humano
Extracto
Antecedentes
fusión de células tumorales con médula ósea móviles células -derivado (BMDCs) ha sido postulado como mecanismo de la metástasis del cáncer. Si bien hay mucho apoyo a este a partir de estudios de cultivos celulares y animales, que aún no se ha confirmado en el cáncer humano, como el tumor y las células derivadas de la médula del propio paciente, no pueden distinguirse fácilmente genéticamente.
Métodos
Se llevó a cabo el genotipado de un melanoma metastásico al cerebro que surgió después de un trasplante alogénico de médula ósea (TMO), utilizando forense de repetición corta en tándem (STR) de longitud-polimorfismos de distinguir de los donantes y los genomas de pacientes. Se aislaron libre de leucocitos por microdisección láser de las células tumorales, y los ADN de linfocitos de sangre tumorales y pre-trasplante se analizaron para determinar los alelos del donante y del paciente a los 14 loci STR autosómicos y los cromosomas sexuales.
Resultados
todos los alelos en el donante y el paciente los linfocitos pre-BMT fueron encontrados en las células tumorales. Los alelos mostraron abundancias relativas desproporcionados en los patrones similares en todo el tumor, lo que indica que el tumor fue iniciado por un evento de fusión clonal.
Conclusiones
Nuestros resultados apoyan firmemente la fusión entre un BMDC y un juego de células tumorales un papel en el origen de esta metástasis. Dependiendo de la frecuencia de tales eventos, los hallazgos podrían tener implicaciones importantes para entender la generación de metástasis, incluyendo el origen de las células iniciadoras de tumores y el cáncer epigenoma
Visto:. Lazova R, LaBerge GS, Duvall E, Spoelstra N, Klump V, Sznol M, et al. (2013) Un melanoma metástasis cerebral con un genoma híbrido entre donantes y la paciente después de trasplante de médula ósea: primera evidencia de la fusión en el cáncer humano. PLoS ONE 8 (6): e66731. doi: 10.1371 /journal.pone.0066731
Editor: Eva Mezey, National Institutes of Health, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Febrero, 2013; Aceptado: 9 Mayo 2013; Publicado: 26 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Lazova et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionada en parte por un regalo sin restricciones desde el Amway Corporation y de la Universidad de Colorado Cancer Center Soporte NCI Grant (P30CA046934). Los costos adicionales fueron cubiertos internamente por las instituciones que participan: la Universidad de Yale, la Universidad de Colorado, y la Policía Crime Lab Denver. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los fondos para este estudio fue proporcionado en parte por un regalo sin restricciones desde el Amway Corporation. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
fusión de células tumorales con leucocitos móviles tales como células de linaje mieloide o las células madre se ha puesto hacia adelante como una explicación unificadora para la metástasis [1] - [4]. Más de un siglo Aichel propuso que el cáncer podría ser el resultado de la fusión entre leucocitos móviles y otras células somáticas, con las diferencias cualitativas entre los cromosomas haciendo que el híbrido que ser "arrojados fuera de la trayectoria de las células madre para formar lo que ha llegado a ser conocido como una célula maligna "[5]. la fusión de células del cáncer se detectó primero cuando las células de glioblastoma humano se implantaron en hamsters y metástasis desarrolladas con un cariotipo-hámster humano [6]. Esto fue seguido de informes de muchos laboratorios de fusión de células de cáncer en cultivo y ratones [1] - [3]. Más recientemente, cuando las células de melanoma de ratón Cloudman S91 mal metastásicos se fusionaron con el ratón normal o macrófagos humanos en cultivo, los híbridos implantados en ratones mostraron altas tasas de metástasis con una disminución de los tiempos de supervivencia de los anfitriones en comparación con los de las células de melanoma de control utilizado como parejas de fusión [7]. híbridos metastásicos fueron altamente pigmentado, característicos del linaje de melanocitos, y también expresaron numerosos rasgos de linaje mieloide tales como una mayor motilidad quimiotáctica, la autofagia y patrones de glicosilación similares a los macrófagos [8] - [10]. Cuando se utilizaron los macrófagos humanos como compañeros de fusión con células de melanoma de ratón, híbridos expresaron genes SPARC tanto humanos como de ratón, lo que indica que los epigenomas de ambos socios de fusión fueron activados [11]. Del mismo modo, cuando se introdujeron las células derivadas de médula ósea marcado fluorescente ratón a través de parabiosis en ratones con tumores intestinales, híbridos celulares de macrófagos-cáncer formado que expresaban transcriptomes característicos de ambos socios de fusión parental [12]. Del mismo modo, la implantación de glioblastoma humano o células de linfoma de Hodgkins en las mejillas de hámster resultó en híbridos de hámster humano metastásico con la co-expresión de los genes humanos y de hámster [13] - [14]. Por lo tanto, el ratón-ratón, ratón-humano, y humana del hámster todos los híbridos de células de cáncer de co-expresados y los genes celulares normales y mostraron una mayor capacidad de metástasis. En otros estudios, la fusión de las células cancerosas con BMDC de en cultivo inducido por aneuploidía, resistencia a los fármacos, aumento de la capacidad de invasión y tumor heterogeneidad [15] - [20]. En los melanomas humanos, no se detectaron células de melanoma "stealth" en las metástasis de ganglios linfáticos que mostraron propiedades consistentes siendo híbridos de fusión [21]. Las células tumorales circulantes capturados de la sangre de pacientes con melanoma, páncreas y colorrectal carcinoma de co-expresada y marcadores leucocytic que sugieren la fusión celular BMDC-tumoral [22]
.
Sin embargo, la fusión y la hibridación genómica aún no se han demostrado en una base genética en el cáncer humano, ya que las diferencias genómicas entre células del mismo paciente no puede distinguirse fácilmente. Para evitar este problema hemos analizado tumores malignos secundarios derivados trasplantes alogénicos de médula ósea (TMO) de correos. En dos informes anteriores hemos demostrado alelos de los donantes en las células cancerosas del paciente, pero no había ninguna disposición para identificar los alelos de los pacientes y la fusión podría por lo tanto no ser demostrado [23] - [24]. Aquí hemos utilizado STR-longitud de los polimorfismos genéticos y técnicas forenses para analizar el ADN genómico de una metástasis de melanoma cerebral de un paciente que había recibido previamente un trasplante de médula ósea de su hermano. Los resultados demuestran la presencia de donantes y pacientes alelos en las células cancerosas en todo el tumor, lo que indica que un evento de fusión de células BMDC-cáncer se había iniciado la generación de este tumor. Patología análisis y modelación matemática de los patrones alélicos apoya esta conclusión.
Métodos
Ética declaración
Todas las muestras utilizadas en este estudio fueron preexistentes y no identificable antes de ser recibido por el equipo de investigación de la Universidad de Yale. Exención fue concedida en virtud de Yale IRB protocolo#070900309 (JP y RL) del Programa de Protección de Investigación Humana de la Universidad de Yale, la Junta de Revisión Institucional.
Fuente de los tejidos
El paciente era un 68-año- anciano que recibió un trasplante de médula ósea alogénico de su hermano para el tratamiento del linfoma de células B. Su perfil última injerto /quimerismo fue Destinatario 3%; Donantes 97%. Seis años más tarde, el paciente fue diagnosticado de melanoma metastásico que implican los ganglios linfáticos, el hígado y el cerebro, derivadas de un tumor primario desconocido. Se analizó una metástasis cerebral (designado "MH3") que consiste en un tejido de 0,5 × 0,2 × 0,3 cm fijado en formalina incluido en parafina (FFPE). El tumor fue extirpado quirúrgicamente, se fijó en formalina y embebidos en parafina de las técnicas histológicas estándar. donantes y pacientes linfocitos pre-trasplante se almacenaron a -90 ° C en la célula madre-New Haven Hospital Yale Banco y se recuperan después de que se completaron los análisis de tumores.
láser microdisección
Manipulación y procesamiento de muestras de tejido se llevó a cabo usando un equipo ultra limpia, libre de ADN. Cinco mu de espesor secciones histológicas se cortaron y se inmunotiñeron para LCA /CD45 (clon 2B11 + PD7 /26, Dako, catálogo N1514) usando un sistema de tinción automática (DAKO, Carpinteria, CA) en los Laboratorios dermatopatología Yale. El anticuerpo se ensayó para la tinción de eficiencia como se describe en S1 Archivo. Las células tumorales se microdissected libre de células CD45-positivas LCA /de 9 regiones del tumor utilizando un sistema de microscopio de disección con láser Arcturus XT. Cada muestra consistió en células tumorales diseccionados agrupados a partir de una o más áreas de la misma sección.
Extracción de ADN
extracción de ADN y análisis de STR fueron por la Unidad de ADN laboratorio del Departamento de Policía de Denver usando forense estándar operativo y procedimientos valided [25]. Las muestras se recogieron en tubos de reacción GeneAmp de paredes delgadas (0,5 ml; Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). ADN se extrajo de linfocitos en la plataforma BioRobot EZ1 con el protocolo de ADN traza kit EZ1 ADN Investigador (Qiagen en EE.UU.). Total de ADN masculino humano y se evaluaron con la Quantifiler Duo kit de cuantificación de ADN (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se utilizaron dos procedimientos de extracción de ADN. Para las muestras tumorales 1-4, el ADN fue extraído utilizando el 5% Chelex con proteinasa K procedimiento [26]. Para las muestras 5-9, el ADN se extrajo usando el kit de RecoverAll total de ácido nucleico Aislamientos para FFPE tejidos (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.), lo que mejoró el rendimiento de ADN de aproximadamente 5 veces (no mostrado). El número de células tumorales microdissected por muestra fue registrada automáticamente por el sistema de Arcturus XT.
amplificación por PCR
PCR se realizó con el kit de AmpFlSTR Identifiler Amplificación por PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU. ). Generalmente, 1 ng de ADN total fue blanco de cada amplificación PCR. En las muestras con menos de ADN (& lt; 0,1 ng /l), las muestras se concentraron 5 a 20 veces utilizando un filtro centrífugo Microcon (Ultracel YM-100, Millipore, Billerica, MA, EE.UU.)
análisis genéticos forenses. de loci STR
Cada locus STR fue seleccionado para ser neutral con respecto a otros enlaces o asociaciones, ya sea con trastornos mendelianos no mendeliana o genético. El loci fueron polimórficos y exhibió niveles aceptables de heterocigosidad, típicamente 70% o superior. Podrían ensayarse juntos como un multiplex PCR y fueron robustos para ADN degradado [25]. El genotipado de los productos de PCR y la interpretación de los alelos de repeticiones cortas en tándem-STR se realizaron mediante electroforesis capilar en un ABI Prism 3130 Genetic Analyzer con GeneMapper ID Software versión 3.2 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.). los cromosomas X e Y se detectaron utilizando el ensayo simultáneo amelogenina con el análisis de STR autosómica [25]. umbrales cualitativos y cuantitativos de señal a ruido se determinaron con el kit ABI Identifiler. Todos los picos & gt; 50 unidades relativas de fluorescencia se anotó como alelos verdaderos basados en a) la altura y b) la morfología de pico [25]
alélica tartamudeo
picos de señal de alelos puede superponerse "tartamudeo" técnica. posiciones de otros alelos. Los estudios de validación han establecido directrices de interpretación para los marcadores forenses para distinguir las señales verdaderas de los alelos de tartamudeo para cualquier alelo dado en cualquier lugar [27] - [28]. Todas las llamadas de los alelos considerados significativos en este estudio se ajusta a estas directrices y no se tartamudean solapamientos.
Modelado y Análisis Estadístico
modelos estadísticos bayesianos de la contaminación y la fusión de células de donantes se ajustaron y se compararon mediante la cadena de Markov métodos de Monte Carlo [29] implementado usando JAGS [30] y R [31] software como se describe en el archivo S2.
Resultados
analiza Patología
Nos lleva a cabo extensos análisis de patología para garantizar que las muestras tumorales láser diseccionado no estaban contaminados por la infiltración de leucocitos del donante. Para detectar leucocitos se utilizó un anticuerpo a antígeno común de leucocitos (LCA /CD45), expresados en la superficie de los leucocitos maduros y células progenitoras hematopoyéticas. En experimentos de control positivo el anticuerpo mostró & gt;. Tinción eficiencia del 99% contra los casos de prueba de la dermatitis y el linfoma (. Figuras S1 y S2, S1 en la Tabla S1 Archivo)
La tinción del melanoma MH3 para LCA /CD45 reveló que algunas regiones contenían leucocitos LCA /CD45-positivo entremezcladas con células LCA /CD45-negativas melanoma (fig. 1A). Estos fueron considerados no adecuados para microdisección láser. Sin embargo, otras áreas contenían poblaciones puras de células de melanoma CD45-negativas LCA /en grupos de decenas a cientos que eran adecuados para microdisección (Fig. 1B-D). Del mismo modo, cuando el tumor se tiñó para S100 para detectar las células de melanoma [32], algunas regiones tumorales se infiltraron con leucocitos S100-negativos, mientras que otras contenían células de melanoma solamente S100-positivos (Fig. 2A y B). Por lo tanto, dos análisis de inmunoquímica diferentes mostraron que el tumor MH3 contenía áreas de células de melanoma maligno prácticamente puras que podrían ser limpiamente microdissected con & lt; 1% contaminar leucocitos. Un análisis más detallado de la tinción S100 se presenta en las Figs. S3 y S4 en S1 Archivo.
A. Un área con leucocitos marrones LCA /CD45-positivo (flecha) entremezcladas con células de cáncer de LCA azul /CD45-negativas. B-D. Las áreas adyacentes de la misma sección que contienen células cancerosas CD45-negativas sólo el azul LCA /.
a. Un área de las células tumorales S100-positivos mezclado con la infiltración de leucocitos S100-negativo (flechas). B. Un área que contiene células tumorales S100-positivos solamente. Análisis más detallados de patología se presentan en las figuras S3 y S4 en S1 Archivo.
microdisección láser y análisis de STR
Tumor secciones fueron teñidas con LCA /CD45 antes de la disección láser y células tumorales se diseccionaron libres de leucocitos /CD45-positivo LCA. Se aislaron células tumorales de 9 regiones en todo el tumor (muestras 1-9) y el ADN se extrajo y se amplificaron para 14 alelos en loci STR. Todos los alelos encontrados en el donante antes del trasplante y linfocitos de la sangre del paciente también se detectaron en las células tumorales. Para cada locus había al menos un alelo común tanto para el donante y el paciente, de acuerdo con la relación fraternal. Ocho loci mostraron donante-alelos específicos y seis de ellos exhibieron donante y del paciente específicos alelos. Esto indicó que las células tumorales eran híbridos de donantes paciente (Fig. 3, Tabla 1). En particular, las relaciones alélicas tumorales difirieron entre los loci, sino para cualquier locus determinado las proporciones alélicas fueron similares en todas las 9 regiones del tumor. Esto sugirió un genotipo relativamente estable y el origen clonal probable de la metástasis. Los loci restantes eran poco informativo en relación con la fusión con alelos específicos solamente compartidos o de pacientes y ningún alelo de donantes (Tabla 2; Fig. S5 en Archivo S1).
mostradas son "informativo" donantes exhibiendo loci y alelos específicos de pacientes en pre -BMT linfocitos. loci tumorales se enumeran en orden de abundancia relativa de los alelos específicos del donante (asterisco rojo) en comparación con los pacientes específicos (asterisco azul) y alelos compartidos (asterisco negro). picos de alelos & lt; 50 unidades relativas de fluorescencia fueron censuradas como "no llamar" (círculos abiertos). Loci con alelos no detectables después de la amplificación por PCR (-).
Finalmente, nos ajustamos modelos estadísticos para comparar la probabilidad de que la fusión de células de donantes BMDC-tumoral frente a la contaminación de leucocitos del donante (figura . 4), que se describe en detalle en las Figs. S6, S7, S8, S9, el cuadro S2 S2 en Archivo. El modelo de fusión se ajusta mejor a los datos, como se muestra por sus desviaciones más pequeñas (Fig. 4A y B) y su mayor registro de pseudo-marginal verosimilitud (LPML), que supera el LPML para el modelo de contaminación por una diferencia de 71,4 (Fig. 4C y D, línea roja). . Un procedimiento de calibración [33] - [34] para evaluar la importancia de esta diferencia dio probabilidades
P
& lt; 0,005 para la contaminación y
P
& gt; 0,3 para la fusión (Figs 4C y D ), mostrando que el observado LPML diferencia es muy rara en el marco del modelo de contaminación, pero no es raro bajo el modelo de fusión. Así, estos datos apoyan firmemente la fusión sobre la contaminación célula donante como la explicación de las dosis alélicas observadas
Los paneles A y B:. Desviaciones menores de los modelos de contaminación y de la fusión; desviaciones menores indican mejor ajuste. Los paneles C y D: Un procedimiento de calibración muestra la diferencia observada LPML (líneas rojas) es poco frecuente en el marco del modelo de contaminación, pero típica bajo el modelo de fusión. Los análisis estadísticos más detallados se presentan en S2 Archivo.
Discusión y Conclusiones
STR análisis del tumor ADN reveló que los donantes y pacientes alelos estaban presentes juntos en múltiples loci y que había alélicas desequilibrios generalizados y aneuploidía. Un inconveniente es la incapacidad para llevar a cabo los análisis de STR en las células tumorales individuales, pero para este tumor el límite inferior para la recuperación de ADN para análisis de STR fue de aproximadamente 500 células, incluso utilizando el procedimiento de extracción de ADN de las células FFPE que mejoraron la recuperación de ADN. Por lo tanto, no podríamos descartar definitivamente que los patrones podrían deberse a una mezcla quimérico de las células tumorales del paciente y BMDCs donantes. Sin embargo, esto es poco probable por las siguientes razones: 1) Para un locus dado las proporciones alélicas eran similares en todo el tumor. Es difícil de explicar estos patrones de repetición como debido a mezclas quiméricas ya que esto requeriría que los diferentes tipos de células existían juntos en las mismas relaciones en todo el tumor. Cabe destacar que, mientras que la mayoría de los loci tumor informativo tenían alelos del paciente y compartidos en mayor abundancia relativa de alelos específicos del donante, locus D13S317 tumor fue invertido, con el alelo específica del paciente ausente y el alelo específica del donante en la prominencia. Dado que la dosis inicial de ADN genómico de cada muestra fue determinante de la intensidad del producto de la PCR y varió ampliamente entre las muestras, dada la consistencia en proporciones alélicas de una muestra a la reversión de la dosis de ADN en el locus D13S317 no puede explicarse por PCR preferencial o contaminación de leucocitos. 2) Las células tumorales fueron disecados de regiones libres de células ECV-positivos (Fig. 1). 3) No es probable que los resultados eran debido a la contaminación de ADN a partir de fuentes exógenas. Cualquier contaminación de ADN habría tenido que venir del donante o paciente, ya que todos los alelos detectados en las células tumorales podría explicarse en los linfocitos pre-trasplante de uno u otro de estos individuos. Una fuente de tal contaminación podría ser los linfocitos a sí mismos ya que contenían grandes cantidades de ADN en comparación con los de las muestras tumorales. Sin embargo, esto fue descartado debido a que los linfocitos fueron recuperados de almacenamiento a largo plazo en N líquido
2 sólo después de que se completaron los análisis de tumores. Además, no había sido una fuente dominante de la contaminación de ADN en el tumor, lo que debería haber estado presente en niveles similares en las áreas necróticas y esto no fue el caso, como se discutió anteriormente. 4) Nuestro análisis estadísticos de los patrones alélicos favorecieron fuertemente la fusión de células BMDC-melanoma sobre los modelos de contaminación de leucocitos.
En la biología de células madre tanto transdiferenciación y fusión parecen ser operativo en la transformación de células madre en células somáticas diferenciadas [ ,,,0],35] - [38]. Sin embargo, el origen de las células madre de cáncer /tumor de células iniciadoras es objeto de controversia. En dos informes anteriores de lesiones malignas secundarias que surgen en los pacientes después del trasplante alogénico de médula ósea, se encontró que los genes de los donantes en las células tumorales, lo que sugiere fuertemente la fusión [23] - [24]. Sin embargo, en ninguno de los casos eran los genes específicos para cada paciente también identificados en las células tumorales y los mecanismos alternativos a la fusión, no se puede descartar, como transdiferenciación de células madre de un donante en células cancerosas. Sin embargo, en el tumor se describe en el presente documento, forense STR análisis revelaron que el donante y el paciente alelos estaban presentes en las células del tumor a lo largo y el tumor parecía consistir en gran parte si no exclusivamente de híbridos de células BMDC-tumorales. Por otra parte, los patrones alélicos de repetición para cada locus en todo el tumor indicaron un origen clonal de la metástasis y sugirieron que el tumor se genera a partir de un evento de fusión previa entre un donante BMDC y una célula de tumor del paciente. Así, al menos en este caso, llegamos a la conclusión de que la célula de iniciación de tumor era un híbrido de células BMDC-tumor. sigue siendo la medida en que este mecanismo es operativo en otros tumores que se determine
.
En estudios anteriores, los híbridos experimentales de tumores generados
in vitro
entre las células de cáncer, incluyendo el melanoma y células epiteliales normales o fibroblastos fueron generalmente suprimidas en la tumorigenicidad y la expresión de funciones diferenciadas, lo que conduce al descubrimiento de genes supresores de tumores [39] - [40]. Pero más tarde, utilizando los macrófagos como parejas de fusión con células de melanoma, resultante híbridos expresados genes y rasgos diferenciados de ambos padres y la metástasis fue notablemente mayor [7] - [11]. Esto indicó co-expresión de epigenomas de ambos linajes parentales. genomas híbridos co-expresaron podrían dar cuenta de la complejidad de los patrones de expresión génica en las células cancerosas y también cómo las células malignas podría tener un gran repertorio de capacidades mieloides similar a como la angiogénesis, alteraciones de la matriz, la motilidad, la quimiotaxis y vías de señalización inmune tales, así como experimentar una transición epidérmico-mesodérmico [1], [41].
Un modelo para la metástasis resultante de la fusión de células derivadas de médula ósea se esquematiza esquemáticamente en la Figura 5. Si bien esto en gran medida ha sido verificada en modelos animales de tumores y el cultivo de células, la evidencia para la fusión en el cáncer humano hasta ahora ha faltado. Nuestros resultados muestran por primera vez en un cáncer humano que la generación de una metástasis y la adquisición de sus patrones genéticos aberrantes resultado de la fusión y la hibridación genómica entre un BMDC y una célula de cáncer. Dependiendo de la frecuencia de tales eventos, los hallazgos podrían tener implicaciones importantes para entender la metástasis, incluyendo el origen de las células iniciadoras del tumor y el epigenoma del cáncer.
Un móviles BMDC (rojo) tal como un macrófago o célula madre es dibujado a una célula de cáncer (azul). Las membranas de las células exteriores de las dos células se vuelven unidos. La fusión ocurre con la formación de un heterocarión-bi nucleado que tiene un núcleo de cada una de las parejas de fusión. El heterocarión pasa a través de la hibridación genómica crear un híbrido melanoma BMDC con epigenomas co-expresó, que confiere la división celular desregulado y competencia metastásica al híbrido.
Información de Apoyo
archivo S1.
figuras S1, S2, S3, S4, S5 y el cuadro S1
doi:. 10.1371 /journal.pone.0066731.s001 gratis (PDF)
S2 Archivo.
Figuras S6, S7, S8, S9 y el cuadro S2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0066731.s002 gratis (PDF)
Reconocimientos
Agradecemos Prof. Douglas Brash, Escuela de Medicina de Yale, por lo que sugiere por primera vez el uso de segundas neoplasias malignas después de BMT y por su ayuda con el manuscrito.