC1-positivas, T47Ds, se tratan con o bien bivalente anti-MUC1 * o el monvalent Fab, después se analizaron por Western para la presencia de ERK1 fosforilados /2. Manchas muestran la inducción de la fosforilación de ERK2 por bivalente anti-MUC1 * y la inhibición de ERK1 basal /2 fosforilación después de dos días (2 d) el tratamiento con la vacuna monovalente Fab.
Por lo tanto, después de haber establecido un vínculo entre MUC1 * y el crecimiento, especuló que puede funcionar como un receptor del factor de crecimiento. Sin un ligando conocido para MUC1 o MUC1 *, sería difícil para probar la hipótesis. Sin embargo, los receptores del factor de crecimiento de la clase I desencadenar el crecimiento celular a través de la dimerización del dominio extracelular del receptor. Nos hicieron que un anticuerpo bivalente contra la *
1110-ECD (dominio extracelular) porción de MUC1, que podría ser utilizado para simular su ligando. Otros habían informado anteriormente que la estimulación de esta clase de receptores de factores de crecimiento con anticuerpos generados de dimerización curvas de crecimiento en forma de campana [24] - [26]. Esto se debe a crecimiento celular aumenta al aumentar la concentración de anticuerpo hasta que el crecimiento máxima se logra cuando un anticuerpo dimeriza cada dos receptores. Sin embargo, como la concentración de anticuerpo va en exceso, cada anticuerpo se une a un receptor, por lo que no se produce la dimerización, y el crecimiento celular se cae. Hemos realizado experimentos similares mediante el tratamiento de las células cancerosas MUC1-positivas, así como *
1110 células transfectadas MUC1 y MUC1 con anti-MUC1 *. Como control negativo, se trataron las células con el Fab monovalente de Anti-MUC1 *, lo que no sería capaz de dimerizar los receptores. Para cada MUC1-positivo o MUC1 *
1110-positivo línea celular que hemos probado, el anticuerpo bivalente que estimuló el crecimiento celular y produjo la curva de crecimiento en forma de campana se esperaba. En marcado contraste, el Fab monovalente no sólo no estimula el crecimiento celular, sino que induce la muerte celular. Los resultados de un experimento de este tipo se muestra en la figura 3D, donde el crecimiento de células de cáncer de mama MUC1-positivo, ZR-75-30s, es estimulada por anti-MUC1 * e inhibida por la monovalentes Fab. Las células HEK293 MUC1-negativas se ven afectados por el anticuerpo. Los anticuerpos de control, ya sea bivalente o monovalente, no tuvieron efecto sobre el crecimiento de crecimiento de células tumorales MUC1-positivas (Fig. S2). Para confirmar que el anticuerpo-estimulación del crecimiento celular fue mediada específicamente por MUC1, se repitieron los experimentos utilizando células de cáncer de mama MUC1-positivo, T47Ds, que habían sido transfectadas establemente con siRNA a desmontables expresión MUC1. el crecimiento de células T47D es estimulada por la adición de bivalente anti-MUC1 * y se produce la curva de crecimiento en forma de campana característica. Sin embargo, en células en las que la expresión de MUC1 ha sido suprimido por al menos 90%, el anticuerpo no tiene ningún efecto estimulador (Fig. 3E). Por último, los experimentos mostraron que la estimulación de las células MUC1-positivo con bivalente anti-MUC1 * indujo la fosforilación de ERK1 /2. En contraste, el fragmento Fab monovalente de Anti-MUC1 * suprime los niveles basales de ERK1 fosforilados /2 (Fig. 3F). La fosforilación de ERK1 /2 es un paso clave en la activación de la cascada de señalización de la MAP quinasa. En conjunto, estos resultados son consistentes con la idea de que MUC1 * es un receptor del factor de crecimiento o co-receptor que media el crecimiento celular a través de la dimerización del dominio extracelular, con lo cual la MAP quinasa vía de señalización se activa.
MUC1 * ligandos activadores
Si MUC1 o MUC1 * funciona como un receptor del factor de crecimiento que se activa mediante la dimerización del dominio extracelular, entonces se deduce que las células cancerosas MUC1-positivas pueden secretar un ligando (s) de dimerización. Se diseñó un experimento de nanopartículas para detectar lisados celulares de cáncer y los sobrenadantes para la presencia de este ligando. MUC1 * péptidos
1110 ECD-(N-1010-54-C: véase la Fig. 1B) estaban unidos a nanopartículas de oro a través de una etiqueta de histidina C-terminal y lisado /se añadieron muestras de sobrenadante [27]. Si un ligando de dimerización estaban presentes, sería unirse simultáneamente a un primer péptido en una primera nanopartícula y un segundo péptido en un segundo de nanopartículas, lo que provoca la reticulación mayor de nanopartículas y péptidos. Debido a una propiedad inherente de las nanopartículas de oro, la reticulación produce un cambio de color de la rosa característica para un color púrpura /azul [28]. La adición del lisado /mezclas de sobrenadante a MUC1 *
1110 ECD-nanopartículas de péptidos que portan causó la solución para encender púrpura /azul. La tasa de cambio de color más o menos corresponde a la cantidad de MUC1 que produjo cada línea celular. No cambio de color se produjo cuando se añadieron el lisado /mezclas de sobrenadante a nanopartículas que llevan un péptido de control (Fig. 4A).
A. mezclas de lisado-sobrenadante de un panel de células de cáncer de mama MUC1-positivos se ensayaron para determinar la presencia de un ligando capaz de dimerizar un MUC1 *
1110 ECD-péptido (membrana proximal 45 aminoácidos del dominio extracelular: 1110-1155) . mezclas lisado sobrenadante se incubaron con nanopartículas de cojinete, ya sea un péptido de control o un MUC1 * péptido
1110 ECD-, marcado con histidina en el extremo C-terminal. Un cambio de color disolución de nanopartículas de rosa a un color púrpura /azul indica que una especie en la mezcla ha obligado al mismo tiempo a 2 o más péptidos MUC1 *
1110 ECD-. B. bivalente (bv) Anti-MUC1 * (0,77 ug) se añade a las nanopartículas que llevan ya sea un péptido de control (fila A) o MUC1 *
1110-ECD, los péptidos (fila B). la unión a dos péptidos en nanopartículas separadas anticuerpo provoca la agregación de nanopartículas y el cambio de color de la solución del rosa al púrpura /azul. En la fila A, pozos 3-5, esta agregación se inhibe por la adición monovalente anti-MUC1 * Fab (Fab mv). C. NM23 en 0,05, 0,1 o 0,2 uM, (filas A, B y C respectivamente) se añade a las nanopartículas que llevan MUC1 * péptidos
1110 ECD-(columnas 2-5). Agregado NM23 induce un cambio de color, presumiblemente como dímeros NM23 se unen a MUC1 nanopartícula inmovilizado * péptidos
1110 ECD-. La adición de monovalente Anti-MUC1 * (mv Fab), en las columnas 3-5, inhibe el cambio de color. D. El medio condicionado de células MUC1-positivos de cáncer de mama, T47Ds, y fibroblastos de rata MUC1-negativas, 3Y1s, se mezcló con cuentas que lleva el MUC1 *
1110-péptido DPI. especies inmunoprecipitadas se analizaron entonces por Western, en el que el gel se transfirió con un anticuerpo anti-NM23. El western blot muestra que secretan T47Ds NM23 mientras 3Y1s no. E. resonancia de plasmón superficial (SPR) se utilizó para detectar la unión directa entre NM23 (15 nM) y MUC1 * péptidos
1110 ECD-. El Sensograma muestra que 1044 RU de NM23, inyectado a 15 nM, unido a una superficie que lleva péptidos MUC1 *
1110 ECD-(línea continua) pero no NM23 unido a una superficie de control que lleva un péptido irrelevante (línea discontinua). F. La estimulación del crecimiento de células de cáncer de mama T47D por NM23 depende de la expresión de MUC1. NM23 exógeno añadido a las células de cáncer de mama T47D estimula el crecimiento y produce en forma de campana curva indicativa de la dimerización del receptor. El crecimiento se reduce en gran medida en células que expresan de forma estable siRNA-MUC1 específica, en comparación con las células que expresan un control de siRNA. Western blot cuantifica la supresión de MUC1 siRNA.
Para identificar lo que parecía ser una MUC1 * ligando (s), perlas que llevan MUC1 *
1110 ECD-péptidos se utilizaron para inmunoprecipitar las proteínas desconocidas a partir del lisado /mezclas de sobrenadante de células de cáncer de MUC1-positivos. Los eluatos se separaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron usando métodos de tinción de plata. Había básicamente sólo dos bandas que se precipitaron por la MUC1 *
péptido ECD-1110 y no se precipitaron por un péptido de control: un prominente banda de 23 kDa y una débil banda de 17 kDa (Figura S3.). Las bandas de proteínas se escindieron del gel y se analizaron usando N-terminal de microsecuenciación, lo que les identifica como NM23, isoformas H1 y H2, respectivamente. NM23 se encuentra normalmente en el citoplasma de todas las células, pero a menudo es secretada por las células del cáncer [29] que indica que podría ser un ligando para la porción extracelular de MUC1 *. Los sobrenadantes celulares se inmunoprecipitaron con MUC1 *
1110 ECD-péptidos unidos a las perlas, después se analizaron por Western blot. Los sobrenadantes de células de cáncer de MUC1-positivas, pero no en las células de control, generaron una fuerte banda de proteína a aproximadamente 23 kDa que se hace reaccionar con anti-NM23H1 (Fig. 4B). Esto confirmó que las proteínas de los sobrenadantes de las células del cáncer que se inmunoprecipitaron con MUC1 *
1110 ECD-péptidos eran de hecho NM23.
Para detectar la unión directa entre NM23 y MUC1 *
1110 ECD-péptidos y para confirmar la especificidad, se llevó a cabo otro experimento de nanopartículas. NM23 recombinante humana fue agregado a MUC1 * nanopartículas
1110-péptido que soportan el DPI o nanopartículas que llevan un péptido de control. La adición de nanopartículas que llevan a NM23 MUC1 *
1110-ECD, provocó un cambio de color de rosa a la solución de color púrpura /azul y el grado del cambio de color era una concentración NM23 función. El monovalente Fab de anti-MUC1 * inhibe competitivamente la unión entre partículas inmovilizada MUC1 * péptidos y NM23 (Fig. 4C). Para demostrar aún más la especificidad del ensayo de nanopartículas en sí, bivalente anti-MUC1 se añadió a MUC1 * nanopartículas
1110-péptido-cojinete ecd, que como era de esperar como resultado la rosa a cambio de color azul. Que la unión fue también inhibida competitivamente por el Fab monovalente (Fig. 4D).