Extracto
Uno de los métodos para mejorar el tratamiento del cáncer es el uso de fármacos de nanopartículas funcionalizadas con ligandos de orientación que reconocen receptores expresados de forma selectiva por las células tumorales. En teoría tales ligandos dirigidos deben entregar específicamente el fármaco de nanopartículas para el tumor, el aumento de la concentración de fármaco en el tumor y la entrega de la droga a su sitio de acción en el tejido tumoral. Sin embargo, la vasculatura de los tumores con fugas combinados con un sistema linfático pobres permite la acumulación pasiva, y retención posterior, de materiales de tamaño nanométrico en los tumores. Además, un gran tamaño de las nanopartículas puede impedir la penetración en el tumor. Como tal, el papel de la orientación activa en la liberación de nanopartículas, es objeto de controversia, y es difícil predecir cómo un medicamento de nanopartículas dirigidas se comportará
in vivo
. Aquí mostramos
in vivo
estudios para α
vβ
6-específica H2009.1 péptido dirigido doxorrubicina liposomal, que aumentó la entrega liposomal y toxicidad para las células del cáncer de pulmón
in vitro
. Nos variando sistemáticamente la afinidad del ligando, la densidad de ligando, ligando la estabilidad, la dosis de liposomas, y en modelos tumorales para evaluar el papel de la orientación activa de los liposomas a a
vβ
6. En contraste directo con los
in vitro
resultados, se demuestra ninguna diferencia en
in vivo
la orientación o la eficacia de H2009.1 tetramérica doxorrubicina liposomal péptido, en comparación con el control de péptidos y no péptidos liposomas. Examen de la acumulación de liposoma y distribución dentro del tumor demuestra que el liposoma, y no el péptido H2009.1, unidades de acumulación tumor, y que ambos H2009.1 objetivo y liposomas no dirigidos se mantienen en las regiones perivasculares, con poca penetración en el tumor. Por lo tanto H2009.1 liposomas dirigidos no mejoran la eficacia del fármaco debido a que la plataforma de fármacos de liposomas evita que el péptido H2009.1 tanto de la orientación activamente el tumor y la unión a células tumorales en todo el tejido tumoral. Por lo tanto, el uso de un ligando de alta afinidad y alta especificidad dirigida contra una biomarcador tumoral sobreexpresado no garantiza la eficacia de un fármaco liposomal mejorada. Estos resultados ponen de manifiesto la complejidad de
in vivo
focalización
Visto:. Gray BP, McGuire MJ, Brown KC (2013) Una plataforma liposomal Drogas anulaciones péptido ligando de dirección a un biomarcador del cáncer, con independencia de ligando de afinidad o densidad. PLoS ONE 8 (8): e72938. doi: 10.1371 /journal.pone.0072938
Editor: Stephanie Filleur, Universidad Tecnológica de Texas Health Sciences Center, Estados Unidos de América
Recibido: 31 de mayo de 2013; Aceptado: 14 Julio 2013; Publicado: 23 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Gray et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Welch subvención#I-1622 y los Institutos nacionales de Salud /Instituto Nacional del cáncer (NCI) de subvención#1R01CA164447 (a KCB). BPG fue apoyado por una beca del Instituto de Investigación y Prevención del Cáncer de Texas (RP 101496). Los recursos compartidos de imagen de UT Southwestern están soportados en parte por una subvención del NCI apoyo al Centro de Cáncer de Simmons Harold (P30 CA142543). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es la primera causa de muerte en el mundo, y se prevé que el número de muertes relacionadas con el cáncer en aumento en las próximas décadas [1]. Un paradigma para mejorar el tratamiento del cáncer es el desarrollo de la orientación terapias que usan ligandos específicos del tumor para entregar selectivamente fármacos a las células cancerosas, lo que aumenta la acumulación del fármaco en el tumor y la disminución de efectos tóxicos no deseados de acumulación del fármaco en otras áreas del cuerpo. ligandos específicos de tumores se acumulan preferentemente en tumores debido a la especificidad para un receptor expresado de forma selectiva por las células del tumor o la vasculatura tumoral (y no se expresa por las células normales). fármacos de nanopartículas son particularmente atractivos para su uso con ligandos específicos de tumor debido a la encapsulación del fármaco dentro de una nanopartícula, que impide que la actividad del fármaco hasta su liberación desde la nanopartícula y puede aumentar el tiempo de circulación de la sangre.
pegilada de doxorrubicina liposomal (Doxil ® /CAELYX®) fue el primero de nanopartículas aprobado clínicamente para el tratamiento del cáncer. DOXIL® es de aproximadamente 100 nm de tamaño, contiene la antraciclina doxorrubicina quimioterapéutico [2], y en la actualidad está aprobado para el tratamiento de cáncer de ovario [3], mieloma múltiple [4], y el sarcoma de Kaposi [5], tanto en los Estados Unidos y Europa y para su uso en pacientes con cáncer de mama en Europa [6]. Numerosos ensayos clínicos con el fármaco están en curso, incluyendo ensayos en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [7]. Debido al éxito clínico de DOXIL®, la mayoría de los ligandos de orientación conjugados con nanopartículas para administración dirigida de fármacos se han conjugado a las formas liposomales de doxorubicina. Ambos ligandos de anticuerpo y péptido de direccionamiento se han utilizado para aumentar la eficacia y reducir la toxicidad de la doxorrubicina liposomal por dirigidos activamente células vasculatura del tumor y tumorales [8-25]. De particular interés, anti-HER2 doxorrubicina liposomal doxorrubicina liposomal y formulaciones anti-EGFR se encuentran en la Fase I de ensayos clínicos [26,27]. Además, doxorrubicina liposomal conjugado a un péptido derivado de la vasculatura tumoral péptido dirigido NGR [28] se ha preparado para los posibles futuros ensayos clínicos mediante la preparación utilizando las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) [29].
Se incluyen entre los muchos ventajas del uso de doxorrubicina liposomal para dirigir las terapias de drogas es la alta relación de orientación ligando debido a los miles de moléculas de doxorrubicina atrapados dentro de cada liposoma. Además, doxorubicina liposomal pegilada goza
in vivo
largos tiempos de circulación [30], que se extiende el tiempo de ligandos han de entregar su carga al tumor. Un factor importante que contribuye a la eficacia del fármaco liposomal es la acumulación pasiva de las partículas de tamaño nanométrico en el tumor a través de la permeabilidad mejorada y retención (EPR) efecto [31]. A diferencia de la vasculatura de los tejidos normales, la vasculatura del tumor es irregular y desordenada. partículas de tamaño nanométrico pueden escapar a través de este sistema vascular fugas en el tejido tumoral circundante y son posteriormente retenidos dentro del tumor debido a los sistemas de drenaje linfático pobres de tumores. Por lo tanto la acumulación de tumor de los liposomas de ligandos orientados no sólo depende de la ligando de direccionamiento específico, sino también en los efectos accionados-EPR. El papel de la orientación activa en la entrega de las nanopartículas a los tumores es controvertido [32-36].
Los estudios con liposomas dirigidos han demostrado dos mecanismos para mejorar la acumulación del fármaco tumor, los cuales conducen a los resultados terapéuticos deseables. Algunos liposomas péptidos dirigidos, en particular los dirigidos a la vasculatura del tumor, incluyendo los NGR-liposomas, ofrecen más doxorubicina a los tumores que los liposomas no dirigidos [9,16], lo que sugiere que los liposomas dirigidos se acumulan en el tumor basado en tanto el péptido dirigido habilidades y el efecto EPR. Otras formulaciones de liposomas por anticuerpos, incluyendo anti-HER2 y liposomas anti-EGFR, se acumulan en el tumor en niveles similares a los liposomas no dirigidos. Sin embargo a diferencia de los liposomas no dirigidos, estos liposomas dirigidos internalizan en las células tumorales y presentan una mejor distribución en todo el tejido tumoral [37,38]. Mientras que el ligando de direccionamiento no anula el efecto EPR conducción acumulación tumor de estas formulaciones liposomales, la ubicación alterada de la droga a su sitio de acción dentro de las células tumorales aumenta la eficacia. Debido al efecto EPR y la diferente estructura vascular de todos los tumores, es difícil predecir cómo una formulación de liposomas de orientación no probado se acumulará en los tumores y afectar el crecimiento del tumor.
Recientemente hemos descrito el desarrollo de péptido dirigido doxorrubicina liposomal formulaciones específicas para los α receptor expresado de forma restrictiva
vβ
6 [39]. Las integrinas α
vβ
6 está emergiendo como un blanco cáncer ideales; se expresa por una variedad de tipos de cáncer del epitelio [40-50] y sólo rara vez se expresan en el tejido normal [51]. De particular interés es la prevalencia de la α
vβ
6 en el cáncer de pulmón, la principal causa de muerte de cáncer de los hombres y las mujeres [1]. Más de la mitad de los pacientes de cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) de los tumores expresan α
vβ
6, y la expresión de la integrina está "encendido" durante las primeras etapas de NSCLC carcinogénesis y permanece elevada a lo largo de la progresión de la enfermedad [52].
Hemos identificado y posteriormente optimizada un α
vβ
6-péptido específico, H2009.1 [53]. El péptido monomérico une a las células H2009 adenocarcinoma de NSCLC con una afinidad de unión semi-máxima de 9,2 nM, y sintetizar el péptido H2009.1 como un péptido tetrámero fago imitan la estructura aumenta la afinidad de 23:00 [54]. Tanto los péptidos monoméricos y tetramérica internalizan en α
vβ
6-células que expresan
in vitro
y de destino tumores en
in vivo
. Con el objetivo de traducir péptidos aislados de bibliotecas de presentación de fagos en agentes terapéuticos efectivos de entrega, hemos examinado la mejor plataforma para la visualización de los péptidos H2009.1 en doxorrubicina liposomal para la administración de fármacos
in vitro
, variando tanto péptido liposomal densidad y péptido valencia [39].
In vitro
, la formulación de liposomas más eficaz muestra el péptido tetrámero H2009.1 a una densidad de 1,3% del contenido total de lípidos. La formulación de liposomas H2009.1 tetramérica 1,3% era 2 veces más tóxico para las células que los liposomas que llevan el control mezclado péptido scH2009.1 y más de 10 veces más tóxico que el desnudo, no peptídicos, los liposomas. A pesar de estos
in vitro
resultados, no está claro si la misma formulación liposómica será mejor α destino
vβ
6-expresando tumores
in vivo
. Existen diferencias significativas entre el
in vitro
a
in vivo
contextos, incluidas las posibles diferencias en la expresión del receptor y la disponibilidad, la estructura de la vasculatura del tumor, y los efectos de la droga. biodistribución
Examinar la mejor H2009.1 dirigido formulación doxorrubicina liposomal para inhibir la α
vβ
6-expresando el crecimiento del tumor
in vivo
, que sistemáticamente variada afinidad del ligando, la densidad de ligando, ligando la estabilidad, la dosis de liposomas, y el tumor modelos para evaluar el papel de la orientación activa del liposoma en tres modelos de NSCLC. A pesar de las diferencias de orientación entre las diferentes formulaciones de liposomas
in vitro
, todas las plataformas de liposomas péptidos H2009.1 exhiben eficacia idéntica
in vivo
. Además, no hay ninguna diferencia entre la eficacia de los liposomas H2009.1 y control de los liposomas no peptídicos. Experimentos posteriores demostraron que este resultado es debido a la acumulación tumoral de liposomas a base de EPR y el fracaso de los liposomas para penetrar en el tejido tumoral pasado áreas inmediatamente adyacentes a la vasculatura del tumor, a pesar de la expresión generalizada de α
vβ
6 en el tumor . Estos resultados ponen de manifiesto la complejidad de
in vivo
fármaco que se dirige, incluso cuando se utiliza un ligando de alta afinidad conocida para atacar selectivamente a los tumores
in vivo
, y sugieren que una gran nanopartícula puede no ser la mejor focalización plataforma para que cada ambiente del tumor.
Materiales y Métodos
Materiales
Todos los aminoácidos Fmoc fueron comprados a Novabiochem® (Merck Millipore, Billerica, MA). Sepharose CL-4B y Sephadex G-50 se adquirieron de Sigma-Aldrich Inc. (Livermore, CA). Los lípidos fueron adquiridos de Avanti® Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) y HCl de doxorrubicina inyectable de Bedford Laboratories ™ (Bedford, OH). El Probes® Molecular tiñe DiI [DiI (C)
18 (3), 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina perclorato] y DiR [DIOC
18 (7) , 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindotricarbocyanine yoduro], se adquirieron de Life Technologies ™ (Grand Island, NY). Para el cultivo celular, suero bovino fetal (FBS) se adquirió de Gemini Bio-Products (West Sacramento, CA) y tanto RPMI 1640 y tripsina EDTA, 1x de Mediatech, Inc. (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).
líneas celulares
Todas las líneas celulares de cáncer humanas utilizadas fueron previamente establecido y caracterizado [55]. Las líneas celulares se obtuvieron del Centro Hamon Terapéutica de Oncología de Investigación de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center. Las líneas celulares fueron probados rutinariamente para Mycoplasma y las huellas digitales de ADN para confirmar su identidad. Las líneas celulares H2009, H1975, H460 y todos fueron cultivadas a 37 ° C y 5% de CO
2 en RPMI 1640 suplementado con FBS al 5%.
Síntesis de péptidos y purificación
Tanto péptidos H2009.1 y scH2009.1 monoméricos y tetraméricos fueron sintetizados como se describe anteriormente [54]. En pocas palabras, todos los péptidos monoméricos y el núcleo tetramérica necesario para que los péptidos tetrámeros se sintetizaron en un Sintetizador sinfonía (Rainin Instruments, Protein Technologies, Inc., Tucson, AZ) mediante síntesis de péptidos en fase sólida estándar de Fmoc. Los péptidos tetraméricos fueron sintetizados por reacción de un exceso de 5 veces de los péptidos monoméricos cisteína teniendo purificadas con maleimida purificada activa núcleo tetramérica, en una solución de PBS + EDTA 10 mM con agitación a TA durante 2 horas. Todos los péptidos se purificaron por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (HPLC) utilizando una ESPÍRITU ™ péptido C18 5 m, 25 x 2,12 columna (AAPPTec®, Louisville, KY) en un HPLC Breeze ™ (Waters Corporation, Milford, MA) de acuerdo a condiciones de elución publicados [54]. Se utilizó láser tiempo de desorción /ionización asistida por matriz de espectrometría de masas de vuelo para confirmar masa péptido (Voyager-DE ™ PRO, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Las masas de los péptidos monoméricos (masa promedio calculado /MH +: 1843.02 /1844.18) y el núcleo tetrámero (masa promedio calculado /MNa +: 1251.49 /1274.27) se determinaron en el modo reflexivo usando α-ciano-4-hidroxicinámico como matriz. Las masas de los péptidos tetrámeros (masa promedio calculado /MH +: 8629.01 /8626.77) se determinaron en modo lineal usando ácido sinapínico como matriz
Preparación de doxorrubicina liposomal
Los liposomas se prepararon a partir de soluciones. de los lípidos de soja hidrogenado L-α-fosfatidilcolina (HSPC), colesterol, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [carbonilo-metoxi (polietilenglicol) -2.000] (DSPE-PEG
20.000), y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [maleimida (polietilenglicol) -2.000] (DSPE-PEG
2000-maleimida) en 2: 1 cloroformo: metanol. Los 0,64% liposomas se preparan a partir de mezclas de 100 mg (131 mol) de HSPC, 25,4 mg (65,6 mmol) de colesterol, 14,7 mg (5,20 mmol) de DSPE-PEG
20000 y 3,85 mg (1,31 mmol) de DSPE PEG
2000-maleimida. Los 1,3% liposomas se preparan a partir de mezclas de 100 mg (131 mol) de HSPC, 25,4 mg (65,6 mmol) de colesterol, 10,9 mg (3,87 mmol) de DSPE-PEG
20000 y 7,92 mg (2,69 mmol) de DSPE PEG
2000-maelimide. El disolvente se eliminó bajo una corriente lenta de nitrógeno a 45
° C, y la película de lípido se dejó bajo vacío durante la noche. La película lipídica seca se hidrató con 155 mM (NH
4)
2SO
4, pH 5,5, calentando de forma intermitente a 65
° C y agitación en vórtex. Los liposomas se extruyen posteriormente 20 veces a través de membranas de doble apilados de 100 nm, y se utilizaron columnas PD-10 de desalación (GE Healthcare, Waukesha, WI) para cambiar el tampón liposómico externo a citrato sódico mM 123, pH 5,5. La doxorubicina se cargó de forma remota (formación post-liposoma) por incubación de los liposomas y la doxorrubicina en 65
° C durante 1 hora. doxorubicina libre se eliminó usando una columna de Sephadex G-50 equilibrada con solución salina tamponada con HEPES. Los péptidos se conjugaron a los liposomas mediante la reacción durante 24 horas en una proporción de 2: 1 péptido:. DSPE-PEG
2000-maelimide en una solución de HEPES solución salina tamponada, y el exceso de péptido se eliminó usando columnas Sepharose CL-4B
liposomas Preparación de DiI o DiR marcado
Dye liposomas marcados se prepararon como se ha descrito excepto que no se cargaron con doxorrubicina. La formulación de liposomas 1,3% se preparó con la adición del colorante DiI o DiR en la mezcla de los lípidos en 2: 1 cloroformo: metanol. Los colorantes DiR DiI o se disolvieron en etanol a una concentración de 2,5 mg /ml y se añadieron a la mezcla de lípidos en una proporción de 3,75 g de colorante /0,5 mg de lípidos. El disolvente se eliminó bajo una corriente lenta de nitrógeno a 45
° C, y la película de lípido se dejó bajo vacío durante la noche. La película lipídica seca se hidrató con 155 mM (NH
4)
2SO
4, pH 5,5, calentando de forma intermitente a 65
° C y agitación en vórtex. Los liposomas se extruyen posteriormente 20 veces a través de 100 membranas de doble apiladas nm, y se utilizaron columnas PD-10 de desalación (GE Healthcare, Waukesha, WI) para cambiar el tampón liposómico externo a HEPES solución salina tamponada. Los péptidos se conjugaron a los liposomas mediante la reacción durante 24 horas en una proporción de 2: 1 péptido:. DSPE-PEG
2000-maelimide en una solución de HEPES tamponada se eliminó el exceso de solución salina y péptido utilizando columnas de Sepharose CL-4B
Establecimiento de modelos de tumores de ratón
Animal protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales Institucional de UT Southwestern Medical Center (número de Animales de aseguramiento del bienestar A3472-01, número de protocolo 2010 a 0280). Todo imágenes se realizó en virtud de isoflurano, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. NOD hembra /ratones SCID (desde la instalación de cría Core UT Southwestern Medical Center de ratón) se inyectaron con 1 millón H2009, H1975, H460 o células en el flanco derecho. Se inyectaron todas las células en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, y se prepararon para la inyección mediante la incubación de las células con 0,05% de tripsina-EDTA (Gibco®, Life Technologies ™, Grand Island, NY) durante 10 minutos, enfriar rápidamente la tripsina con medios de comunicación, y lavando las células con tampón fosfato salino antes de la suspensión final en la solución salina tamponada con fosfato a una concentración de 10 millones de células por ml.
los experimentos in vivo terapéuticas
tumores subcutáneos H2009 se establecieron en el flanco de NOD /SCID. Una vez que se habían formado tumores palpables, 18 días después de la implantación de células tumorales, los ratones fueron tratados con HBS (control) o diferentes formulaciones de liposomas, basado en la concentración total de doxorrubicina. La formulaciones de liposomas y las dosis de tratamiento diferentes se describen en detalle en la sección Resultados. Para todos los experimentos, los ratones se trataron una vez por semana durante 3 semanas, en los días 18, 25 y 32, a través de inyección en vena de cola. Los tumores se midieron por un científico independiente, y los volúmenes de los tumores se calculan a partir de la fórmula
V
=
(largo × ancho
2
)
/2.
Métodos estadísticos
la significación estadística de las diferencias en el tamaño del tumor entre los grupos tratados con el fármaco y el grupo de control se calcularon usando ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett y entre los diferentes grupos tratados con fármaco, utilizando ANOVA de una vía con múltiple de Tukey prueba de comparación. La significación estadística de las diferencias entre las curvas de supervivencia se calcularon a partir de curvas de Kaplan-Meier con log-rank pruebas. Todos los cálculos se determinaron utilizando GraphPad Prism.
En vivo y ex vivo de imágenes de infrarrojo cercano
Ratones teniendo H2009 subcutánea, se inyectaron H1975, H460 o tumores en el flanco derecho a través de la vena de la cola con dir- liposomas marcados en una concentración de 22,22 mol de fosfolípido /kg. Este fosfolípido /kg concentración se correlaciona con la misma cantidad de fosfolípido (y por lo tanto el mismo número de liposomas) como presente en un tratamiento de 4 mg /kg de doxorrubicina liposomal. ratones portadores de tumor H2009 y H460 fueron inyectados con versiones marcadas con DiR del tetramérica 1,3% H2009.1, tetramérica AcH2009.1, tetramérica scH2009.1, o liposomas desnudos con 3 ratones por grupo de liposomas. Ratones portadores de tumores H1975 fueron inyectados con versiones marcadas con DiR del tetrámero H2009.1 1,3%, tetramérica scH2009.1, o liposomas desnudos con 3 ratones por grupo de liposomas. Para cada ratón, Nair® se utiliza para eliminar todo el pelo de la mitad inferior del cuerpo. A las 24, 48, y 72 horas después de la inyección en liposomas, los ratones fueron imágenes de DiR fluorescencia del colorante usando un Lumina IVIS® (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Después de formación de imágenes conjunto ratón a las 72 horas, todos los ratones fueron sacrificados y los órganos extraídos para
ex vivo
imágenes fluorescentes. Para cada ratón, los órganos fueron imágenes en ambos lados, y el promedio del valor de la eficiencia radiante de ambos lados se utiliza como el valor real de la acumulación de liposomas en ese tejido.
Microscopía de DiI liposomas en secciones de tumor
se inyectaron ratones portadores H2009, H1975, o tumores H460 subcutáneos través de la vena de la cola con liposomas DiI-marcadas a una concentración de 22,22 mol de fosfolípido /kg. Para cada tipo de tumor, los ratones fueron inyectados con DiI-etiquetados versiones de la tetramérica H2009.1 1,3%, tetramérica scH2009.1, o liposomas desnudos, con 3 ratones por grupo de liposomas. Un ratón de cada grupo de tratamiento se sacrificó a las 24 horas, un segundo ratón a las 48 horas, y el tercero de ratón a las 72 horas. Después del sacrificio, los tumores se retiraron y se congelaron rápidamente en el interior criomoldes usando Tissue-Tek O.C.T. Compuesto medio de montaje (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).
Para microscopía, los tumores se seccionaron a 10 micras usando un criostato Leica CM3050S (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Las secciones se obtuvieron a partir de la parte superior, media e inferior de cada tumor. Para la tinción de la vasculatura, un anticuerpo primario CD31 (Rat anti-ratón CD31, catálogo#550274, BD Biosciences, San Jose, CA) se utilizó a una dilución de 1:50 y un anti-rata anticuerpo secundario de cabra fluoresceína (catálogo#A10528, Life Technologies ™, Grand Island, NY) se utilizó a una dilución de 1: 100. Los portaobjetos se montaron con DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) y la imagen en un microscopio Leica CTR5500 (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) y un DeltaVision
PDV
microscopio deconvolución (Applied Precision, Inc., Issaquah, WA).
β
6 la tinción de secciones de tumores
tumor secciones preparadas a partir de los tumores que contienen Dil-liposomas se tiñeron para β
6 expresión utilizando una β
6 anticuerpo primario (catálogo#MAB2076Z, Merck Millipore, Billerica, MA) a una dilución de 1:50 y una cabra fluoresceína anti-rata anticuerpo secundario (catálogo#A10528, Life Technologies ™, Grand Island, NY) a una dilución 100: 1. Las diapositivas fueron imágenes en un microscopio Leica CTR5500 (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) y un Deltavision
PDV
microscopio deconvolución (Applied Precision, Inc., Issaquah, WA).
Resultados
eficacia in vivo de H2009.1 tetramérico péptido liposomas orientación α
vβ
6
Para examinar si la α
vβ H2009.1
6-específica péptido puede ser usado para aumentar el
in vivo
la entrega y la eficacia de la doxorubicina liposomal hacia α
vβ
6-expresión de los tumores de NSCLC, nos propusimos estudiar los efectos de la densidad de péptidos en liposomas y la valencia de resultados terapéuticos en ratones portadores de tumores. Comenzamos por el tratamiento de ratones portadores de tumores con el H2009.1 tetramérica formulación de péptido liposoma 1,3% que demostraron la mejor
in vitro
eficacia con la toxicidad no específica limitada [39]. En esta formulación liposómica de 1,3%, el 1,3% del total de lípidos está modificado con maleimida para permitir que los péptidos de cisteína que llevan a la pareja a través de la química de los lípidos cisteína-maleimida. Por lo tanto, 1,3% de los lípidos que comprenden cada liposoma llevan el péptido H2009.1, lo que resulta en aproximadamente 1400 péptidos por liposoma. El acoplamiento del péptido H2009.1 tetramérica a los 1,3% resultados formulación de liposomas en una pantalla multivalente basada en nanopartículas del péptido tetrámero multivalente inherentemente, resultando en una multivalencia capas que conduce a una mayor especificidad y una mayor toxicidad hacia α
vβ
6-que expresan las células NSCLC
in vitro
en que los liposomas modificados con el péptido monomérico H2009.1.
H2009 células NSCLC, que expresan α
vβ
6, se inyectaron en ratones NOD ratones /SCID para formar xenoinjertos subcutáneos H2009. Al día 18, una vez que los ratones habían formado tumores palpables, ellos fueron tratados con solución salina tamponada con HEPES (HBS) como control; libre, no encapsulado en liposomas, doxorrubicina; α
vβ
6-dirigida 1,3% doxorrubicina liposomal H2009.1 tetramérica; o controlar las formulaciones de doxorrubicina liposomal. Dos formulaciones de liposomas diferentes se utilizaron como controles no específica: 1,3% "desnudo", sin péptido, los liposomas y 1,3% liposomas scH2009.1 tetraméricos. Los 1,3% liposomas desnudos sirven como un control de liposomas dirigidos no peptídico normal, que sólo debe acumular pasivamente en los tumores basados en el efecto EPR. Los liposomas 1.3% scH2009.1 tetrámeros muestran una secuencia codificada versión del péptido H2009.1 que no se dirige α
vβ
6; Por lo tanto, estos liposomas sirven como un control para la especificidad del péptido H2009.1 y aseguran que la carga y la hidrofilia del péptido no está conduciendo la acumulación de tumor. Los ratones se trataron a través de la vena de la cola inyecciones intravenosas una vez por semana durante 3 semanas con 4 mg /kg de cada formulación de liposomas, a partir de la concentración total de doxorrubicina, en días 18, 25, y 32 después de la implantación de células tumorales. Este régimen proporcionará la dosis máxima tolerada de por vida para los ratones NOD /SCID en un período de 2 semanas [56]. inyecciones semanales fueron elegidos en base a estudios previos; más inyecciones en una dosis más baja han demostrado ser de eficacia similar como una dosis semanal más alta para otros liposomas con la misma formulación de lípidos [2,16,57,58].
Como se muestra en la Figura 1A, todos los liposomas formulaciones crecimiento del tumor inhibió significativamente en comparación con los tratados HBS control de grupo, con valores de p inferior a 0,001. Sin embargo, no se observó diferencia entre cualquiera de las formulaciones de liposomas. Los dirigidos 1,3% liposomas H2009.1 tetraméricas inhibieron el crecimiento del tumor en la misma medida ya que tanto el control de tetramérica scH2009.1 o liposomas desnudos. Las tasas de crecimiento del tumor son prácticamente idénticos hasta día 64, momento en el que la curva tetramérica scH2009.1 separa ligeramente, pero está todavía dentro del margen de error de la tetramérica H2009.1 y grupos de liposomas desnudos. Es importante destacar que este efecto es reproducible; los datos de la Figura 1A representan la combinación de múltiples experimentos llevados a cabo por separado.
tumores subcutáneos H2009 se establecieron en el flanco de los ratones NOD /SCID. Portadores de tumores de ratones fueron tratados con HBS (control) y, o bien 4 mg /kg (
Un CD -
B Opiniones) o 2 mg /kg (
C CD -
D
) de doxorrubicina libre o la tetramérica H2009.1 1,3%, tetramérica scH2009.1, o liposomas desnudos, basado en la concentración total de doxorrubicina.
A
) curvas de crecimiento del tumor para los ratones tratados con 4 mg /kg de las diferentes formulaciones de liposomas demuestran que la α
vβ
6 de metas de 1,3% liposomas H2009.1 tetraméricas inhibir el crecimiento tumoral a la misma medida como el tetrámero de control scH2009.1 y desnudo, sin péptido, liposomas. (
B
) Kaplan-Meier de supervivencia para los ratones tratados con 4 mg /kg de las diferentes formulaciones de liposomas demuestran que todos los tratamientos de liposomas aumentan significativamente la supervivencia en comparación con los ratones control (p & lt; 0,0001 para la H2009.1 tetramérica y liposomas desnudos y p = 0,0007 para los liposomas scH2009.1 tetraméricos), y el tratamiento con los liposomas H2009.1 tetraméricas aumenta la supervivencia en comparación con el tratamiento con liposomas de control scH2009.1 tetraméricas (p = 0,0068). (
C
) curvas de crecimiento del tumor para los ratones tratados con 2 mg /kg de las diferentes formulaciones de liposomas demuestran que la doxorrubicina libre y todas las formulaciones de liposomas inhiben significativamente el crecimiento del tumor en comparación con los ratones control, y las 3 formulaciones de liposomas inhiben tumor el crecimiento en la misma medida en niveles significativamente mejor que la doxorrubicina libre. (
D
) Kaplan-Meier de supervivencia para los ratones tratados con 2 mg /kg de las diferentes formulaciones de liposomas demuestran ninguna diferencia significativa en la supervivencia entre los ratones tratados con doxorubicina libre o cualquiera de las formulaciones de liposomas. (
E Hotel & amp;
F
) Las comparaciones directas del crecimiento del tumor (
E
) y supervivencia (
F
) de ratones tratados con 4 mg /kg o 2 mg /kg de los liposomas H2009.1 tetraméricas 1,3% demuestra que el tratamiento /4 mg kg fue significativamente mejor en la inhibición de crecimiento del tumor y aumentó significativamente la supervivencia (p = 0,0005). Las flechas indican los días de tratamiento. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0.001verses de control, a menos que se indique lo contrario con los soportes.
También se determinó la supervivencia global de los ratones en el régimen de tratamiento diferente. Libre, no encapsulado en liposomas, doxorrubicina resultó tóxico para los ratones en este régimen de dosificación de 4 mg /kg. Los ratones tratados con doxorubicina libre de todos murieron en el día 32, antes de recibir la dosis tercera y última de las drogas. Por lo tanto, dos inyecciones de 4 mg /kg de doxorrubicina, para un total de 8 mg /kg de doxorrubicina, son suficientes para la toxicidad inducida por el fármaco en nuestros estudios. Todos los otros ratones vivieron hasta que fueron sacrificados debido a sus tumores alcanzando una longitud de 2 cm (Figura 1B). Como era de esperar a partir de las curvas de crecimiento tumoral, hubo una diferencia significativa en la supervivencia entre el grupo de control y todos los grupos de tratamiento de liposomas (p & lt; 0,0001 para la tetramérica 1,3% H2009.1 y liposomas desnudos y p = 0,0007 para el scH2009 1,3% .1 los liposomas tetrámeros). Mientras que tres de los ratones tratados con 1,3% H2009.1 tetramérica liposoma vivieron más tiempo que cualquiera de los ratones tratados con liposomas desnudos 1,3%, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Sin embargo, hubo una diferencia significativa en la supervivencia entre los ratones tratados con el tetramérica H2009.1 1,3% y scH2009.1 liposomas tetraméricas (p = 0,0068). Por lo tanto, aunque el tratamiento con los liposomas H2009.1 tetrámeros 1,3% no mejoró la eficacia terapéutica en un régimen de dosificación de 4 mg /kg en comparación con los liposomas no dirigidos desnudos, estos α
vβ
6-liposomas dirigidos aumento de la supervivencia en comparación con los péptidos de control liposomas scH2009.1 tetrámeros.
Efectos de Dosis de liposomas sobre la eficacia in vivo del péptido liposomas H2009.1
Como no hubo mayor beneficio terapéutico para el 1,3% de los liposomas mostrando el tetramérica H2009.1 versos péptido control liposomas desnudos, razonó que la α
vβ focalización
6-específica de los liposomas péptidos H2009.1 podría estar enmascarada por la eficacia de los liposomas desnudos en concentraciones de tratamiento de 4 mg /kg (12 mg /kg en total). Esto podría dar lugar al saturar el receptor de tal manera que las diferencias entre la orientación activa y pasiva se ven disminuidos.