normal
Extracto
CDKN2A gratis (codifica p16
INK4A y p14
ARF) eliminación, lo que resulta en tanto Rb y la inactivación de p53, es la anomalía cromosómica más común en cánceres humanos. Para mapear con precisión los puntos de interrupción de deleción es importante para entender el mecanismo molecular de reordenación genómica y también puede ser útil para aplicaciones clínicas. Sin embargo, los métodos actuales para determinar el punto de interrupción son o bien de baja resolución o requieren el aislamiento de células cancerosas relativamente puros, que pueden ser difícil para muestras clínicas que típicamente están contaminados con diversas cantidades de células huésped normales. Para superar este obstáculo, hemos desarrollado un nuevo método, denominado Primer aproximación multiplex PCR (PAMP), para el enriquecimiento de las secuencias de punto de interrupción, seguido de la hibridación genómica suelo de baldosas gama de localizar los puntos de interrupción. En una serie de experimentos de prueba de concepto, hemos sido capaces de identificar el cáncer derivado de
CDKN2A
puntos de corte genómicos cuando más del 99,9% de genoma de tipo salvaje estaba presente en un sistema modelo. Este diseño se puede ampliar con el apoyo de la bioinformática y se puede aplicar para validar loci asociados con el cáncer otro candidato que se revelan por otros ensayos de rendimiento más sistémicos, pero inferiores
Visto:. Liu YT, Carson DA (2007) Un nuevo enfoque para determinar el cáncer Genómica puntos de interrupción en la presencia de ADN normal. PLoS ONE 2 (4): e380. doi: 10.1371 /journal.pone.0000380
Editor Académico: David Levens, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Febrero, 2007; Aceptado: March 27, 2007; Publicado: 18 de abril 2007
Derechos de Autor © 2007 Liu, Carson. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado en parte por subvenciones de la UCSD Centro NanoTumor de Excelencia para el cáncer de Nanotecnología (CA119335), CA23100 (DAC) y AI36214-12S1 (YT L.) de los Institutos nacionales de Salud
Conflicto de intereses:. la autores (Y.-TL & amp; DAC) han presentado una solicitud de patente provisional sobre la base de este estudio
Introducción
los tumores se desarrollan a través de la acumulación continua y selección de genes mutados al azar.. Mientras conjuntos de mutaciones ventajosas se seleccionan en los tumores, las mutaciones neutrales o incluso ligeramente perjudicial también pueden ocurrir debido a la inestabilidad genómica y la deriva genética. Recientemente, mucho esfuerzo se ha dedicado a identificar en los cánceres humanos primarios señalan mutaciones en los exones de genes relacionados con el cáncer. Sin embargo, la cartografía sistémica de reordenamientos de ADN genómico se ha quedado atrás, debido a dificultades técnicas en la detección de deleciones pequeñas, la heterogeneidad del tumor, y la necesidad de purificar maligna de las células normales [1]. Históricamente, este trabajo se llevó a cabo mediante el consumo de tiempo y de mano de obra intensiva genética y clonación molecular en líneas celulares de cáncer establecidas [2], [3], [4]. Uno de los ejemplos más llamativos es la deleción homocigótica del
CDKN2A gratis (
INK4A /ARF
) locus supresor de tumores, que fue descubierto en este y otros laboratorios [3], [4], [5], [6], [7], [8]. El
CDKN2A
deleciones ocurren temprano durante el desarrollo del tumor [9], [10], [11]. La p16
INK4a (uno de los
CDKN2A
productos [12]), la proteína limita la progresión del ciclo celular por la vía Rb y puede ser responsable de la disminución en el potencial de replicación de las células madre durante el envejecimiento [13] . La p14
ARF (el otro marco de lectura alternativo de
CDKN2A
[14]) producto del gen regula la expresión de MDM2, la facturación de p53, y por lo tanto controla la respuesta celular al estrés (revisado en [6 ], [7], [8], [15], [16], [17]). Debido a que el Rb y p53 vías son fundamentales para el cáncer de puerta de mantenimiento y el cuidado [18], [19], existen fuertes presiones de selección para la interrupción de la totalidad de
CDKN2A
segmento del gen en ambos cromosomas. Pocas otras supresiones están tan bien caracterizados, aunque se espera que más se encontraron cuando más datos de matriz basados en la hibridación genómica comparada (CGH-array) son reportados y también a través del Proyecto del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) [20], [21 ], [22], [23], [24]. Será importante para validar la pertinencia de estos reordenamientos genómicos al desarrollo del cáncer, ya que muchos de los cambios estructurales genómico puede ser simplemente debido a la inestabilidad del genoma en el cáncer. Los estudios a gran escala con muestras clínicas serán la confirmación más fiable.
Mientras mutaciones puntuales y pequeñas inserciones o deleciones en el ADN genómico pueden ser detectados por el exón re-secuenciación, puede ser más difícil de detectar cambios de dosis génica fragmentos genómicos de grandes, especialmente supresiones [1]. Las técnicas actuales establecidos para la supresión de cartografía, incluyendo transferencia de Southern [25], fluorescente
In situ
hibridación (FISH) [26], PCR cuantitativa [26], [27], [28], [29], [ ,,,0],30], y CGH-array [31] se basa en la ausencia de una señal detectable de tipo salvaje [1]. Esto es problemático cuando están presentes en una muestra de tumor de un número significativo de las células normales. CGH-array tiene el potencial de analizar las alteraciones del número de copias de ADN en un genoma de gran escala con una resolución relativamente alta, dependiendo de si BAC, los productos de PCR u oligonucleótidos se utilizan para los elementos de la matriz. Sin embargo, estas técnicas a menudo no logran donde hay una población heterogénea de células o muestras de mala calidad [31]. FISH es menos vulnerable a la presencia de poblaciones de células heterogéneas, pero tiene una resolución relativamente baja y es difícil de ampliar. A excepción del pescado, las otras técnicas mencionadas no son prácticos para el mapeo genómico translocaciones e inversiones. perfiles de fin de secuenciación fue desarrollado para hacer frente a este problema, pero el enfoque era costoso y difícil de escalar [32]. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar un enfoque escalable para detectar tales cambios estructurales genómicas en tumores sólidos donde las poblaciones celulares heterogéneas están presentes.
A continuación se presenta un enfoque novedoso, designado como Primer aproximación multiplex PCR (PAMP), para enriquecer pequeñas cantidades de secuencias de ADN genómico eliminados en presencia de DNA de tipo salvaje. Los lugares del genoma de las secuencias enriquecidos son decodificados posteriormente por un suelo de baldosas gama genómica y confirmadas por secuenciación.
Resultados
CDKN2A locus
El
CDKN2A
se encuentra en el cromosoma 9p21 (Figura 1). Se codifica dos proteínas en diferentes marcos de lectura: p16
INK4A y p14
ARF, que ambos tienen 3 exones y compartir los exones 2 y 3.
CDKN2B gratis (p15
INK4B) y
MTAP
(metiltioadenosina fosforilasa) (no se muestra) son genes centroméricas y teloméricas vecina respectivamente [3], [17], [33], [34]. BAC clon RP11-149I2 contiene el conjunto
CDKN2A
fragmento genómico y se utilizó como molde para generar sondas (con exclusión de las regiones repetitivas) para imprimir en el suelo de baldosas gama minigenomic. La frecuencia de secuencias repetitivas predichos por RepeatMasker se muestra en la parte inferior del diagrama.
El mapa genómico abarca aproximadamente 55 kb en torno a
CDKN2A
acuerdo con Ensemble [59].
CDKN2A
/B está localizado en el cromosoma 9p21 y sus productos de ARN están codificados por la cadena inversa.
CDKN2A
codifica proteínas 2 (p16
INK4A y p14
ARF) que comparten las mismas exones 2 y 3. Los primeros exones de
INK4A
y
ARF
son alrededor de 20 kb aparte.
CDKN2B
codifica p15
INK4B que es homóloga a p16
INK4A. Además de las transcripciones, el mapa también muestra secuencias repetitivas (repetición) y disponible clon BAC (clones tilepath humano), RP11-149I2.
Primer aproximación multiplex PCR (PAMP)
es difícil detectar una pequeña fracción de ADN genómico mutante eliminado en presencia de un gran exceso de ADN de tipo salvaje con otras herramientas de biología molecular populares [26], [27] o CGH array, [35]. En las muestras de tumor normalmente contaminados, el ADN genómico se compone de diversas relaciones de WT y
CDKN2A
ADN deficiente. El objetivo de aprovechar el hecho de que una secuencia del genoma eliminado más corto debe preferentemente ser amplificado en comparación con una secuencia mucho más larga WT utilizando "aproximado" cebadores flanqueantes (Figura 2A) [36].
La eficiencia de la amplificación por PCR está inversamente relacionada con la distancia de los cebadores aguas arriba y aguas abajo. En este ejemplo, los cebadores para amplificar las secuencias genómicas de todo el locus de interés (LOI) se dividen en 20 grupos: 10 cada uno por delante (F1-F10) y grupos inversa (R1-R10) (A). Mientras que todos los de la posible adelante y atrás pares de cebadores son demasiado entre sí para amplificación por PCR en el genoma de tipo salvaje, cierto par de cebadores, se aproxima más ( "aproximada") debido a la eliminación (F3 y R3) en el genoma mutado. reacciones de PCR múltiple se fijan y se representan como una matriz para incluir uno hacia adelante y un grupo cebador inverso. Los resultados de la PCR esperados se muestran como sombras de escala de grises en la matriz (B). Este ejemplo muestra que los pares de grupo sólo está cerca de punto de interrupción dar productos de PCR (F3-R3, R4-F3, F4-R3).
El enfoque se ilustra en la Figura 2. En este ejemplo, relativamente uniforme imprimaciones -spaced (promedio de 1 kb aparte) que rodean el centro de interés se dividen en 20 grupos para la PCR. Hay 10 grupos, cada uno de los cebadores directos, F1, F2 ..., F10 y el cebador inverso R1, R2, ..., R10, respectivamente (Figura 2A). Por lo tanto, hay 100 pares (F1-R1, F1-R2, ..., F1-R10; F2-R1, F2-R2, ..., F2-R10; ...;. F10-R1, F10-R2, ..., F10- R10) de reacciones de PCR (Figura 2B). Se espera que sólo uno o dos pares de reacciones de PCR se producen productos de PCR específicos que abarcan el límite eliminación, ya que los otros pares de cebadores debe ser demasiado lejos del punto de interrupción para la amplificación eficiente. A continuación, partes alícuotas de cada reacción se pueden mezclar para hibridar en una única matriz de suelo de baldosas genómico. A diferencia tradicional CGH-array, se espera que los únicos puntos que representan secuencias genómicas cerca de los puntos de interrupción se iluminaron en teoría, lo que se confirmó en los siguientes experimentos.
Con el fin de aumentar el rendimiento y reducir el costo de los reactivos , cada avance (F1-10) y el grupo de cebador inverso (R1-10) pueden tener múltiples cebadores. Por lo tanto, todos los grupos de PCR (por ejemplo F1-R1) se convierte en par de PCR múltiple. Por lo tanto, hemos designado este procedimiento como Primer aproximación multiplex PCR (PAMP).
supresión de corte clonación por PAMP y suelo de baldosas gama minigenomic
Hemos informado anteriormente de que la línea celular 562 Detroit tiene un aproximado de 20 kb (incluyendo
INK4A
los exones 1 y 2) deleción en el cromosoma 9p21 [3]. Utilizamos esta línea celular para poner a prueba nuestro enfoque de eliminación de barrido. Cuatro grupos (F
A, F
B, R
Y y R
Z) de los cebadores se utilizaron para cuatro reacciones PAMP (Figura 3A) utilizando la plantilla de ADN genómico ya sea desde Detroit 562 (
CDKN2A
deficiente) o HEK293 (
CDKN2A
líneas celulares de tipo salvaje). Las alícuotas de los 4 productos de reacción PAMP se agruparon y se marcaron para la hibridación en un
INK4A
suelo de baldosas gama minigenomic que cubre aproximadamente 25 kb, incluyendo todos los exones de
INK4A
. Como se predijo en la Figura 2, sólo manchas con sondas cerca de los puntos de interrupción hibridadas con los amplicones Cuando se utilizó Detroit 562 ADN genómico como una plantilla (Figura 3B). casi no se detectó señal cuando se usó ADN genómico HEK293 como plantilla. La muestra de control HEK293 tuvo una señal significativamente más alto en Cot-1 Puestos de ADN a pesar de su intensidad en general absoluta de la señal es baja.
(A) Cinco grupos de cebadores (F
A, F
B, R
x, R
y y R
Z, las pequeñas flechas y puntas de flecha), cerca de los puntos de ruptura potenciales se generan para PAMP basado en nuestra cartografía anterior [3]. El mapeado
CDKN2A
puntos de ruptura de la línea celular Detroit 562 (Figura 5) están indicados para su aclaración. El "E1", "E2" y designaciones "E3" (fuentes azules) son las posiciones relativas de
INK4A
exones. El primer exón del
ARF
está más a la derecha de este diagrama y no está cubierto por esta matriz. Las sondas de mosaico de la matriz se indican con dos colores alternantes (líneas de color naranja y negro corto) para facilitar su identificación. (B) La primera fila de la
INK4A
matriz minigenomic fue visto con las sondas de mosaico que se muestran en el panel A. Cot-1 DNA (secuencia repetitiva de ADN genómico) puntos se indican en esta matriz. El resto de las manchas son de ADN de esperma de arenque. Ambos ADN de esperma de Cot-1 y el arenque se utilizan como controles no específicos. Esta matriz se hibridó con muestras marcadas derivadas de dos líneas celulares. Los mismos conjuntos de cebadores (F
A, F
B, R
Y y R
Z) se utilizaron para reacciones PAMP sobre Detroit 562 (mutante) y HEK293 (tipo salvaje) de ADN genómico de mapear los potenciales
CDKN2A
puntos de interrupción. Los amplicones fueron marcadas con diferentes colorantes, produciendo una señal de verde (Cy-3) para la muestra mutante y una señal roja (Cy-5) para la muestra de tipo salvaje, que se hibridó simultáneamente en la matriz (array de dos colores). Las dos manchas verdes en la primera fila revelaron la ubicación de punto de interrupción como se ha discutido en la Figura 2.
Además, se utilizaron cuatro matrices independientes para hibridar los productos de PAMP individuales descritos anteriormente. Un simple gráfica de la proporción de intensidad de señal de los productos de PCR mutantes /WT en el suelo de baldosas serie reveló la localización genómica del punto de ruptura (Figura 4). Este análisis muestra una lectura -la muy sencillo localización de la deleción está bordeado por dos picos. Sólo F
B-R
Y (serie 27) y puesta en común de todos los productos (29) de matriz producir el mismo resultado que se muestra en la Figura 3. Por el contrario, los otros tres pares produjeron sólo señales de fondo tenues en los arrays. Este resultado indica que la puesta en común PAMP producto con una sola serie de análisis proporciona la misma información como punto de ruptura cuatro matrices individuales. Los datos apoyan las predicciones experimentales originales, y sugieren que el procedimiento debería ser aplicable en general para su eliminación y la exploración translocación
.
Cuatro grupos (F
A, F
B, R
Y y R
Z) de cebadores se utilizaron para cuatro reacciones PAMP cada uno por el emparejamiento de todos los posibles avance y retroceso grupos de cebadores utilizando Detroit 562 (mutante) y HEK293 (control) como plantillas. El procedimiento se ha descrito brevemente en la Figura 3. Los productos se etiquetan y se utilizan para la gama de hibridación: F
A-R
Y para matriz 25; F
A-R
Z para la matriz 26; F
BR
Y de matriz 27 y F
AR
Z para la matriz 28. Las alícuotas de las muestras individuales PAMP también fueron agrupados juntos y etiquetado para la gama de hibridación (serie 29, se muestra su imagen matriz en la Figura 3B). Los resultados se presentan con una intensidad de señal ratio (eje Y) de muestras de Detroit 562 (mutante) y HEK293 (control) contra la ubicación de la sonda (eje X). Los puntos de corte pueden ser identificados a través de esta trama mediante la búsqueda de los dos picos que son análogos a los puntos verdes brillantes en la figura 3B.
Con el fin de determinar con mayor precisión el área de deleción, PCR anidada con los pares de primers específicos se diseñó de acuerdo con los resultados anteriores PAMP. El producto de PCR se marcó para la gama de hibridación, produciendo un resultado muy similar a la mostrada en la Figura 4 y se muestra en la Figura 5A. Además, el producto principal única de las reacciones de PCR se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa, extirpó, se extrajo y se secuencia (Figura 5B). El punto de interrupción clonado está de acuerdo con otros dos informes (Figura 5B) [37], [38].
Para asignar el punto de corte exacto, un conjunto anidado de cebadores de PCR se diseñaron para uniplex PCR basado en el anterior PAMP resultados (Figuras 3 y 4). Los productos de PCR se utilizaron para el etiquetado y se hibridaron en la matriz y también para la electroforesis en gel de agarosa. La matriz de datos se muestra como la misma parcela en la Figura 4. Una banda principal única en el gel de agarosa se escindió y se purificó para la secuenciación (B). El punto de interrupción se indica (de#21975226#21960809 de acuerdo con la secuencia del genoma humano NCBI Build 36).
Para imitar la población heterogénea de células cancerosas y de destino se encuentran típicamente en los tumores sólidos, diversas cantidades de genómica ADN derivado de Detroit 562 (mutante) y HEK293 (tipo salvaje) se mezclaron para PAMP y la gama de hibridación. Con el fin de probar la sensibilidad de nuestro enfoque, se realizó un experimento de valoración. El ADN genómico total para cada ensayo se mantuvo constante (100 ng). Esto es equivalente a aproximadamente 28.000 copias de genoma haploide (basado en la estimación de 2,8 × 10
5 moléculas /g de genoma haploide). El
CDKN2A
suprime la línea celular 562 Detroit se diluyó en serie con
CDKN2A
tipo salvaje HEK293 como se muestra en la Tabla 1. El ensayo fue capaz de detectar aproximadamente 1 secuencia de punto de interrupción en la presencia de un aproximado 2.000 veces en exceso de genoma de tipo salvaje con la sensibilidad de 5-16 tales moléculas (Tabla 1). Por lo tanto, el enfoque PAMP proporciona un método para la detección de deleciones de ADN genómico en presencia de ADN de tipo salvaje más del 99,9%.
La estrategia de clonación punto de interrupción PAMP se confirmó en otra línea celular. Debido a que nuestro array sólo abarca 25 kb del genoma, escaneamos nuestra información de asignación anterior en 100 líneas celulares de encontrar uno que podría tener puntos de ruptura dentro de esta región [3], [33]. La línea celular de cáncer de mama Hs578T tiene una deleción en p16
exones Ink4a 1-3. Con cebadores dentro y telomérica (F
A y R
X grupos, Tabla 2) al fragmento genómico, se realizó PAMP y la gama de hibridación, y se identificaron un solo punto en la matriz (que se muestra como un solo pico en la figura 6A). La secuencia de esta sonda se encuentra 69.971 a 71.219 en la secuencia de BAC RP11-149I2 (GenBank adhesión AL449423). Por lo tanto, el fin centromérica del punto de interrupción debe estar situado cerca de esta región. Uniplex PCR con cebadores a partir de los dos grupos para PAMP se realizó para la secuenciación. Un producto de PCR de 2 kb se generó con un par de cebadores y se sometió a secuenciación directa (Figura 6B). El extremo centromérica del punto de interrupción identificado por PAMP es coherente con un informe anterior [37]. El extremo telomérico del punto de interrupción se infiere de los cebadores utilizados para PAMP y también confirmados por secuenciación directa, aunque no había sonda genómica cerca del punto de interrupción que se incluyó en la matriz
dos grupos de cebadores:. F
a (F
A1-F
A4) y R
X (R
X1-R
X5) se utilizaron para PAMP basado en nuestra cartografía anterior. El producto fue etiquetado para la gama de hibridación (A). Sólo único pico es evidente a partir de la trama. Se indica la ubicación de la otra punto de interrupción no está cubierto por esta matriz minigenomic. Dos cebadores (R
X3 y R
X4) situado cerca de la localización genómica de la sonda (cromosoma humano 9, desde 21969229 hasta 21.970.477, NCBI construir 36) que se ha hibridado y dos cebadores (F
A1 y F
A2) situado fuera de la cobertura matriz se eligieron para la PCR uniplex. El F
A2-R
se espera par X3 tener la distancia más corta cuando se produce una eliminación. Una banda de aproximadamente 2 kb en gel de agarosa se escindió del gel, se purificó y se secuenció (B). El punto de ruptura y la ubicación está indicado (de#21955827#21968338 de acuerdo con la secuencia del genoma humano NCBI Build 36).
Discusión
Hemos desarrollado una estrategia general que puede aplicarse para la localización de los puntos de corte genómicos en los cánceres primarios sin purificar. El protocolo de amplificación y los azulejos aquí descrito permite
CDKN2A
clonación punto de interrupción simple y precisa, utilizando ADN contaminado como una plantilla. En contraste con las técnicas actuales disponibles para la supresión de cartografía (incluyendo la transferencia de Southern, fluorescente
In situ
hibridación, PCR en tiempo real, y CGH array) que se basan en la ausencia de una señal detectable de tipo salvaje, PAMP mide directamente la ADN eliminado. Por lo tanto, este enfoque es mucho menos vulnerables a los problemas asociados con la contaminación celular normal. El procedimiento experimental es lo suficientemente robusta para detectar supresiones en presencia de tipo salvaje contaminación secuencia de al menos 99,9%, lo que no podría lograrse por otros procedimientos [3], [5], [26], [27], [28], [33], [35], [39].
Primer aproximación selección por PCR ha sido una herramienta útil para aislar mutantes de deleción en
C. elegans
[36]. El método se basa en la identificación de una banda única que es el producto de una reacción de PCR con éxito cuando un par de cebadores específicos se reunió por deleción, en un gel de agarosa. El procedimiento sólo puede identificar deleciones que ocurren en un pequeño fragmento genómico (3 kb) de una manera relativamente bajo rendimiento. También sufre de relativamente alta tasa de falsos positivos debido a la identidad de las bandas en el gel de agarosa es difícil saber. Sin embargo, mediante la aplicación de PCR multiplex junto con un suelo de baldosas gama genómico, se puede detectar simultáneamente una amplia gama de regiones genómicas [40]. Además, la amplificación preferencial de las secuencias cerca de los puntos de interrupción genera una lectura relativamente sencillo en el suelo de baldosas serie. La relación señal a ruido en los puntos hibridados es evidente en comparación con la lectura de la matriz CGH (véase la Figura 4). La unión se puede identificar fácilmente el tiempo que un extremo de la localización genómica en las inmediaciones de los puntos de corte está cubierta por la matriz de suelo de baldosas, como se muestra en el caso de células de cáncer de mama Hs578T (Figura 6). Dado de alta densidad de suelo de baldosas arrays genómicos están disponibles comercialmente, este enfoque puede ser fácilmente adoptada. Además, de alto rendimiento de la tecnología de secuenciación del genoma también puede determinar la secuencia exacta punto de interrupción después de PAMP, evitando la necesidad de la gama de hibridación [41], [42], [43].
Se utilizó PCR múltiple para reducir la la carga de trabajo y el coste de PAMP. Hemos sido capaces de multiplexar 28 cebadores fácilmente en una sola reacción de PCR. Teóricamente, se puede cubrir más del 90% de los 0,5 Mb de fragmento genómico de alrededor de
CDKN2A
locus con un total de 500 cebadores en una reacción PCR sola a través de la simulación computacional, que se describirán en otro lugar (manuscrito presentado). Un artículo reciente informó de una PCR múltiple que dispone de más de 1000 pares de iniciadores a través de la ayuda de diseño computacional [44]. El enfoque PAMP se dirige a los tamaños de deleción entre 10 kb y 1 Mb. Las supresiones pequeñas o más grandes pueden ser detectados por resecuenciación y FISH respectivamente.
Al igual que otras tecnologías de PCR, PAMP se puede adoptar fácilmente a un sistema robótico para fines clínicos y de investigación. Un ejemplo de una posible aplicación clínica es utilizar la secuencia de punto de interrupción única como un biomarcador específico del cáncer personalizado para seguimiento de la enfermedad después del tratamiento, cuando el punto de interrupción preciso ha sido asignada. Por ejemplo, a diferencia de muchos marcadores tumorales actuales, tales como CA19-9, CA125 y PSA, que no son verdaderamente específica del cáncer, la
CDKN2A
puntos de interrupción son específicos y únicos para cada cáncer con este locus eliminado. Un ensayo altamente sensible, tal como PCR en tiempo real, puede ser diseñado para supervisar el estado de la progresión del cáncer en la sangre u otros fluidos corporales. El ensayo debe ser muy específico ya que se espera que se produzca la amplificación sólo de ADN que contiene deleción-debido a la muy larga distancia entre los cebadores en el genoma de tipo salvaje (véase la Figura 2). Esto es análogo a la detección de una secuencia de virus exterior, que se ha aplicado como un biomarcador útil para Epstein-Barr virus asociado carcinoma nasofaríngeo [45], [46].
Nuestro enfoque puede también aliviar en mano de obra tradicional experimentos intensivos que tienen como objetivo comprender cómo los puntos de interrupción genómico se generan durante el desarrollo del cáncer, sobre todo en los tumores primarios. Aunque V ilegítima (D) J recombinación puede ser responsable de la creación de
CDKN2A
deleciones en la leucemia linfoblástica aguda, se necesitarán más datos de la secuencia de punto de interrupción para otros tipos de cánceres para delinear los mecanismos moleculares [37], [38] , [47], [48]. Además, la técnica descrita en este documento puede ser utilizado no sólo para el mapeo de eliminación, sino que también se puede aplicar para mapear otros tipos de reordenación genómica, tales como translocaciones e inversiones. Al igual que en el caso de supresión genómico (véase la Figura 2), sólo "aproximadas" cebadores pueden generar amplicones cuando esos cebadores están cerca de los fragmentos genómicos que se vuelven a colocar en las translocaciones e inversiones.
Uso de secuencias de punto de interrupción como el cáncer-específica biomarcadores para monitorear enfermedades residuales mínimas se ha explorado [49], [50], [51], [52], [53]. seguimiento de la enfermedad sobre la base de punto de ruptura de ADN genómico personalizado se considera que es enfoque muy atractivo por varias razones [49]. En primer lugar, muchos reordenamientos de ADN genómico están directamente relacionados con el proceso oncogénico, por lo tanto, son realmente cáncer-específica y estable en el tiempo. Esto es en contraste a ensayo basado Ig /TCR reordenamiento más conveniente. De hecho, encontramos exactamente el mismo
CDKN2A
puntos de corte de las dos líneas celulares utilizadas en este estudio como informó por otros. En segundo lugar, el ADN es más estable que el ARN aunque es más fácil para mapear transcrito de fusión si es que existe, como
BCR-ABL
. En tercer lugar, los puntos de corte genómicos son muy probable que sea diferente de cada paciente y ser biomarcadores personalizado, de ese modo, reduciendo el riesgo de resultados falsos positivos debido a la contaminación cruzada. Sin embargo, este es también el mayor obstáculo a superar. Por ejemplo, muchos esfuerzos para mejorar el rango de amplificación por PCR para detectar translocaciones
C-MYC
/inmunoglobulina han tenido un éxito limitado debido a que los puntos de ruptura están dispersos en una región más de 300 kb [54], [55], [ ,,,0],56]. Nuestra estrategia puede ser útil para dicha aplicación.
Nuestro enfoque tiene como objetivo identificar los puntos de ruptura dentro de un 1 Mb fragmento genómico como FISH u otras técnicas citogenéticas están disponibles para grandes reordenamientos genómicos y el costo de la mano de obra y aumentar significativamente cuando la región de destino expande. Somos capaces de producir económicamente un suelo de baldosas gama que cubre un fragmento genómico de 0,5 Mb en todo el
CDKN2A
con una resolución de 1 kb. Actualmente estamos trabajando en métodos para aumentar la multiplexación y reducir el volumen de cada reacción PAMP para aplicaciones más amplias.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y preparación de la muestra
Las líneas celulares descrito en el documento se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron como se recomienda. El ADN genómico se extrajo con DNAzol (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Minigenomic suelo de baldosas gama
Hemos creado un
INK4A
suelo de baldosas gama minigenomic cubriendo un fragmento de 25 kb en el
CDKN2A locus
para demostrar el concepto de nuestro enfoque. Las sondas de ADN se generaron por PCR con RP11-149I2 clon BAC (obtenido de Centro de Recursos BACPAC en el Hospital de los Niños Instituto de Investigación de Oakland, Oakland, CA) como molde y evitar las secuencias genómicas repetitivas que se predijeron por RepeatMasker. Los productos de PCR se purificaron con el ADN de limpieza y Concentrador-5 (Zymo Research, Orange, CA), se resuspendieron en 3 x SSC y se imprime en portaobjetos de poli-L-lisina en 0,1 mg /ml, junto con Human Cot-1 DNA ( Invitrogen, Carlsbad, CA), que está enriquecida para secuencias repetitivas, y DNA de esperma de arenque (Promega, Madison, WI), que se utilizó como control no específico. El procedimiento de impresión se ha descrito y esencialmente seguido el manual del arrayer DeRisi con pasadores de impresión por microcontacto de silicio (Parallel tecnologías de síntesis, Inc. Santa Clara, CA) [57], [58]. Las matrices fueron post-procesados con el método a base de anhídrido succínico para bloquear antes de la hibridación como se describe anteriormente [57]. Los protocolos relacionados con la impresión de matriz y la hibridación en este documento se pueden encontrar generalmente en microarrays.org (http://derisilab.ucsf.edu/microarray/protocols.html).
Primer-aproximación multiplex PCR (PAMP ) y la gama de hibridación
Un esquema simplificado PAMP se muestra en la Figura 2. Una serie de cebadores (Tabla 2) hacia
INK4A
exones 1-2 a lo largo del
CDKN2A locus
fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Grupos de cebadores directo e inverso (250 nM cada uno en la reacción final) se utilizaron para generar los amplificados a partir de 0,1 g de moldes de ADN genómico en un total de 10 l de solución de mezcla con 10 l de Taq 2 × Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA). La reacción se montó a 4 ° C en una estación de trabajo PCR y se transfiere a un termociclador con el bloque precalentado a 94 ° C. Las condiciones de ciclación fueron un paso de desnaturalización de 3 minutos a 94 ° C seguido de 35 ciclos a 92 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 2,5 minutos con un paso de extensión final a 68 ° C durante 5 minutos. Una l de producto sin purificar se utilizó posteriormente como plantillas para otra ronda de amplificación para etiquetar los amplicones con el mismo protocolo de la PCR excepto que dTTP fue reemplazado por una mezcla 04:01 de aminoallyl dUTP (Ambion, Austin, TX) y dTTP para la sonda de etiquetado . Los amplicones marcados se purificaron con el ADN de limpieza y concentrador-5 columnas, se eluyó en 9 l de bicarbonato de sodio (pH 9,0) y, junto con 1 l de DMSO disueltos ésteres Cy3 o Cy5 NHS (GE Healthcare, Piscataway, NJ) para 30 a 60 minutos. El Cy3 y Cy5 etiquetados amplicones fueron purificados con DNA Clean-up y concentrador-5 columnas y se eluyó con 10 l de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Junto Cy3 y Cy5 etiquetados amplicones se combinaron con 3,6 l de 20 x SSC, 0,5 l de Hepes (pH 7,0) y finalmente 0,5 l de 10% SDS. La solución mezclada se calentó durante 2 minutos a 95 ° C, se enfrió a temperatura ambiente y se hibridó con los arrays suelo de baldosas minigenomic a 63 ° C durante la noche, esencialmente como se describe anteriormente [57], [58]. Las matrices hibridadas se lavaron y se escanearon con un escáner GenePix 4000B (Molecular Device, Sunnyvale, CA) y se analizaron mediante el software GenePix Pro 6.0.
Revestimientos análisis de datos de la matriz
El humano Cot-1 DNA y ADN de esperma de arenque fueron diseñados para ser controles positivos y negativos, respectivamente, y manchado varias veces en la matriz (véase la figura 3). Para normalizar la variación día a día y la muestra-a muestra, la intensidad media de todas las características que representan ADN de esperma de arenque (
I
50% -HS
) se utiliza para dividir la intensidad (
I
G
) de cada característica que representa las sondas genómicas. Cada (
I
G
): (
I
50% -HS
) relación, la señal de la sonda genómica normalizado, se representó en el eje Y frente a la sonda correspondiente de localización genómica en el eje X para facilitar la interpretación de los datos (ver Figura 4).
CDKN2A
clonación punto de interrupción
para confirmar
CDKN2A
mapeo breakpoint PAMP enfoque, los fragmentos genómicos que flanquean los puntos de interrupción se clonaron por PCR enfoques tradicionales guiado por los resultados de PAMP. Dos ejemplos se dan en este documento
Detroit 562 línea celular
:. Se utilizó el enfoque anidado para clonar el
CDKN2A
punto de interrupción en Detroit 562 células de carcinoma epitelial humano. Los cebadores fueron diseñados con pistas del experimento PAMP (ver las figuras 3 y 4). cebadores externos (AGGTTTGGTTAAGAGTCGTTC y AAGATCTATATGGTGGCCTTTAG) se utilizaron para 35 ciclos de PCR (92 ° C, 30 segundos; 55 ° C, 30 segundos; 68 ° C, 2 minutos).