Extracto
Se presenta evidencia de la presencia de un complejo nuclear heteromérica funcional del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), src y el transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) 3 proteínas en células de cáncer de páncreas. Stat3 permanece nuclear y asociado con Src o EGFR, respectivamente, después de la caída siRNA de EGFR o Src, lo que demuestra la resistencia del complejo a la modulación de EGFR o Src solo. De manera significativa, la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) analiza revelar el EGFR nuclear, Src y complejo Stat3 está unido al promotor de c-Myc. El siRNA desmontables de EGFR o Src, o la inhibición farmacológica de la actividad de Stat3 sólo se suprimió marginalmente la expresión de c-Myc. Por el contrario, la modulación concurrente de Stat3 y EGFR, o Stat3 y Src, o EGFR y Src suprime fuertemente la expresión de c-Myc, lo que demuestra que la novela nuclear heteromérica complejo regula intrincadamente el gen c-Myc. La prevalencia del EGFR transcripcionalmente funcional, Src, y STAT3 complejo nuclear proporciona un mecanismo adicional y novedoso para soportar el fenotipo de cáncer de páncreas y explica en parte la falta de sensibilidad de las células de cáncer de páncreas a la inhibición del EGFR, Src o Stat3 solo.
Visto: Jaganathan S, P Yue, Paladino DC, Bogdanovic J, Q Huo, Turkson J (2011) Un funcional Nuclear receptor del Factor de Crecimiento epidérmico, Src y Stat3 heteroméricos complejo en células de cáncer de páncreas. PLoS ONE 6 (5): e19605. doi: 10.1371 /journal.pone.0019605
Editor: Marcelo G. Bonini, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: noviembre 30, 2010; Aceptado: April 12, 2011; Publicado: 5 Mayo 2011
Derechos de Autor © 2011 Jaganathan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto de cáncer de Subvenciones CA106439 Nacional (JT) y CA128865 (JT), Departamento de la Fundación Salud Bankhead-Coley (Puente de subvención) (HQ), el apoyo parcial de Consejo Mundial del oro (GROW Programa) (HQ) de la Florida, y el Fundación nacional de Ciencias Naturales de ultramar Young Investigator Award de china (20828006) (HQ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Muchos procesos bioquímicos intracelulares son disparados por el ensamblaje de las proteínas en complejos macromoleculares. La asociación entre las proteínas o de las proteínas con otras entidades moleculares modula la conformación de proteínas, proporcionando un medio para regular la miríada de procesos bioquímicos que sirven para gestionar de forma eficaz las respuestas biológicas vitales. dinámica de las proteínas y la trata, y la estabilidad de proteínas también son procesos que pueden ser modulados por la asociación de proteínas con otros. En el sentido más amplio, las asociaciones inter-moleculares permiten que las proteínas de la especialidad, tales como receptores, adaptadores, enzimas y factores de transcripción que modulan diferencialmente eventos intracelulares, creando así la diversidad en las respuestas fisiológicas y la promoción de dependencia del contexto.
Durante el inducción de la transducción de señales, no hay montaje de diferentes proteínas, cada una de las cuales tiene funciones específicas importantes para la transducción de la señal y la respuesta biológica de acompañamiento. El receptor del factor de crecimiento epidérmico tradicional (EGFR) y la vía de transducción de señales incorpora la activación de la proteína quinasa quinasa activada por mitógeno (MEK) -mitogen proteína quinasa activada /quinasa extracelular regulada por señal (Erk
MAPK) y promueve respuestas mitogénicas [ ,,,0],1], [2]. La inducción EGFR también promueve la activación de la señal de transductor y activador de la transcripción (STAT) de la familia de proteínas, que de manera similar tiene un papel central en las respuestas biológicas de EGF inducida por [1]. Las proteínas STAT son factores de transcripción latentes citoplasmáticas que se activan en respuesta a la estimulación celular por citoquinas y factores de crecimiento [3] a través de la fosforilación de un residuo tirosilo crítica (Tyr705 para Stat3). La fosforilación de la tirosina de STAT está mediada por tirosina quinasas de receptores de factores de crecimiento y por tirosina quinasas citoplasmáticas, tales como Src y Janus quinasa (Jaks) familias. STAT activado como dímeros en el enlace núcleo a elementos de respuesta específicos de ADN en los promotores de genes diana para inducir la transcripción de genes. El mecanismo de la translocación nuclear de STAT ha sido objeto de intensa investigación reciente. Stat3 translocación nuclear se ha informado que es mediado por el reconocimiento y el transporte por importin-α y la Ran-GTPase [4], y, por mecanismos que implican la chaperoning por MgcRacGAP [5], EGF endocitosis mediada por receptor [6], y, por asociadas a la membrana plasmática balsas lipídicas tráfico [7].
la prevalencia de muchas de las vías de transducción de señales hiperactivos que sustentan el fenotipo del cáncer es un reto importante para la terapia. En relación con la forma clásica de promover crosstalks entre las múltiples vías de señalización, los conjuntos de proteínas macromoleculares proporcionan mecanismos adicionales únicas para inducir eventos que apoyarían el fenotipo maligno. Tal mecanismo de señalización no tradicional se ha identificado para el EGFR, que ha sido detectado en el núcleo de la célula y observado para funcionar como un factor de transcripción [8], [9]. Los estudios revelaron aún más los complejos nucleares de EGFR con STAT3 en células de cáncer de mama, y este complejo induce genes específicos, incluyendo el óxido nítrico inducible sintasa (iNOS) [10]. La función EGFR adicional agravaría su papel como un mitógeno y un promotor de la supervivencia celular, todos los cuales favorecen el cáncer. A este respecto, la activación aberrante concurrente de EGFR y mediadores de señal aguas abajo, incluyendo Src y Stat3, que se producen con frecuencias altas en los cánceres humanos refleja una complejidad de señalización general que soporta el fenotipo de cáncer. Por ejemplo, con referencia al cáncer de páncreas, la activación aberrante de EGFR se produce en el 30-50% de los casos [11], que se activa c-Src se observa en más de 70% de los casos, y con frecuencia acompaña a la sobreexpresión de EGFR [12], mientras que aberrante la activación de Stat3 también es altamente prevalente [13], [14], [15]. Es importante destacar que, nuestro informe reciente de que el cáncer de páncreas es más sensible a la inhibición concurrente de aberrante Stat3 y EGFR o Src [16] muestra la utilización de múltiples vías de señalización aberrantes para el mantenimiento del fenotipo de cáncer y cómo esto influye en la capacidad de respuesta a la terapia. Para ampliar nuestros estudios anteriores [16], hemos tratado de investigar la interacción molecular y funcional entre Stat3, EGFR y Src y los mecanismos subyacentes de apoyo del fenotipo de cáncer de páncreas. Nos la presente memoria proporcionan evidencia de un EGFR funcional nuclear heteromérica, complejo Src y Stat3 en las células de cáncer de páncreas, que promueve la inducción del gen c-Myc. Nuestro informe es el primero en la identificación de un EGFR nuclear, Src y Stat3 complejo heteromérica que promueve la inducción del gen c-Myc. La comprensión de la dinámica del EGFR, interacciones moleculares Src y STAT3 en el cáncer de páncreas podrían proporcionar una base para diseñar nueva terapia múltiple dirigida efectiva acerca del cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Células y Reactivos
El cáncer de páncreas humano, Panc-1 y Colo-357 líneas han sido descritas previamente [16], [17]. El páncreas de células epiteliales del conducto (HPDEC) línea humana inmortalizada fue una especie de regalo del Dr. Tsao, OCI, UHN-PMH, Toronto) [18]. HPDEC se cultivaron en medios de queratinocitos-SFM suplementado con 0,2 ng de EGF, 30 mg /ml de extracto de pituitaria bovina y que contiene antimycol. Todas las demás células fueron cultivadas en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 5% de suero suplementado con hierro bovino de ternera y 100 unidades /ml de penicilina-estreptomicina.
Síntesis de péptidos
El péptido de dominio SH2 Stat3 inhibidor (SPI), FISKERERAILSTKPPGTFLLRFSESSK, los motivos peptídicos EGFR, pY1068EGFR (pY1068), PEpYINQS y la pY1086EGFR (pY1086), PVpYHNQP se adquirieron de péptido 2.0 (Fairfax, VA) en & gt; 95% de pureza
Nuclear. extracto de preparación y ensayos de cambio de gel
preparación de extracto nuclear de células se llevó a cabo como se describe anteriormente fraccionamiento [17].
Sub-celular, y SDS-PAGE /Western blot
se realizó análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [19], [20] en lisados de células enteras, y en las fracciones citosólicas y de membrana, y en los extractos nucleares. fracciones subcelulares se prepararon de acuerdo con el protocolo estándar. Brevemente, las células se lavaron con PBS, se resuspendieron y se lisaron en tampón bajo en sal (HEPES 20 mM (pH 7,9), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 20 mM, Na 1
3Vo
4, 1 Na mM
4P
2O
7, ditiotreitol 1 mM, 1 TLA, 0,5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y 0,5% Nonidet P-40), y se centrifugó (13.000 x
g
, 4 ° C, 30 s) para obtener la fracción citosólica. El sedimento se lavó tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se resuspendieron en tampón de alta salinidad (NaCl 420 mM, HEPES 20 mM (pH 7,9), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 20% de glicerol, 20 mM NaF, mM Na 1
3Vo
4, Na 1 mM
4P
2O
7, ditiotreitol 1 mM, TLA 1 y 0,5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo), se incubaron a 4 ° C durante 30 minutos , con balanceo, y se centrifugó a (13.000 x
g
, 4 ° C, 30 min) para obtener la fracción nuclear (sobrenadante). El sedimento obtenido se lavó tres veces con PBS, se resuspendieron en tampón de lisis RIPA (Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 1% Nonidet P-40, 0,1% de SDS, mM TLA 1, y 0,5 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo), se incubaron durante 30 min a 4 ° C con agitación, y se centrifugó (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). El sobrenadante se recogió como la fracción de membrana. Los anticuerpos primarios utilizados están en contra de pY845EGFR (Upstate Biotech, Millipore, Billerica, MA), pY705Stat3, Stat3, pY1068EGFR, pY1086EGFR, pY1173EGFR, EGFR, pY416Src, Src, y β-actina (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA), y TATA proteína de unión (TBP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Los péptidos que bloquean fueron adquiridos de las empresas respectivas.
ARN interferente pequeño (ARNip) Transfección
secuencias de siRNA para EGFR y Src se encargaron a Dharmacon RNAi Technologies, Thermo Scientific (Lafayette, CO) . Las secuencias utilizadas son: cadena con sentido del EGFR, 5'-GAAGGAAACUGAAUUCAAAUU-3 '; cadena antisentido del EGFR, 5'-pUUUGAAUUCAGUUUCCUUCUU-3 '; Control de siRNA cadena con sentido, 5'-AGUAAUACAACGGUAAAGAUU-3 '; y controlar hebra antisentido siRNA, 5'-pUCUUUACCGUUGUAUUACUUU-3 '. El reactivo de c-Src SmartPool siRNA (NM-005417, Catálogo M-003175-01-05 #) se utilizó para Src. La transfección en las células se realizó utilizando 20 nM de EGFR siRNA o 25 nM de Src siRNA y 8 l Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) en medio de cultivo OPTI-MEM (GIBCO, Invitrogen Corporation).
inmunoprecipitación (IP), y estudios de inmunoprecipitación secuencial
Estos estudios se realizaron como se informó anteriormente [21] utilizando lisados de células completas o extractos nucleares (250 mg de proteína total) y 5 l de anti-EGFR o anti-Src policlonal anticuerpo o el anticuerpo anti-Stat3 monoclonal (Cell Signaling Technology). Para la especificidad, el análisis de inmunotransferencia utilizando anti-EGFR, anti-Src y el anticuerpo anti-Stat3 se realizó en presencia del péptido de bloqueo respectiva. Se realizaron estudios de IP secuenciales de acuerdo con los procedimientos publicados [10] con algunas modificaciones de la siguiente manera: los extractos nucleares, preparado como se describe anteriormente [21], se sometieron a una inmunoprecipitación similar con respecto a la primera anticuerpo primario, anticuerpo anti-EGFR (Señalización Celular ) o IgG (Santa Cruz) a 4 ° C durante la noche. A continuación, la immunecomplex se sedimentó con /G perlas de agarosa proteína 20 l A (Santa Cruz), se lavaron tres veces usando tampón de lavado A (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 ), y luego dos veces con tampón de lavado B (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0). A continuación, las proteínas se eluyeron con tampón de elución recién preparado (1% de SDS, 100 mM NaHCO
3) y se someten a la segunda inmunoprecipitación incubando con anti-Src anticuerpo o IgG (Santa Cruz). Los complejos se precipitaron entonces, se lavaron, se eluyó con tampón de Lamelli y después se sometieron a SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western de sondeo para Stat3.
inmunotinción con formación de imágenes confocal de escaneo láser
células Panc-1 crecimiento en cubreobjetos en placas de 12 pocillos se trataron con o sin inhibidores de 1 o 24 h y se sometieron a inmunotinción y fluorescencia o de escaneo láser microscopía confocal, tal como se describe anteriormente [21]. Las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído durante 15 min, se lavaron tres veces con PBS, permeabilizaron con 0,25% de Triton X-100 durante 10 min, y se lavó tres veces con PBS. Los especímenes fueron entonces bloqueados en 0,1% de BSA en PBST durante 30 min y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos monoclonales de rata anti-EGFR (Santa Cruz), monoclonal de ratón anti-Src (Señalización Celular), y policlonal de conejo anti Stat3-(Señalización Celular ) anticuerpos a una dilución de 1:50 (en 0,1% de BSA). Posteriormente, las células se enjuagaron tres veces en PBST, se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad con 1:1000 diluciones de los tres anticuerpos secundarios AlexFluor, ALexaFLuor405 (anti-ratón de cabra), AlexaFluor488 (de burro anti-conejo) y AlexaFluor546 (anti cabra -rat) (Molecular Probes, Invitrogen) para EGFR, Src y detección Stat3, respectivamente. Las muestras fueron lavadas tres con PBST. Posteriormente, los cubreobjetos se retiraron y se montaron en portaobjetos usando Fluoromount-G (Biotech Sur, Birmingham, AL) y se evita su secado mediante el sellado de los bordes con pintura de uñas. Los portaobjetos se almacena en la oscuridad a 4 ° C hasta que las imágenes fueron capturadas. Para la tinción negativa, se añadieron anticuerpos secundarios sin los anticuerpos primarios. análisis confocal se realizó por el examen de desliza debajo de Leica TCS SP5 microscopio confocal (Alemania) a longitudes de onda apropiadas. Las imágenes fueron capturadas y procesadas mediante el software Leica TCS SP 5.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) y el análisis de chip secuenciales
Para chip de ensayo, las células en cultivo fueron tratados con formaldehído a una concentración final de 1%, durante 10 min a temperatura ambiente seguido de tratamiento con glicina a una concentración final de 0,125 M durante 5 min a temperatura ambiente durante la reticulación. Posteriormente, las células se lavaron con PBS helado y se resuspendieron en y se lisaron con tampón de lisis (HEPES 20 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 1, Na 1 mM
3Vo
4, mM Na 1
4P
2O
7, ditiotreitol 1 mM), 1X TLA, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 5% Nonidet P-40, y se centrifuga. Entonces pellet nuclear se resuspendió en tampón de lisis núcleos (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 10 mM, 1% SDS e inhibidores de proteasa) (Roche, Indianapolis, IN). Los lisados nucleares se sometieron a ultrasonidos (Omni International, Kennesaw, GA) a una potencia del 30% para 3 pulsos de 10 s intervalos en el hielo para esquilar ADN. La solución de la cromatina se pre-aclaró con perlas de agarosa proteína A /G (Santa Cruz) durante 1 hora a 4 ° C con agitación. A continuación, los lisados de pre-aclarado se inmunoprecipitaron mediante la incubación con anti-EGFR, anti-Src, o anticuerpos anti-Stat3 o con IgG (sin anticuerpo) (Santa Cruz) a 4 ° C durante la noche con balanceo. Los complejos se recogieron con /G perlas de agarosa proteína 20 l A (Santa Cruz), se lavaron tres veces usando tampón de lavado A (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) y dos veces con tampón de lavado B (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0). A continuación, los complejos se eluyeron con tampón recién preparado de elución (1% SDS, 100 mM NaHCO
3). Los enlaces cruzados se invirtieron por calentamiento a 65 ° C en presencia de NaCl seguido de tratamiento con proteinasa K (20 l de una 20 mg /ml) durante 6 h. El ADN se recuperó y se purificó usando el kit de purificación de ADN de Qiagen (Valencia, CA). La cromatina inmunoprecipitada purificada de ADN fue junto utilizó como molde para la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del promotor c-Myc utilizando los cebadores, Adelante, 5'AAAAGGGGAAAGAGGACCTGG-3 ', y la inversa, 5'-TAAAAGGGGCAAGTGGAGAGC-3' o el promotor TWIST usando los cebadores, Delantero, 5'-AGTCTCCTCCGACCGCTTCCTG -3 '
Invertir:. CTCCGTGCAGGCGGAAAGTTTGG 5'-3' (Invitrogen). Los productos de PCR, 133 pb para c-Myc y el 332-bp para TWIST [22] se resolvieron en gel de agarosa al 2%. Los estudios se realizaron de chip secuenciales como se informó anteriormente [10] y siguiendo los estudios de inmunoprecipitación secuencial descritos, utilizando la primera anticuerpo primario (anti-EGFR) y el segundo anticuerpo primario (anti-Src). Los complejos recuperados después de la inmunoprecipitación secundaria se eluyeron con el tampón de elución y después se sometió a chip de ensayo, tal como se describe.
Gel cromatografía de filtración
La columna de vidrio 10/30 GL preenvasados Superdex 200 fue adquirido de GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). El sistema de cromatografía utilizada en el estudio fue el Sistema Biologic Duoflow (Bio-Rad, Hercules, CA). El análisis de cromatografía se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante con una secuencia de ejecución general de equilibrio, de carga, de elución, la regeneración y el almacenamiento. Tampón RIPA (50 mM Tris, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,1% de SDS, 1% Nonidet P-40) se utilizó como tampón de fase móvil. Muestras (Panc-1 lisado de células, proteína total 2 mg en un volumen de 250 l) se cargaron a la columna, a continuación, la tasa de flujo se ajustó a 0,25 ml /min, y a continuación, la recogida de fracciones (500 l) se inició inmediatamente después de la muestra carga y monitorizado por la absorbancia eluyente a 280 nm. De acuerdo con los picos de absorbancia, se seleccionaron las fracciones 21-34 y se sometieron a análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos contra EGFR, Stat3, y Src (Señalización Celular), y en contra de RNA helicasa A (RHA) (Abcam, Cambridge, MA). Para el ensayo de inmunoprecipitación, 100 l cada una de las fracciones 23-27 se combinaron, de la que immunecomplex EGFR se precipitó usando anticuerpo anti-EGFR (Señalización Celular) y se sometió a análisis de inmunotransferencia para Stat3, Src y EGFR.
Preparación de sondas anti-EGFR y el ratón IgG1-PNB
Las nanopartículas de oro (PNB), 0,1 nm, con un diámetro de 40 nm se adquirió de Ted Pella Inc. (Redding, CA). Ratón monoclonal anti-EGFR anticuerpo [F4] se adquirió de Abcam (cat. No. AB62, conc. 1,2 mg /ml), y IgG1 monoclonal de ratón no específica se adquirió de Sigma (cat. No. M9629, conc. 1 mg /ml). Policlonales anti-Stat3 (conc. 0,2 mg /ml), anticuerpos policlonales anti-Src (0,1 mg /ml), anticuerpos policlonales anti-EGFR (0,2 mg /ml) e IgG de conejo no específico (0,4 mg /ml) se adquirieron de Santa Cruz. Todos los otros productos químicos e ingredientes de amortiguamiento para el desarrollo del ensayo se adquirieron de Sigma. La sonda de anti-EGFR-GNP se preparó añadiendo 10 l de anticuerpo monoclonal de ratón anti-EGFR a 1 ml de PNB. Después de incubación durante 15 min a temperatura ambiente, la sonda fue bloqueada con 2,5 mg de BSA durante 30 min. Después de la centrifugación a 10.000 rpm durante 5 min, se descartó el sobrenadante y el residuo de nanopartículas se volvió a dispersar en 0,5 ml de 0,25% de BSA en tampón fosfato 10 mM (Pb). a continuación, se utilizó la sonda en el ensayo. La sonda de control negativo ratón IgG1-GNP se preparó añadiendo 10 l de anticuerpo IgG1 monoclonal de ratón a 1 ml PNB, y siguiendo el procedimiento idéntico al utilizado para la preparación de la sonda EGFR. IgG1 de ratón se utilizó aquí para preparar la sonda de control, debido a que el anticuerpo monoclonal anti-EGFR es un anticuerpo de ratón de tipo IgG1.
detección y el estudio de unión cinética de EGFR a partir de extracto nuclear a las sondas PNB
La muestra de extracto nuclear Panc-1 se diluyó en tampón de fosfato (PB) a 1 mg /ml de proteína total. En una celda de muestra para dinámico de dispersión de luz (DLS) de medición (HELLMA QS cubetas 3 mm), 20 l de la sonda anti-EGFR-GNP se mezcló con 2 l de la muestra, y el aumento de tamaño de partícula fue leído con un instrumento DLS (sistema Zetasizer Nano ZS90 DLS, Malvern Instruments Ltd, Inglaterra) en exactamente 1, 6, 11, 16, y 30 min después de la mezcla. El mismo experimento se realizó también utilizando la sonda de IgG1 de ratón en el PNB. Con el fin de confirmar la especificidad de la sonda anti-EGFR-GNP en la detección de EGFR a partir de extracto nuclear, un experimento de inhibición se llevó a cabo mediante el tratamiento de 5 l de la muestra con 1 l de anticuerpo anti-EGFR monoclonal a temperatura ambiente durante 7 min y 24 min antes de usar la muestra en el ensayo. Después de esta incubación, 20 l de la sonda anti-EGFR-GNP se mezcló con 2 l de la muestra tratada, y el tamaño de partícula se leyó a 1, 6 y 11 min después de la mezcla.
complejo de unión de proteínas estudio socio utilizando anticuerpo policlonal
En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, a 80 l de la sonda anti-EGFRGNP se mezcló con 8 l de la muestra. Después de la incubación durante 30 min a temperatura ambiente, esta solución se dividió en cuatro porciones de 20 mL. Después de transferir a la célula de la muestra, el tamaño de partícula de cada una de estas partes se leyó con un instrumento DLS. Después de esta lectura, la solución se enriquece con un anticuerpo policlonal: ya sea con 1 l de anti-Stat3 o 2 l de anti-Src o 1 l de anti-EGFR o 0,5 l de IgG de conejo. El aumento de tamaño de las partículas se leyó a exactamente 5 minutos y 10 minutos después del inicio de la primera lectura.
Dispersión Dinámica de Luz (DLS) mediciones
Las medidas de DLS de todas las soluciones de muestra se realizaron utilizando un sistema Zetasizer Nano ZS90 DLS equipado con un láser rojo (633 nm) y un detector de avalancha de fotodiodos (APD) (eficiencia cuántica & gt; 50% a 633 nm) (Malvern Instruments Ltd). DTS aplicaciones de software 5.10 se utilizó para analizar los datos. El tamaño de partícula medio (promedio Z) de la solución se obtuvo usando un método Cumulant. Para cada muestra, diez medidas de DLS se llevaron a cabo con un cuadrangular, y cada ejecución se prolongó durante 10 segundos. Todas las mediciones se realizaron en un ángulo de detección de 90 °.
Resultados
Detección de EGFR nuclear, Src y Stat3 heterocomplejo
Hemos tratado de investigar el conjunto complejo de señalización y la dinámica de las interacciones de la hiperactivo Stat3, EGFR y Src [14], [16], [23] en el contexto del fenotipo de cáncer pancreático humano. Co-inmunoprecipitación (co-IP) con muestra el análisis de inmunotransferencia, immunecomplex EGFR de Panc-1 o Colo-357 lisados de células enteras contenía tanto Src y Stat3 (Fig. 1A (i)), Src immunecomplex contenían tanto EGFR y Stat3 (Fig . 1A (ii)), mientras que Stat3 inmunoprecipitado contenía EGFR y Src (Fig. 1A (iii)). Para la especificidad, la IgG de conejo no específico en la inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia para Src, Stat3 o EGFR mostraron ninguna proteína detectable (Fig. 1A, IgG, y datos no mostrados), y el análisis de inmunotransferencia realizado en el inmune precipita en presencia de los respectivos péptidos de bloqueo (BP) mostraron un bloque completo o casi completo de la detección inmunológica de Stat3, Src o EGFR, en comparación con los niveles detectados en la ausencia de los péptidos de bloqueo (Fig 1B (i) -. (iii), comparar + BP, paneles inferiores a - BP, paneles superiores). Se determinó el efecto de siRNA desmontables de EGFR o Src en la formación del complejo. Co-inmunoprecipitación con estudios de inmunotransferencia de lisados de células enteras a partir de células Panc-1 mostró que cuando se EGFR desmontables por siRNA (figura 1C (i), banda superior), Src immunecomplex permanece asociado con Stat3 (Fig. 1C (i), IP: Src), y viceversa (figura 1C (i.), IP: Stat3). Del mismo modo, cuando Src se desmontables de siRNA (Fig. 1C (ii), banda superior), immunecomplex EGFR permanece asociado con Stat3 (Figura 1C (ii), IP:. EGFR)., Y viceversa (Figura 1C (ii) , IP: Stat3). Revueltos (con) siRNA no tiene ningún efecto. Estos resultados indican que, con respecto a la EGFR, Src y Stat3 complejo heteromérico, proteínas Stat3 permanece asociado con Src o EGFR, respectivamente, después de la caída siRNA de EGFR o Src.
análisis de inmunotransferencia de inmunocomplejos de EGFR (IP : EGFR), Src (IP: Src), y Stat3 (IP: Stat3), o de IgG no específica no inmunoprecipitado preparado a partir de lisados de células enteras de Panc-1 o Colo-357 células no transfectadas (a y B) o transfectadas con EGFR siRNA, Src siRNA, o control (cON) siRNA (C) y el sondeo de Src, Stat3 y EGFR en ausencia (a y C) o presencia (B) de péptido bloquea Stat3 (Stat3 BP), péptido bloquea Src (Src BP) o EGFR péptido de bloqueo (EGFR BP). se muestran las bandas correspondientes a las proteínas en gel; entrada: salvo que se indique, representa la inmunotransferencia para la respectiva proteína inmunoprecipitada en la misma cantidad de lisado utilizado en el ensayo; Los datos son representativos de 3 estudios independientes.
Nos preguntamos si el EGFR, Src y Stat3 complejo heteromérica observada estuvo presente en el núcleo. Co-inmunoprecipitación con el análisis de inmunotransferencia de extractos nucleares muestra que EGFR immunecomplex contenía tanto Stat3 y Src (Fig 2A (i), IP:. EGFR), Src immunecomplex contenía tanto Stat3 y EGFR (Fig 2A (ii), IP:. Src) , mientras que Stat3 immunecomplex contenía tanto EGFR y Src (figura 2A (iii), IP:. Stat3). Estos datos demostraron la presencia del EGFR, Src y Stat3 complejo heteroméricos en el núcleo. Para la especificidad de los inmunorreactivos, las IgG de conejo muestras no específicas desplegables que se inmunotransfirieron de manera similar no mostraron EGFR detectable, Src o Stat3 (Fig. 2A, IgG y los datos no se muestra). análisis de inmunotransferencia de sondeo para la proteína de unión a TATA (TBP), se confirmó que los extractos utilizados en estos estudios son de origen nuclear (Fig. 2A (iv)). El complejo heteromérico se validó mediante la realización de análisis de inmunoprecipitación secuencial, en el que immunecomplex EGFR (IP: EGFR) se sometió adicionalmente a una inmunoprecipitación secundaria usando el anticuerpo anti-Src (IP: EGFR /IP: Src) y luego inmunotransferencia para EGFR y Stat3. Los resultados de estos estudios mostraron la presencia de EGFR y Stat3 en los inmunoprecipitados secuenciales (Fig 2B, IP:. EGFR /IP: Src). Por el contrario, IgG desplegable que se sometió a inmunotransferencia de EGFR o Stat3 no mostraron niveles detectables (Fig. 2B, IgG), además de confirmar la especificidad de los inmunorreactivos utilizados.
análisis (A y B) Immunoblotting de inmunocomplejos de EGFR (IP: EGFR), Src (IP: Src), Stat3 (IP: Stat3), EGFR /Src (IP: EGFR /IP: Src), o de IgG no específica no immuneprecpitate preparados a partir de extractos nucleares de Panc-1 o células Colo-357 y el sondeo de Stat3, EGFR, Src, o la proteína de unión a TATA (TBP); y (C), el análisis de inmunotransferencia de membrana (MEM) y fracciones citosólicas (cito) y de la energía nuclear (Nuc) extractos de células Panc-1 de sondeo para (i) EGFR, (ii) Stat3 y (iii) Src. se muestran las bandas correspondientes a las proteínas en gel; entrada: salvo que se indique, representa la inmunotransferencia para la respectiva proteína inmunoprecipitada en la misma cantidad de extracto nuclear usado en el ensayo; IP: EGFR /IP: Src, inmunoprecipitación secuencial con anticuerpos anti-EGFR y anti-Src anticuerpo; Los datos son representativos de 3 estudios independientes.
La presencia del EGFR, Src y Stat3 complejo en el núcleo de las células de cáncer de páncreas se investigó adicionalmente sometiendo preparaciones de extractos nucleares a análisis de cromatografía de columna de filtración en gel (Superdex200 , la exclusión límite de 200 kD), tal como se describe en "Materiales y Métodos", junto con el análisis de inmunotransferencia. Las fracciones recogidas, que mostraron pico de absorbancia a 280 nm (datos no mostrados) fueron immunoprobed. Los resultados mostraron que la proteína EGFR primero aparece en la fracción 23 y está presente junto con Stat3 y Src, y las tres proteínas se detectan simultáneamente en las fracciones 23-29 (Fig. S1A). Los resultados también mostraron proteínas detectables Stat3 y Src en las fracciones 30 a 32 bien después de EGFR se eluyó completamente (Fig. S1 A). El análisis de la acompañante de la proteína EGFR se informó anteriormente, el RNA helicasa A (RHA) [24] también mostró niveles detectables que eran predominantemente en las fracciones 23 y 24 (Fig. S1A, RHA). Estas fracciones se sometieron además a un análisis de co-inmunoprecipitación para validar la presencia del complejo. análisis de inmunotransferencia de EGFR immunecomplex preparó a partir de las fracciones reunidas 23-27 mostró además la presencia de Src y Stat3 (Fig. S1B). El temprano y la elución simultánea de EGFR, Src y Stat3 plantean la posibilidad de que cada una de las proteínas es parte de un complejo de proteínas de mayor peso molecular, y también que las tres proteínas asociadas como parte del mismo complejo, como se sugiere por la formación immunecomplex . Ha habido un informe anterior sobre el complejo EGFR /STAT3 nuclear bajo condiciones de estimulación celular por EGF [10]. Por ello, investigó si el EGFR nuclear, complejo Src, Stat3 estaba presente constitutivamente (ligando sin estimulación) en las células tumorales. Immunoblotting análisis no detectó niveles apreciables de Stat3 o Src en immunecomplex EGFR o de Src o EGFR en Stat3 inmunoprecipitado a partir de los extractos nucleares preparados a partir de cáncer de mama humano, el cáncer humano no microcítico de pulmón de células MDA-MB-231 y, líneas A549 (Fig. S1C), lo que sugiere una posibilidad mínima de la existencia de un EGFR nuclear constitutiva, Src, complejo Stat3 en los dos tipos de células de cáncer. Estos estudios juntos muestran por primera vez que el EGFR, Src y Stat3 forman un complejo heteromérico en el núcleo de las células de cáncer de páncreas.
Dada la detección de la EGFR, Src y Stat3 complejo en su conjunto de células y lisados nucleares , estábamos interesados para determinar los niveles relativos y los tamaños de EGFR, Src y Stat3 en las diferentes fracciones subcelulares. Fracciones de membrana y citosólicas y nucleares extractos se prepararon a partir de células Panc-1 de acuerdo con los protocolos establecidos, y que implicó el uso de un 10% de Nonidet P-40 lisis, y un bajo contenido de sal HEPES tampón de extracción de extracto citosólico, una extracción tampón HEPES alto contenido de sal para los extractos nucleares (18, 22), y tampón de SDS 0,5% para la fracción de membrana. análisis de las muestras de proteína total igual de las fracciones subcelulares inmunotransferencia muestra que, con respecto a cada uno de la proteína EGFR, Src, o Stat3, el tamaño es la misma en la membrana (Mem), citosólica (cito), o fracción nuclear (Nuc) (Fig. 2C). Los resultados muestran, además, que el nivel de la proteína total EGFR es la más alta en la membrana, y es mayor en la fracción citosólica que en el extracto nuclear (Fig. 2C (i)). Por el contrario, los resultados muestran que los niveles de Stat3 son más altos en la fracción citosólica, y más alta en el extracto nuclear, en comparación con los niveles asociados con la membrana celular (Fig. 2C (ii)). Los resultados para Src también mostraron diferencias notables, con los niveles asociados a la membrana más altos que tanto la citosólica y los niveles nucleares, que eran casi idénticos (Fig. 2C (iii)). S2.