Extracto
esferoides multicelulares se enriquecen en la ascitis de cáncer de ovario (Ovča) pacientes epiteliales. Ellos representan una población celular invasiva y quimioresistente fundamental para la diseminación metastásica. Los mecanismos moleculares que desencadenan sola célula egreso invasivo de esferoides siguen siendo enigmática. forminas MDIA son efectores Rho GTPasa que son reguladores clave de la dinámica del citoesqueleto de actina F. La hipótesis de que impulsados por la dinámica mdia2 F-actina promover transiciones invasivos de células individuales en esferoides (3D) Ovča tridimensionales clínicamente relevantes. El presente estudio es una disección de la contribución del factor de montaje formin mdia2 F-actina en las transiciones invasivos y utilizando un modelo esferoide cáncer de ovario clínicamente relevante. Se demuestra que se requiere la actividad mdia2 dirigida por RhoA para la organización esferoide apretado, y el enriquecimiento de mdia2 en las protuberancias celulares invasivos de esferoides OVCA429 colágeno incrustado. Mdia2 ozono en ES-2 esferoides mejor difusión invasivo de las células individuales con forma ameboide. Esto contrasta con esferoides tratados con siRNA control, donde predominó un programa invasión mesenquimales. La inhibición de otro efector de RhoA, ROCK, no tuvo impacto en ES-2, pero la formación de esferoides invasión esferoide drásticamente inhibida mediante la inducción de una morfología muy alargada. la inhibición simultánea de roca y mdia2 bloqueó la invasión de células individuales de ES-2 esferoides con más eficacia que la inhibición de la proteína, ya sea por sí solo, lo que indica que la salida invasivo de las células ameboides de esferoides-agotado mdia2 es ROCK-dependiente. Nuestros resultados indican que múltiples efectores GTPasa se deben suprimir con el fin de bloquear completamente la salida invasiva de esferoides de cáncer de ovario. Además, interacción estrechamente regulado entre la roca y vías de señalización mdia2 dicta las capacidades invasivas y el tipo de programa invasión utilizada por las células del cáncer de ovario esferoides derivados de móviles. A medida que la pérdida del gen que codifica mdia2,
DRF3, España se ha relacionado con la progresión del cáncer y la metástasis, nuestros resultados establecen el escenario para la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la salida mdia2 dependiente de las células invasivas de tumores epiteliales primarias.
Visto: Pettee KM, Dvorak KM, Nestor-Kalinoski AL, Eisenmann KM (2014) Un mdia2 /ROCK señalización del Eje Regula invasiva de egreso de cáncer epitelial de ovario esferoides. PLoS ONE 9 (2): e90371. doi: 10.1371 /journal.pone.0090371
Editor: Ponto Aspenström, Karolinska Institutet, Suecia |
Recibido: 22 Octubre, 2013; Aceptó 3 de febrero de 2014; Publicado: 28 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Pettee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Toledo Fundación (KME, ALNK), el Departamento de Defensa Premio cáncer ovárico Concept (KME, OC073269), el Fondo de Dotación Memorial DeArce de Apoyo a la Investigación y Desarrollo (KME) Médico, y el Instituto Nacional del cáncer ( KME, ALNK R01CA151632). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario (OvCa) es la 5
ª causa principal de muerte por cáncer en mujeres estadounidenses. La Sociedad Americana del Cáncer predice 22.000 nuevos diagnósticos y 15.000 muertes por cáncer de ovario epitelial (EOC) en 2012. Las células derivadas de la cuenta del epitelio superficial del ovario de & gt; 90% de OvCa primario y lesiones metastásicas [1]. células exfoliadas Ovča se detectan en la ascitis peritoneales como células individuales, pequeños agregados o altamente ordenado y compactados esferoides multicelulares [1] - [5]. esferoides compactados, son poco conocidos estructuras invasoras y chemoresistant. adherencias célula-célula, apoyados en parte por N y E-cadherina en coche la formación y compactación de esferoides Ovča [6]. No está claro qué señales moleculares específicas o ambientales contribuyen a las transiciones invasivos en los esferoides.
Un creciente cuerpo de evidencia sugiere que los esferoides compactos promueven la metástasis OvCa dentro de la cavidad peritoneal.
in vitro de búsqueda dentro de las células esferoides Ovča se someten a un crecimiento independiente de anclaje, al adherirse a desagregar en tres dimensiones (3D) de geles de colágeno I e invaden las células mesoteliales subyacentes [7] - [9]. Es importante destacar que la formación de esferoides y la compactación se correlacionan directamente con la invasión [3], [4]. células Ovča humanos con la capacidad de formar esferoides compactos
in vitro
puede generar tumores sólidos cuando se inyectan por vía intraperitoneal en ratones inmunodeficientes. En contraste, las células que no forman esferoides no pueden formar tumores en ratones [10]. La conexión aparente entre la formación de esferoides y diseminación de las células invasoras Ovča compactos pone de relieve la necesidad de una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que apoyan estos procesos [11].
En respuesta a señales extracelulares, las células cancerosas epiteliales derivadas pueden convertir a un fenotipo mesenquimal similar. Esto se puede lograr a través de la disociación de las uniones estrechas y adherentes (AJ), desprendimiento de las células individuales de láminas epiteliales o estructuras en 3D, y la migración hacia los tejidos adyacentes (revisado en [12] - [15]). Sello cambios celulares y moleculares asociados con la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la invasión en el estroma que rodean incluyen la pérdida de expresión de E-cadherina, la regulación positiva de las metaloproteasas de matriz (MMP), la activación de los reguladores de la transcripción y la adopción de un tipo huso, polarizado morfología fibroblástica. Durante la migración mesenquimales, la expansión del borde de ataque y la retracción del borde de salida de las células móviles implica coordinar la regulación de la polimerización de F-actina cortical y contracción actomiosina. conjunto de F-actina precede a la contracción para promover la extensión de los salientes ricas en actina, y la fosforilación mediada por ROCK de la cadena ligera de la miosina (PMLC) regula la contracción actomyosin [16].
forminas han surgido como reguladores clave de la F-actina y la dinámica de los microtúbulos del citoesqueleto. proteínas de la familia Formin son efectores Rho GTPasa. Los diáfano (mDia) forminas relacionados con la PI de mamíferos (mDia1-3) tienen papeles críticos en diversas actividades celulares, incluyendo la transcripción de genes, la progresión del ciclo celular, y el tráfico de membrana. proteínas mdia también regulan las redes de F-actina críticos para mantener la integridad de las estructuras epiteliales multicelulares [17] - [22]. Por ejemplo, el agotamiento de mDia inhibe la formación de uniones célula-célula en las células MDCK [23], y altera las células MCF-7 monocapas por mislocalizing E-cadherina lejos de los contactos célula-célula [24]. Por otra parte, la supresión diáfano, el homólogo mDia en
D. melanogaster, España disminuyó en PMLC AJs y desestabiliza los límites de tejido normal y el aumento de protrusiveness celular [25]. En conjunto, estos datos implican el eje de señalización Rho-mDia en la organización de las estructuras complejas en 3D importantes para la morfogénesis, y potencialmente, para la progresión tumoral.
Varias líneas de evidencia sugieren que forminas desempeñan papeles conservados en la regulación de la motilidad de las células cancerosas , invasión y metástasis. mdia2 influye en el comportamiento invasivo de las células de cáncer de mama, que depende en última instancia de MMP y la formación de protuberancias de actina-ricos llamados invadopodios [26]. Interacción de mdia2 con su regulador negativo, DIP [27], promueve la transición de las células mesenquimales MDA-MB-231 en células ameboides Rock-dependiente altamente móviles e invasoras [28]. Del mismo modo, la modulación de mdia2 también afecta a la invasión ameboide y la migración en DU145 células de cáncer de próstata [29], [30]. Un formin relacionado, mDia1 dirige la quimiotaxis de neutrófilos [31], [32], la invasión de células [33], y la migración de las células T y el tráfico en órganos linfoides periféricos [34], [35]. Otros miembros de la familia Formin, incluyendo isoformas de FRL, FHOD y Formin1, también han sido implicados en la regulación de la plasticidad migratoria y la interconversión entre mesenquimales y la motilidad ameboide de mama y otras células tumorales [36] - [41].
La genes que codifican mDia o FMNL /FRL con frecuencia se pierden en mama, de próstata, colorrectal, carcinomas hepáticos, y los cánceres hematopoyéticos [29], [30], [41], [42]. proteínas mdia también funcionan en el ovario normal, así como los cánceres de ovario. La interrupción de
diáfano
está asociada con la insuficiencia ovárica prematura [43]. La pérdida de
DIAPH1 /DRF1
, el gen que codifica mDia1, se demostró en un modelo de progresión OvCa [10]. Por otra parte, los genes que codifican mdia2 (
DIAPH3 /DRF3
) y metformina 1 (
FMN1
) se downregulated a principios de células Ovča de última fase. Esto fue acompañado por la interrupción en la acumulación de F-actina y el aumento de la deformabilidad de la célula [44], [45]. En su conjunto, las observaciones anteriores sugieren un papel de la dinámica de actina controlados mDia en la progresión de la enfermedad ovárica. No está claro si los cambios en el estado de activación de MDIA adherencias célula-célula influencia para mantener la integridad del esferoide OvCa, o si la modulación de mDia dirige las transiciones que subyacen a la invasión de células en el mesotelio subyacente.
Para explorar estas preguntas, hemos examinado el papel de la señalización Rho /mDia en la migración y la invasión OvCa. Nuestros resultados muestran que una RhoA /mdia2 /ROCK señalización accionamientos de los ejes transiciones invasivos en ES-2 células Ovča en cultivos 2D y un modelo esferoide invasión 3D. La activación de RhoA se incrementó durante la formación de esferoides, mientras que la supresión de la mdia2 interrumpido arquitectura esferoide. En contraste con los efectos de mdia2, el agotamiento de mDia1 no tuvo efecto en la formación o la integridad de esferoides. Cuando esferoides-agotado mdia2 se incrustan en geles de colágeno I, fue posible para mejorar la invasión de células individuales a través de una transición ameboide ROCK-dependiente. Estos hallazgos demuestran la interdependencia de mdia2 y rock para la promoción de transiciones invasivos en esferoides Ovča.
Resultados
localización espacial de las proteínas MDIA en la migración de las células humanas Ovča
obtenerse un panel de líneas celulares humanas que representan Ovča varios subtipos clínicos, incluyendo los adenocarcinomas de células serosas y claras. Algunas de estas líneas celulares formar esferoides compactos (OVCA429 y ES-2), mientras que otros forman estructuras más flexibles de nido de abeja (SKOV3) (Figura S1 y [4]). Todos los tipos de células expresaron mDia1 y mdia2, independientemente de la capacidad de formación de esferoides (Figura 1A).
A. mDia1 y mdia2 se evaluaron mediante inmunoprecipitación y /o Western Blot en un panel de células Ovča humanos. Tubulina se transfirió como control de carga. B. La adhesión celular a la BSA o pozos de colágeno-I-revestido. El experimento se realizó en pocillos por triplicado y se repitió el experimento tres veces. valores de p son BSA vs. colágeno-I para cada línea celular. ensayos de migración Transwell C. se realizaron en pocillos por triplicado y se repitió el experimento tres veces durante 5 h hacia SFM o 20% de FBS. células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 son un control de la migración positiva. valores de p son para el MFS frente a 20% de SFB para cada línea celular. ensayos de invasión Transwell D. se realizaron en pocillos por triplicado y se repitió el experimento tres veces durante 24 h a través de 2 mg /ml de colágeno-I geles hacia cualquiera SFM o 20% de FBS. MDA-MB-231 células son un control de invasión positivo. valores de p son SFM vs. 20% de FBS para cada línea celular. células E. OVCA429 migran hacia 20% de FBS durante 5 h en una cámara de Dunn. mDia1, mdia2 y la arquitectura de F-actina se visualizaron por SI. Flecha se indica la dirección del gradiente. N. S. = No significativo. Todas las barras de error corresponden a SDS experimentos que se muestran son representativos de cada ensayo.
El panel OVCA se proyectó para el adhesivo, migratorio y propiedades invasivas (Figura 1, B-D, respectivamente) para identificar una muy invasiva , esferoide de formación de la línea celular. SKOV3, OVCA429 y ES-2 células fueron igualmente adhesivo en 2D sustratos de colágeno. Sin embargo, el OVCA429 y ES-2 células fueron más migratoria e invasiva que la línea Skov-3 en respuesta a gradientes de FBS. Por lo tanto, se llevaron a cabo nuestros estudios restantes con las células ya sea OVCA429 o ES-2.
La localización espacial de las proteínas endógenas MDIA se evaluó en la migración de las células OVCA429 utilizando una cámara de Dunn para mantener un gradiente de FBS estable. Inmunofluorescencia (IF) se llevó a cabo después de 5 h de migración (Figura 1E). Tanto mDia1 y mdia2 exhiben una distribución polarizada orientada hacia el gradiente de FBS dentro de la migración de las células OVCA429 (flecha indica la ubicación de gradiente). mDia1 y mdia2 localizados predominantemente a las láminas, en oposición a los ricos lamellapodia F-actina, como se ha visto anteriormente en la migración de células epiteliales [46]. Estos resultados sugieren un posible papel de mDia1 y /o mdia2 en la estabilización de las piscinas de actina cortical durante la quimiotaxis Ovča.
Requisitos para la migración quimiotáctica mdia2 en OVCA429 en células
A continuación pregunta si la actividad de la proteína y mDia /o expresión fueron requeridos para la migración quimiotáctica. La distancia migrada por OVCA429 células transfectadas en una cámara de Dunn se cuantificó mediante el seguimiento en vivo de células. Las células fueron diseñados para expresar cualquiera de las proteínas mDia-YFP-fusión solo, o varias combinaciones de control de YFP vector y las proteínas bandera de etiquetado. mDia sobreexpresión fue validado por Western Blot (Figura 2A). Las células que expresan dominante negativo YFP-mDia-FH2ΔN, que interfiere con tanto mDia1 y conducido-mdia2 conjunto de F-actina, [34], [47], [48] migraron mal respecto a los controles YFP. Por el contrario, las células que expresan el constitutivamente activa-mdia2 M1041A [49], en el que se alivia el estado autoinhibited, exhibió una mayor migración en relación con los controles de vector vacío YFP + 3xFLAG. mDia1 sobreexpresión no alteró la migración celular en relación con controles de vectores vacíos. Estos datos sugieren que mdia2 autoinhibition debe ser puesto en libertad a fin de que la migración celular efectiva que se produzca. En la siguiente serie de estudios, el papel de mdia2 en la migración quimiotáctica se evaluó mediante la siembra mdia2-agota OVCA429 células en cultivos polarizados. Mientras que las células tratadas con siRNA de lípidos y de control robusta migran hacia FBS (con relación a los pocillos de control libres de suero), la migración se redujo significativamente en las células-agotado mdia2 (Figura 2C). En conjunto, estos datos indican que se requiere la expresión y /o actividad mdia2 para la migración quimiotáctica óptima de células OVCA429.
A. Transfectadas OVCA429 migró para el 5% de SFB. Se realizó el seguimiento de una sola célula en vivo de las células transfectadas, y emigraron calcula la distancia total. Al menos 10 células fueron rastreados por condición. valores de p mencionados se calculan en relación con los controles respectivos vector vacío. células B. OVCA429 fueron transfectadas con lípido solamente, ARNsi de control o siRNA dirigidos contra mdia2 a concentraciones crecientes (25, 50, 100 nM, denotadas por las cuñas), ya sea para 72 o 96 h. agotamiento mdia2 se confirmó por Western blot. células C. OVCA429 se transfectaron con 100 nM siRNA durante 72 h, y los ensayos de migración transwell realizaron para 5 h hacia una SFM o 10% de FBS. El ensayo se realizó en pocillos por triplicado y se repitió el experimento tres veces. Se muestra un experimento representativo. p valor mostrado son un 10% de FBS tratado de control vs-agotadas las células mdia2. Todas las barras de error corresponden a desviaciones estándar para ese experimento representativo.
El eje de señalización en la formación de esferoides Ovča compactos RhoA /mdia2
MDIA proteínas Rho-sensibles pueden regular los contactos célula-célula y promover sola motilidad celular [18], [26] - [28], [49]. A continuación se determinó si el eje de señalización RhoA /mdia2 estuvo involucrado en la formación de esferoides OvCa. ES-2 células forman rápidamente esferoides altamente compactados (Figura S1) y se utilizaron para los estudios restantes. El requisito para la actividad GTPasa Rho en la formación de esferoides se puso a prueba mediante la exposición de ES-2 células a concentraciones crecientes (0,5 a 2,0 mg /ml) de transferasa C3, un inhibidor de RhoA-C. Como se muestra en la Figura S2A, esferoides C3 tratados fueron más débilmente organizada y menos compactado relación con los controles tratados con vehículo. Dado que el trabajo previo ha demostrado que los niveles totales de RhoA se incrementan en esferoides derivados de hepatocarcinoma [50], la próxima pregunta si los cambios en la actividad de RhoA se producen en conjunción con la formación de esferoides ES-2. Esferoides se forman a partir de 500 células dentro de las 24 h (Figura 3A). RhoA y la expresión de sus efectores, mDia1 y mdia2 se evaluó a continuación en lisados de monocapas de células y esferoides agrupados cosechan entre 24-120 h. En general, los niveles de mdia2 disminuyeron en esferoides relativos a las monocapas. Dentro de las poblaciones esferoide, se observaron diferencias dependientes del tiempo en la expresión mdia2, con niveles ligeramente más bajos observados en las 72 y 96 h esferoides, con relación a las 24, 48 y 120 h esferoides (Figuras 3B y S3a). En contraste con mdia2, los niveles de mDia1 se incrementaron en esferoides relativos a las monocapas. En los esferoides mDia1 disminuyó ligeramente de 24 h a 120 h (Figuras 3B y S3 B). Los niveles totales de RhoA también disminuyeron en esferoides, en relación con monocapas. Sin embargo, los niveles de RhoA recuperaron drásticamente a 120 h de formación de esferoides (Figura 3B) y S3C. Dado que, la interacción de RhoA con sus efectores abajo (como mDia o ROCK) depende de la activación de unión a GTP, el próximo cuantificaron los niveles de RhoA activa unida a GTP en esferoides de G-LISA. La cantidad de RhoA-GTP fue significativamente mayor en esferoides formados para 48-120 h en comparación con ES-2 no estimuladas monocapas de células, acercándose a la observada en las monocapas tratadas con un activador de RhoA conocido, ácido lisofosfatídico (LPA) (Figura 3C). Por lo tanto, los niveles generales de la activación de RhoA se han mejorado en la maduración esferoide.
A. ES-2 esferoides imágenes de microscopía de campo claro. Barra de escala = 250 micras. (Nota: fuera de foco-placa de recubrimiento artefacto de imagen y /o condensación dentro de placas de plástico irregulares se ve aquí es común a las imágenes BF). B. Los lisados de ES-2 monocapas o esferoides se occidental-borrado después de los horarios establecidos. C. RhoA G-lisas se realizaron sobre ES-2 no tratados o tratados con LPA monocapas o esferoides. valores de p son en relación con monocapa sin tratar. El experimento se realizó en pocillos por cuadruplicado y luego se repitió el experimento tres veces. Se muestran los datos combinados de 3 experimentos. valores de p se muestran encima de las barras y son en relación con los controles no tratados en monocapa. D. esferoides formados por 72 h se sellaban, fijo y mdia2 visualizaron mediante microscopía confocal. Las imágenes se obtuvieron utilizando un objetivo de 20 × con 3D-prestación de cortes seriados. Bar = 25 micras. Las flechas abiertas indican áreas de solapamiento, mientras que las flechas cerradas indican una yuxtaposición de F-actina y mdia2. Todas las barras de error corresponden a desviaciones estándar para ese experimento representativo, a menos que se indique.
Como primer paso para determinar si la activación de RhoA dependiente de mdia2 podría afectar a la formación de uniones célula-célula, el próximo preguntó si mdia2 y F-actina son co-localizados en esferoides en las uniones célula-célula (Figura 3D). Esferoides formados durante 72 h revelaron distintas uniones célula-célula F-actina-enriquecidos, con punteada mdia2 subyacente /proximal a estas uniones (punta de flecha) lleno. En algunos cruces, mdia2 apareció para co-localizar con F-actina (punta de flecha sin relleno). Esto sugiere un posible papel de la regulación de la dinámica mdia2 en F-actina necesarias para el desarrollo o mantenimiento de las uniones célula-célula.
mdia2 agotamiento conduce a la formación de esferoides pequeños y desorganizados
A fin de evaluar el papel de las proteínas en mdia ovario esferoide formación /integridad, se empleó una estrategia de interferencia de ARN. Robusta siRNA desmontables mediada de cualquiera mdia2 o mDia1 fue validado a través de 120 h en cultivos en monocapa, con una ligera recuperación al 144 h (Figura 4A y S4). Esferoides se forman a partir de células de la monocapa de tratamiento de 72 h post-siRNA. diámetros esferoide Después se midieron las 24-48 h después (96-120 h de tratamiento total de siRNA). agotamiento mdia2 a las 48 h resultó en una disminución modesta, pero estadísticamente significativa (10-20%) de diámetro en relación con el tratamiento control esferoide siRNA. Se obtuvieron resultados similares cuando se agota mdia2 con piscinas siRNA o siRNA dirigido contra mdia2 individuo (Figura S4), a pesar de la supresión de la expresión mdia2 con siRNA combinado fue más consistente y sostenida. Por lo tanto, se realizaron todos los estudios posteriores utilizando agrupada siRNA. Además de la ligera disminución del diámetro esferoidal, agotado en mdia2 ES-2 esferoides estaban visiblemente organizados menos con los bordes desiguales y algunas células individuales poco adheridas a los bordes. Un fenotipo esferoide desorganizado similares como resultado de la adición de un inhibidor de mDia1 /mdia2 FH2, SMIFH2 (Figura S5) [51]. Resultados Hubo atribuibles al agotamiento mdia2, como el agotamiento mDia1 no tuvo ningún efecto en el tamaño de esferoides (Figura 4B, C).
A. mDia1 (superior) o mdia2 caídas (inferiores) siRNA mediada se realizaron sobre monocapas ES-2 (Nota: las imágenes fuera de foco-placa de recubrimiento artefacto /condensación dentro de placas de plástico irregulares se ve aquí es común a las imágenes BF). ANTES DE CRISTO. Después de 72 h post-siRNA o tratamiento de control, se formaron esferoides y los diámetros medidos con microscopía de campo claro 48 horas más tarde (120 h de tratamiento post-siRNA). Bar = 100 micras. Al menos 30 esferoides se midieron para cada condición. los valores p se indican por encima de las barras y son en relación con el control de esferoides siRNA. DELAWARE. ES-2 monocapas se dejaron sin tratar o tratados con los siRNAs designados durante 48 h, esferoides formados durante 48 h adicionales, y transferencias de Western o RhoA G-Lisas realizaron en lisados. LPA es un control positivo para la activación de RhoA. El experimento G-LISA se realizó dos veces, por cuadruplicado, y los datos combinados se muestra con valores de p de la lista para el lado de las barras. Los valores de p son en relación con cualquiera de esferoides siRNA tratados no tratados o de control, como se ha señalado. F. Si no se trata (UT), única de lípidos o de control de siRNA mediada y mdia2 caídas fueron llevados a cabo en ES-2 monocapas durante 72 h y niveles pMLC2 evaluados por Western Blot. G. Control de caídas y mdia2 se llevaron a cabo durante 72 h, y formaron esferoides. Esferoides se desagregan a los tiempos indicados después de la formación y las células se contaron. El experimento se repitió 5 veces. Se muestra un experimento representativo. Las barras de error corresponden a las DE de un experimento representativo.
Las posibles explicaciones para el tamaño un poco más pequeño de ES-2 esferoides podría incluir la proliferación celular disminuida, disminución del tamaño medio de celda, el desprendimiento de células o mayor compactación esferoide través de una mayor RhoA-dirige la actividad pMLC2. por lo tanto, a fin de determinar si los niveles de RhoA-GTP fueron alterados en esferoides-agotado mdia2. el agotamiento mdia2 fue validado en esferoides formados durante 24-48 h (siRNA tratamiento de 72-96 h) (Figura 4D). A las 96 horas de tratamiento post-siRNA, la actividad de RhoA-GTP no se vio afectada en el control y esferoides-agotado mdia2 (Figura 4E). En consonancia con esta observación, pMLC2 mantuvo sin cambios en monocapas de células (Figura 4F). Por otra parte, el agotamiento mdia2 no cambió los números celulares dentro de esferoides desglosados (Figura 4G). Esto indica que ni la proliferación celular ni pérdida de células de-adherido fue el único responsable del tamaño esferoide más pequeño. También sugiere que mientras que el agotamiento de siRNA mediada de mdia2 hace que un conjunto de esferoide más desorganizada e irregular, la proteína mdia2 restante es probable suficiente para mantener tanto la contractilidad mediada por RhoA y la proliferación celular. Este último concepto es coherente con un estudio previo de mDia1 en la activación de células T, donde los niveles bajos de proteínas mdia parecían ser suficiente para sostener algunos procesos celulares (
por ejemplo
., La acumulación de F-actina vs. dinámica de los microtúbulos) , mientras que al mismo tiempo alterar otras funciones [52].
agotamiento mdia2 mejora ES-2 invasión esferoide a través de una transición ameboide
Para evaluar si las funciones de eje de RhoA /mdia2 en la invasión esferoide, ES-2 esferoides fueron incorporados en colágeno a (T0) y se dejó invadir a través de 168 h (figura 5A). Un frente de rápido avance de las células invasoras apareció por 24 h, y la contracción de gel era lo suficientemente amplia para rasgar los geles durante las 72 h. invasión esferoide se midió mediante la elaboración de una región de interés alrededor del perímetro de la parte frontal invasiva, que abarca al menos 95% de las células invasoras (como se determina por medio del etiquetado de fluorescencia). Invasion dependía de Rho GTPasas, como el frente invasivo se redujo notablemente en ES-2 esferoides que se cultivaron y se embebieron en presencia de C3 transferasa, en relación con esferoides de control tratados con vehículo (Figura S2, B y C). Dado que las proteínas dirigidas mdia-Rho coche invasión en una variedad de células cancerosas epiteliales derivadas de [26], [29], [30], visualizamos la localización espacial de las proteínas mdia en fijos invasivos ES-2 esferoides. mdia2 se distribuyó en un patrón polarizado, con enriquecimiento en los bordes esferoide donde las células invasoras emana al colágeno (Figura 5B). A mayor aumento del frente invasivo, mdia2 se localizó de forma espectacular a las estructuras alargadas parecidas a endosomas tubulada [53], que se extendían a lo largo de las largas protuberancias de las células mesenquimales. Curiosamente, era sobre todo mDia1 nuclear en las células invasoras, en consonancia con los informes anteriores de mDia1 activado nuclear que dirigen mediadas por SRF dinámica de F-actina en el núcleo [54]. Hemos observado múltiples morfologías celulares en las células invasivas en el colágeno, incluyendo células ameboides esféricas (~ 40% de células invasoras), y, células alargadas polarizadas mesenquimales (~ 60% la invasión de células) que migran en hebras (datos no mostrados). Curiosamente, esferoides invasivos reproducible (utilizando varios anticuerpos primarios de diferente anfitrión y derivaciones comerciales) mostraron distintas, tinción puntiforme mdia2 dentro de la matriz (Figura 5C, y datos no mostrados). Anteriormente, se detectaron proteínas MDIA en pro migratorias micropartículas derivadas de OvCa [55] y la formación dirigidos mdia2 oncosome pro-migratorio en las células de cáncer de próstata [29]. Los estudios bioquímicos están actualmente en marcha para caracterizar las partículas extracelulares enriquecidos con mdia2 presentes en la invasión de esferoides Ovča.
A. Esferoides se forman en primer lugar durante 48 I-geles y imágenes de microscopía de campo claro después de los horarios establecidos. Bar = 150 micras. B. Los esferoides se formaron durante 72 h, incrustado en geles de colágeno I y se dejó invadir por 24 h. Esferoides fueron fijadas y si se realiza para mDia1, mdia2 y F-actina. Bar = 100 micras. C. imagen a mayor aumento (63 ×) de invadir las células de la ROI designado en B. mDia1, mdia2, y F-actina se visualizaron por microscopía confocal. Bar = 25 micras. D. Después de 56 h de tratamiento post-siRNA, se formaron esferoides y embebidos en colágeno a 104 h de tratamiento post-siRNA. La zona de ROI dibujado correspondiente al 95% de las células invasivas se calculó para 0 y 18 h después de la invasión (122 h de tratamiento post-siRNA). esferoides representativos a 4X se muestran tiñeron para la faloidina y las imágenes de contraste mejorado. Bar = 100 micras. Al menos 30 esferoides se midieron para cada condición. valores de p se muestran por encima de la histograma y son en relación con la invasión a las 18 h, ya sea para lípidos o esferoides tratados de control. E. índices de elongación se calcularon para las células invasoras de D. se midieron al menos 30 células invasoras por condición. Se muestra la tinción phalloidin representativa. Bar = 25 micras. IE & gt; 2 (línea discontinua) se considera el tipo de células mesenquimales. los valores de p se muestran por encima de la trama y son en relación con la invasión a las 18 h, ya sea para los lípidos o esferoides tratados con el control. Todas las barras de error corresponden a las DE de un experimento representativo.
Para evaluar el papel de mDia en la invasión de células individuales, se midió el área invasivo de mDia1 incrustado o esferoides ES2-agotado mdia2 después de 0 h (104 h después de la caída) y 18 horas (122 h después de la caída). esferoides no tratadas y de control siRNA tratados con firmeza invadieron la matriz de colágeno dentro de las 20 h. esferoides Sin embargo, agotado en mdia2 reveló mejora de forma significativa la invasión en relación con los controles (Figura 5D y la figura S4C), a pesar de su tamaño más pequeño con modestia sobre la incrustación (Figura 4C). A la inversa, esferoides invadidas en la misma medida como esferoides de control (Figura S6) mDia1-agotado, lo que indica que mDia1 no juega un papel importante en la invasión OvCa esferoide. Debido a cambios en la expresión y /o función mdia2 asociados con transiciones amoeboid [27] - [29], se calcularon los índices de elongación (EI) en las células invasoras derivados de los esferoides dividiendo el eje largo de la célula por el eje corto; Un IE de 2 o más indica una forma mesenquimal alargado, mientras que un IE de menos de 2 indica una más prominente fenotipo redondeado, ameboide. Los resultados indican que en los esferoides donde mdia2 agotamiento invasión mejorada, las células invasoras eran en su mayoría en forma ameboide en relación con el control sin tratar y tratados con esferoides siRNA (Figura 5E).
Roca apoya ambos programas motilidad mesenquimales y 3D ameboide en ES-2 invasivas esferoides
ameboide transiciones pueden implicar dirigido por la señalización Rho Rock a la contractilidad directa [56], [57]. Rock también antagoniza proteínas MDIA con respecto al mantenimiento de las uniones célula-célula en monocapas 2D [18]. Sin embargo, la interacción entre el rock y las proteínas MDIA para el mantenimiento de las uniones célula-célula en las estructuras 3D tales como esferoides Ovča no está claro. Por lo tanto, se evaluó el papel de la actividad ROCK en la formación de esferoides. Hemos bloqueado la actividad ROCA mediante el tratamiento de esferoides con el inhibidor específico, Y27632. tamaño de esferoides se redujo ligeramente a través de 48 h de tratamiento (Figura 6A), lo que sugiere que ROCK /reticulación miosina mediada regulado mDia F-actina pueden desempeñar un papel en la formación de esferoides. La inhibición de la ROCA suprimió drásticamente esferoide invasión relación con los controles (Figura 6B), consistente con estudios previos que implican ROCK en blebbing de colon [58] y las células en monocapa de cáncer de ovario Caov3 [59]. Una transición mesenquimal notablemente exagerada predominó en las pocas células que pueblan el frente invasivo modesta en las células tratadas con el inhibidor de roca (Figura 6C), indicando la necesidad de Rock a la contractilidad celular con eficacia directa en los dos programas de invasión amoeboid y mesenquimales.
A. Los esferoides se formaron en presencia de vehículo o 90 M Y27632 durante los tiempos indicados. diámetros esferoides fueron medidos durante al menos 30 esferoides en 10 ×. Bar = 100 micras. los valores de p se muestran por encima de la trama y el control son H
20 esferoides tratados. B. Los esferoides se formaron durante 48 h en presencia de Y27632, y luego embebidas en colágeno-I de 0-48 h en presencia de vehículo o Y27632. frentes invasoras se midieron en cada punto de tiempo de por lo menos 30 esferoides por condición. Bar = 400 micras. esferoides representativos a 4 × se muestran tiñeron para la faloidina y las imágenes de contraste mejorado. Los valores de p se enumeran arriba de la gráfica y son en relación con el control de esferoides H
20-tratados. C. índices de elongación se calcularon para las células invasoras en los geles de colágeno se muestran en la IE B. & gt; 2 (línea discontinua) se consideraron tipo de células mesenquimales. Se midieron al menos 30 células por condición.